ИСТИНА

Ключевыми участниками обновления и регенерации большинства органов и тканей являются постнатальные стволовые и прогениторные клетки. Истощение пула стволовых клеток, снижение их функциональной активности и патологическое изменение их микроокружения приводит к нарушению регенеративных процессов и в результате к утрате функции органа. Это определяет необходимость фундаментальных исследований, направленных на изучение механизмов регуляции поведения постнатальных стволовых и прогениторных клеток для управления регенеративными процессами в тканях. В регенеративной медицине одними из наиболее изученных и перспективных для клинического применения клеток являются мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК), в связи с относительной простотой и эффективностью выделения и культивирования, низкой иммуногенностью, а также доказанной способностью стимулировать регенерацию тканей и регулировать функции тканеспецифичных резидентных стволовых клеток. Несмотря на то, что данный тип клеток уже применяется в клинической практике, механизмы их участия в регуляции пула стволовых и прогениторных клеток остаются не до конца изученными. На настоящий момент известно, что выделяемые из разных тканей в культуру МСК представляют собой гетерогенную популяцию клеток, включающую небольшое количество (по некоторым данным, менее 1%) стволовых и прогениторных клеток, которые могут дифференцироваться в адипогенном, остеогенном, хондрогенном, а также в некоторых других направлениях. При этом накопленные данные демонстрируют, что многие ключевые функции МСК реализуются посредством секреции биоактивных паракринных факторов, внеклеточных везикул и компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ). Это может быть обусловлено наличием других подтипов клеток в гетерогенной популяции МСК, которые обладают преимущественно регуляторной функцией, реализуемой за счет действия их секретома. Во взрослом организме МСК являются неотъемлемой частью специфического микроокружения, или ниши стволовой клетки. Известно, что МСК, выделяя паракринные факторы, могут регулировать такие процессы поведения клеток как пролиферация, миграция и дифференцировка, что может вносить огромный вклад в поддержание количества и функциональности стволовых клеток. По нашим данным и данным других исследователей, наиболее представленной в секретоме МСК группой факторов являются компоненты ВКМ. В то же время практически нет исследований, раскрывающих механизмы влияния именно ВКМ, наработанного МСК, на поддержание и дифференцировку стволовых клеток, что определяет высокую актуальность предлагаемого проекта. В нашей работе мы планируем на модели децеллюляризованного клеточного пласта из МСК человека выявить влияние близкого к нативному ВКМ на процессы дифференцировки мезенхимных стволовых клеток, содержащихся в популяции МСК, и установить ключевые механизмы этого процесса. Полученные данные позволят значительно расширить наше понимание роли ВКМ, синтезируемого МСК как ключевыми для поддержания регенеративных процессов в тканях клетками, в регуляции дифференцировки стволовых клеток. Результаты проекта могут стать основой для разработки новых подходов для регенеративной медицины с использованием нативного ВКМ, продуцируемого МСК, с целью создания или функционализации тканеинженерных конструкций.

