|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Поиск наиболее перспективных аналогов проникающего катиона трифенилфосфония на модельных и биологических липидных мембранахНИР
Searching for the most promising analogues of the penetrating triphenylphosphonium cation on model and biological lipid membranes
- Руководитель НИР: Рокицкая Т.И.
- Ответственные исполнители: Коршунова Г.А., Попова Л.Б., Хайлова Л.С.
- Участники НИР: Александрова Е.В., Пыркова Е.Ю.
- Подразделение: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского
- Срок исполнения: 1 января 2019 г. - 31 декабря 2021 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 19-04-00238\19
- Номер ЦИТИС: АААА-А19-119091290035-8
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Структура и функция биологических мембран. Биоэнергетика. Фотосинтез.
- ПН России: Индустрия наносистем
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биомедицинские и ветеринарные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.15.33 Электрохимия
- 34.17.27 Искусственные и биологические мембраны
-
Ключевые слова:
проницаемость, липосомы, дипольный потенциал липидной мембраны, протонофоры, митохондриально-направленные соединения, измерение электрического тока, бислойные липидные мембраны, проникающие ионы
measurement of the electric current, mitochondrial-targeted compounds, penetrating ions, liposomes, bilayer lipid membranes, dipole potential of a lipid membrane, permeability, protonophores -
Описание:
В последние годы катионы с делокализованным зарядом активно используются при создании новых конъюгатов для адресной доставки антиоксидантов, фотосенсибилизаторов, разобщителей, прооксидантов и других соединений в митохондрии. Во многих случаях терапевтическое действие таких конъюгатов существенно повышается, благодаря увеличению их диффузии через липидные мембраны. Литературные данные, а также ранее полученные в нашей лаборатории результаты позволяют предполагать, что присутствие галоидных или метильных заместителей в фенильном кольце трифенилфосфониевого катиона может ускорить проникновение таких гидрофобных катионов через липидные мембраны и тем самым улучшить их действие в тех биологических системах, где проникновение является лимитирующей стадией. Изучение зависимости скорости трансмембранного проникновения гидрофобного катиона от степени модификации молекулы может пролить свет на понимание механизмов проницаемости таких соединений через липидные мембраны. В то же время, исследование действия синтезированных аналогов додецилтрифенилфосфония на митохондрии печени крысы позволит выявить наиболее перспективные аналоги для создания митохондриально-направленных конъюгатов.
-
Abstract:
In recent years cations with delocalized charge are actively used in the development of new conjugates for targeted delivery of antioxidants, photosensitizers, uncouplers, prooxidants and other compounds in the mitochondria. In many cases, the therapeutic effect of such conjugates is substantially increased, due to an increase in their diffusion through lipid membranes. The literature data, as well as the results obtained in our laboratory, suggest that the presence of halogen or methyl substituents in the phenyl ring of triphenylphosphonium cation can accelerate the penetration of such hydrophobic cations through the lipid membranes and thereby improve their action in those biological systems where penetration is a limiting step . A study of the dependence of the transmembrane penetration rate of a hydrophobic cation on the degree of modification of a molecule can shed light on the understanding of the permeability mechanisms of such compounds through lipid membranes. At the same time, the study of the effect of synthesized analogues of dodecyltriphenylphosphonium on mitochondria of rat liver will reveal the most promising analogues for the creation of mitochondrial-directed conjugates.
