ИСТИНА

Шаперонины, как известно, обеспечивают правильное сворачивание (фолдинг) белков как in vivo, так и in vitro, и найдены в прокариотах, эукариотах и археях. Предлагаемый проект посвящен изучению обнаруженной нами новой группы шаперонинов – шаперонинов, кодируемых вирусами бактерий (бактериофагов). Мы получим и охарактеризуем новый GroEL-подобный белок бактериофага AR9 и проведем сравнительный анализ его свойств с ранее охарактеризованными нами шаперонинами фагов EL и ОВР, а также с другими известными шаперонинами I и II групп.

Chaperonins are known to provide the proper folding of proteins both in vivo and in vitro and to be found in prokaryotes, eukaryotes and archaea. The project is devoted to studying of the new group of chaperonons, found by us, namely chaperonins encoded by viruses of bacteria (bacteriophages). We are going to produce and characterized the new GroEL-like protein of bacteriophage AR9. We will carry out the comparative analysis of its properties with phage EL and OBP chaperonins, earlier characterized by us, and also with other known group I and group II chaperonins.

В результате проведенного исследования будет получен и охарактеризован еще один потенциальный шаперонин – GroEL-подобный белок (пг228) фага AR9. Будет проведен сравнительный анализ его структуры и свойств с ранее изученными нами шаперонинами фагов EL и ОВР, а также с другими известными на сегодняшний день шаперонинами I и II групп. Будет изучено влияние рекомбинантного белка на термическую инактивацию и агрегацию его потенциальных белков-субстратов – фаговых эндолизинов – в присутствии и в отсутствие АТФ. Будет установлено, обладает ли пг228 шаперонными свойствами и АТФазной активностью.На основе изображений, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии, будет проведена трехмерная реконструкция шаперонина ОВР в открытой и закрытой конформациях. Впервые будут получены модели однокольцевого шаперонина в конформациях, соответствующих разным стадиям его АТФазного цикла.

Продолжен поиск условий для получения стабильных кристаллов шаперонинов EL и ОВР с упорядоченной структурой. Изучено влияние ряда реагентов, используемых в качестве криопротектирующих добавок, на кристаллизацию белков. Сокристаллизация белка с ксилитолом и сахарозой позволила получить кристаллы шаперонина ОВР. Однако, при тестировании этих кристаллов на сихротроне BESSY II (Берлин, Германия) было установлено, что они способны отражать рентгеновские лучи с низким разрешением (около 6 Å). Опробован метод сшивания кристаллов глутаровым альдегидом. Продолжена отработка методик кристаллизации шаперонинов в условиях кубической и губчатой фазы.

С помощью различных физико-химических методов продолжено изучение нового однокольцевого шаперонина бациллярного фага AR9. На основе изображений, полученных с помощью электронной микроскопии (негативное контрастирование) реконструирована его апо-форма с разрешением 11,3 Å. Методом изотермической титрационной калориметрии изучено взаимодействие шаперонина AR9 с разными нуклеотидами. Проведено сравнение АТФазной активности двухкольцевого шаперонина EL и однокольцевых шаперонинов OBP и AR9. Изучена их антиагрегационная активность по отношению к ряду субстратов, различающихся по молекулярной массе. На основе обработки криоэлектронных изображений дополнительного количества частиц улучшено разрешение ранее полученной модели шаперонина ОВР в апо-форме с 7,3 до 4, 3 Å. По данным криоэлектронной микроскопии реконструирована модель шаперонина ОВР в АТФ-связанном состоянии с разрешением 3,5 Å. В полученные карты электронной плотности была встроена гомологичная модель gp246, созданная на основе кристаллической структуры GroEL. Проведено сравнение полученных структур с моделями комплексов шаперонина с АДФ и АТФγS.