Abstract: Adult stem cells and progenitor cells are key participants in the renewal or regeneration of most organs and tissues. Deficiency of stem cell number, decrease of their functional activity and pathological changes in their microenvironment lead to disruption of regenerative processes, and as a result to loss of organ function. This determines the need for fundamental research aimed to study the mechanisms of regulation of stem cell and progenitor cell behavior and to find the approaches to control regenerative processes in tissues. In regenerative medicine, mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are the most studied and promising for clinical use cells, due to relative simplicity and efficiency of isolation and cultivation, low immunogenicity as well as the ability to stimulate tissue regeneration and regulate tissue-spesific resident stem cell functions. Despite the fact that this type of cells is already used in clinical practice, the mechanisms of their participation in the regulation of the pool of stem and progenitor cells remain not fully understood. It is currently known, that MSC represent a heterogeneous cell population that includes small subpopulation of stem cells and progenitor cells (according to some data less than 1%) that able to differentiate in the adipogenic, osteogenic, chondrogenic and some other directions. At the same time, the accumulated data demonstrate that many key functions of MSC are realized through the secretion of bioactive paracrine factors, extracellular vesicles and extracellular matrix (ECM) components. It could be due to the presence of other cell subtypes in the heterogeneous population of MSC, which have regulatory functions mediated by the actions of their secretome. In adult tissues MSC are an integral part of a specific microenvironment, or niche of the stem cell. It is known that MSC, releasing paracrine factors, can regulate such processes of cell behavior as proliferation, migration and differentiation, which can make a huge contribution to maintaining the number and functionality of stem cells. According to our and others data ECM components are the most representative in MSC secretome. At the same time, there are practically no studies that reveal the mechanisms of namely ECM, producing by MSC, participate in the regulation of the maintenance and differentiation of stem cells, which determines the high significance of the proposed project. In our work, we plan to reveal the effect of close to native ECM on the processes of differentiation of mesenchymal stem cells on the model of decellularized cell layer from human MSC and to establish the key mechanisms of this process. The data obtained will significantly expand our understanding of the role of ECM, synthesized by MSC as key for the maintenance of regenerative processes in tissues by cells, in the regulation of stem cell differentiation. The results of the project can be the basis for the development of new approaches for regenerative medicine using native ECM produced by MSC, in order to create or functionalize tissue engineering structures.

1) Будут проанализированы состав и структура ВКМ, продуцируемого МСК, до и после децеллюляризации. Согласно нашим предварительным данным разработанный протокол децеллюляризации не приводит к денатурации белков и нарушению компартментализации основных структурных компонентов ВКМ (коллагенов, фибронектина). С помощью спектра разных методов этот вопрос будет подробно исследован. Кроме того, будет проверено, остаются ли после децеллюляризации в дВКМ внутриклеточные компоненты, а также депонированные в матриксе растворимые факторы. 2) Будет оценен вклад влияния ВКМ, продуцируемого МСК, на регуляцию спонтанной и индуцированной дифференцировки мезенхимных стволовых клеток, содержащихся в популяции МСК, в динамике. По нашим предварительным данным культивирование МСК на дВКМ способствует стимуляции дифференцировки в случае индукции адипогенной или остеогенной дифференцировки, в сравнении с пластиком. Выявленное влияние дВКМ будет подтверждено в сравнении с разными типами подложек для адипогенного, остеогенного и хондрогенного направлений дифференцировки МСК и оценена динамика этих процессов. Будут проанализированы отличия в экспрессии маркеров дифференцировки и плюрипотентности на разных сроках культивирования клеток в присутствии стандартных и индукционных культуральных сред. Полученные данные об уровне экспрессии таких маркеров в случае спонтанной дифференцировки позволят проверить предположение о поддержании стволовости первично выделенных клеток при культивировании на дВКМ. 3) Будут получены данные об изменении профиля экспрессии интегринов при культивировании клеток на дВКМ, продуцируемым МСК, и выявлены потенциальные участники передачи сигналов от дВКМ клеткам при регуляции дифференцировки. 4) Результаты оценки активности ключевых участников различных внутриклеточных сигнальных путей, опосредующих влияние ВКМ на дифференцировку стволовых клеток, в частности, по уровню фосфорилирования ранних участников интегринового сигналинга, степени внутриклеточного перераспределения из цитоплазматического пространства в ядро транскрипционных факторов, позволят предположить возможные механизмы регуляции ВКМ, продуцируемым МСК, дифференцировки клеток. 5) Будет проведена проверка вклада интегринов в наблюдаемые процессы путем блокированием сигналинга с использованием разобщающих пептидов и специфических блокирующих антител.

Таким образом, в результате выполнения проекта будет установлено влияние ВКМ, продуцируемого МСК человека, на поддержание фенотипа и дифференцировочный потенциал стволовых клеток, содержащихся в гетерогенной популяции МСК, и раскрыты возможные механизмы такого воздействия.