-
Планируемые результаты:
1. Сравнить действие, оказываемое метилированными аналогами додецилтрифенилфосфония, на скорость дыхания и потенциал внутренней мембраны выделенных митохондрий печени крысы. Определить наиболее активный липофильный катион на митохондриях. 2. Сравнить протонофорное действие аналогов додецилтрифенилфосфония в комплексе с жирной кислотой на БЛМ, сформированной из дифитанилфосфатидилхолина и пальмитата, по генерации разности потенциалов на градиенте протонов и по измерению стационарного тока в симметричных условиях. 3. Методом регистрации кинетик релаксации тока в ответ на прикладывание напряжения изучить рН-зависимость начального и стационарного токов, а также характерного времени релаксации в присутствии серии аналогов додецилтрифенилфосфония. Для этих измерений предполагается формировать плоскую бислойную липидную мембрану из смеси липида дифитанилфосфатидилхолина и пальматиновой кислоты. Предполагается, что совместное действие липофильного катиона и жирной кислоты будет напоминать действие типичного протонофора с рК равному рК жирной кислоты в липидном окружении. 4. Планируется изучить действие на проводимость бислойной липидной мембраны липофильного катиона, заряд которого не делокализован. Тригексилтетрадецил фосфоний будет изучен методом измерения разности потенциалов на градиенте концентрации катиона в условиях открытой цепи, измерения стационарного тока в симметричных условиях при фиксации напряжения и с помощью регистрации кинетик тока в ответ на прикладывание напряжения. 5. Далее планируем химический синтез более гидрофильных производных катиона трифенилфосфония, а именно, н-бутил трифенилфосфоний, н-бутил три(р-фторфенил)фосфоний и н-бутил три(р-хлорфенил)фосфоний и метилированных производных: н-бутил три(р-метоксифенил) фосфоний, н-бутил три(р-толил)фосфоний, н-бутил три(3,5-диметилфенил)фосфоний и н-бутил три(2,4,6-триметилфенил)фосфоний). 6. Накопление аналогов бутилтрифенилфосфония будет измерено на выделенных митохондриях с помощью ТФФ чувствительного электрода. Такие измерения позволят определить, меняется скорость накопления катионов в митохондриях или их концентрация при изменении проникающей способности катионов. 7. Так как аналоги додецилтрифенилфосфония очень гидрофобны и плохо десорбируются с поверхности мембраны, невозможно оценить полную проницаемость таких соединений из воды в воду. Планируется оценить проницаемость более гидрофильных катионов - аналогов бутилтрифенилфосфония - из воды в воду по результатам измерения стационарной проводимости БЛМ. На основании полученных результатов будет проведено сравнение скоростей трансмембранного проникновения аналогов додецилтрифенилфосфония и полной проницаемости аналогов бутилтрифенилфосфония. 8. Планируется измерение гидрофобности всех синтезированных соединений – аналогов бутилтрифенилфосфония, и сравнение logP с полной проницаемостью катионов через бислойные липидные мембраны. 9. Ранее было показано, что метилтрифенилфосфоний потенциал-независимым образом накапливается в везикулах из мембран электрического органа обыкновенного электрического ската. Такое накопление происходит благодаря связыванию метилтрифенилфосфония с катионным сайтом связывания в никотиновых ацетилхолиновых рецепторах (Lauffer and Hucho, PNAS 1982). Также известно, что тетрафенилфосфоний и метилтрифенилфосфоний ингибируют ГАМК-рецепторы (Schwartz, Biochemical Pharmacology 1988). Мы планируем изучить влияние аналогов бутилтрифенилфосфония на работу нервных клеткок улитки Lymnaea stagnalis.
-
Научный задел:
В нашей лаборатории удалось успешно применить разработанную ранее методику измерения релаксации тока через БЛМ в ответ на прикладывание скачка разности потенциалов в присутствии проникающих ионов. С помощью этого метода мы изучили проницаемость серии соединений, являющихся конъюгатами проникающих катионов и антиоксидантов (DOI: 10.1007/s00232-008-9124-6), в том числе и на фосфолипидах с простыми эфирными связями (DOI: 10.1134/S0006297912090118). Впервые были определены константы скорости трансмембранной диффузии для производных трифенилфосфония. Показано, что конъюгаты включающие родаминовую группировку (родамин 19 и Б), проникают через липидные мембраны быстрее аналогичных соединений с трифенилфосфонием. Мы изучили зависимость скорости трансмембранной диффузии гомологичного ряда алкилированных производных родамина Б (doi: 10.1016/j.bpj.2018.07.001). Оказалось, что константа скорости растет в несколько раз при возрастании длины алкила с этила до додецила, однако при дальнейшем увеличении длины алкильной цепи и гидрофобности соединения она практически не меняется. Поскольку структура проникающего катиона (родамин Б) одинакова для всех аналогов, мы предположили, что в зависимости от длины линкера может меняться положение сорбированной молекулы родамина Б на поверхности мембраны. А именно, ксантиновое кольцо родамина может сорбироваться параллельно поверхности мембраны в случае короткого линкера или перпендикулярно поверхности мембраны при длинном линкере. Перпендикулярное расположение ксантинового кольца, по всей видимости, предполагает уменьшение потенциального энергетического барьера для проникновения катиона родамина Б. Скорость трансмембранной диффузии существенно зависела и от используемого липида и уменьшалась в следующей последовательности: дифитанилфосфатидилхолин > диолеилфосфатидилхолин > дифитаноилфосфатидилходин > диерукоилфосфатидилхолин.
