| Результаты этапа: Функциональные фенотипы, которые клетки могут приобретать в зависимости от окружающей микросреды, в настоящее время находятся в центре исследований новых противовоспалительных терапевтических подходов. Глиальные клетки, микроглия и астроциты являются основными участниками нейровоспаления, но их роли различны, поскольку микроглия - это клетки мезодермального происхождения, а астроциты - клетки эктодермального происхождения. Воспалительный фенотип клеток может модулироваться оксилипинами, происходящими из ω-6- и ω-3-полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), хотя данных об изменениях профилей оксилипина в различных клеточных адаптациях к про- и противовоспалительным стимулам недостаточно. Данное исследование направлено на сравнение профилей оксилипина, измеренных UPLC-MS/MS, в различных состояниях поляризации астроцитов крысы. Использовали клетки, обработанные в течение 24 часов липополисахаридом (LPS) для классической провоспалительной поляризации и интерлейкинами 4 (IL-4) или 10 (IL-10) для альтернативной противовоспалительной поляризации, с результирующими фенотипами, которые характеризуются с помощью метода количественного ПЦР в реальном времени (RT-PCR) и выброса цитокинов на уровне белка. Также использовали длительную обработку низкой концентрацией ЛПС (обработка эндотоксином, ЭТ-обработка) как модель “эндотоксиновой адаптации” клеток. Функциональный ответ астроцитов оценивали по острой (4 ч) ЛПС-индуцированной клеточной реактивности, измеренной по маркерам экспрессии генов и синтезу оксилипина. Обнаружено, что наряду с генными маркерами оксилипиновые профили могут служить маркерами про- (A1-подобной) или противовоспалительной (A2-подобной) поляризации. Для классической (LPS) провоспалительной поляризации наблюдали преимущественное участие ω-6 ПНЖК и активации их циклооксигеназного пути метаболизма. Для альтернативной (IL-4) противовоспалительной поляризации. - ω-3 ПНЖК и липоксигеназного пути метаболизма. Обработки IL-4, но не IL-10, стимулирует способность астроцитов активировать пути передачи сигналов врожденного иммунитета в ответ на LPS. Обработанные эндотоксином астроциты обеспечивают альтернативную противовоспалительную поляризацию, которая делает клетки менее чувствительными к острой стимуляции LPS, чем поляризация, вызванная IL-4. Показано, что различные профили оксилипинов ассоциируются с различными состояниями поляризации, характеризуя провоспалительный или противовоспалительный фенотип. Эта ассоциация проявляется как в нативных клетках, так и в их ответах на провоспалительный стимул. Значительная часть работ первого года была посвящена подбору праймеров для детекции генов поляризации, а также анализу оксилипинов и составления оксилипиновых профилей.
Таким образом, решена задача 1 данного проекта, т.е. получены характеристики поляризации астроцитов в разных режимах стимуляции. Показано, что длительная стимуляция астроцитов цитокинами и эндотоксином приводит к их поляризации, которая может быть измерена маркерами экспрессии генов или оксилипинами. ЭТ-обработка может быть добавлена в список стимулов, способных вызывать А2-подобные реакции астроцитов. Обработка IL-4, но не IL-10, стимулирует способность астроцитов активировать сигнальные пути врожденного иммунитета в ответ на LPS, тогда как обработка ЭT делает клетки менее чувствительными к стимуляции. Обнаружение того, что профили оксилипина, связанные с различными состояниями поляризации, позволяют разделить фенотипы на про- или противовоспалительные, открывает возможность манипулировать реакциями поляризованных клеток на активацию врожденного иммунитета с использованием низкомолекулярных ингибиторов модуляторов синтеза оксилипина. |