- Добавил в систему: Рокицкая Татьяна Ивановна
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Поиск наиболее перспективных аналогов проникающего катиона трифенилфосфония на модельных и биологических липидных мембранах |
| Результаты этапа: Для выполнения основной задачи проекта нами был синтезирован ряд производных додецилтрифенилфосфония (C12TPP, соединение 0): н-додецил три(р-хлорфенил)фосфоний (соединение 1), н-додецил три(р-фторфенил)фосфоний (соединение 2), н-додецил три(р-толил)фосфоний (соединение 3), н-додецил три(р-метоксифенил)фосфоний (соединение 4), н-додецил три(2,4,6-триметилфенил)фосфоний (соединение 5), н-додецил три(3,5-диметилфенил)фосфоний (соединение 6) и н-додецил тринафтилфосфоний (соединение 7). Все соединения имеют алкильный хвост, состоящий из 12 углеводородных звеньев, что позволяет им сорбироваться на поверхности липидной мембраны. С помощью метода измерения релаксации электрического тока БЛМ после прикладывания напряжения были определены константы скорости трансмембранной диффузии этих соединений. Оказалось, что введение одного метильного заместителя в пара положении фенильного кольца значительно ускоряет процесс флип-флопа проникающего катиона. Увеличение количества метильных групп привело к дальнейшему ускорению проникновения катиона. С другой стороны, галогенирование замедлило проникновение катиона через гидрофобный слой, что противоположно действию галогеновых заместителей в липофильных анионах. Полученные результаты нельзя объяснить изменением размера иона, что безусловно должно влиять на высоту энергетического барьера процесса перехода иона с одного на другой монослой липидной мембраны. Было обнаружено, что введение метильной группы в пара положении увеличивает константу скорости флип-флопа приблизительно в 30 раз, а введение метоксигруппы в этом же месте увеличивает лишь в 2.5 раза. Для изучаемых катионов был определен коэффициент распределения в октанол-воде методом, основанном на корреляции этой величины с временем удерживания соединения в обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Оказалось, что для некоторых аналогов увеличение гидрофобности коррелирует с увеличением константы скорости проникновения, однако полного соответствия не наблюдается. На выделенных митохондриях печени крысы мы сравнили действие C12TPP и его галогенированных аналогов C12TPP-F и C12TPP-Cl. Оказалось, что дыхание митохондрий, стимулированное в присутствии 50 мкМ ДНФ, не ингибируется при добавлении 20 мкМ C12TPP, C12TPP-Cl или C12TPP-F. Липофильные катионы C12TPP, C12TPP-Cl и C12TPP-F ускоряли дыхание митохондрий в присутствии сукцината и ротенона. Наиболее активным оказался C12TPP, что может быть связано с более быстрым его проникновением через липидные мембраны по сравнению с галогенированными аналогами. Интересно, что 2.5 мкМ всех изученных аналогов ускоряло дыхание митохондрий в присутствии жирной кислоты – олеата, который добавляли в диапазоне концентраций от 0 до 10 мкМ. При этом действие всех аналогов было практически одинаковым. Возможно, концентрации липофильных катионов были недостаточными. Скорость дыхания митохондрий измеряли полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка на полярографе в присутствии субстрата 5 мМ сукцината и 2 мкМ ротенона. При измерении потенциала на внутренней мембране митохондрий с помощью потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда сафранина О C12TPP также оказался более активным и приводил к уменьшению потенциала при более низких концентрациях чем галогенированные аналоги. Мы предполагаем, что это объясняется его лучшим накоплением в митохондриях или более быстрым действием. | ||
| 2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Поиск наиболее перспективных аналогов проникающего катиона трифенилфосфония на модельных и биологических липидных мембранах |
| Результаты этапа: Липофильные ионы широко применяются для определения мембранного потенциала клеток прокариот и эукариот, а также органелл эукариот in vitro. При этом предполагается, что идеальный липофильный ион должен проникать через липидную мембрану без помощи переносчиков и распределяться между двумя водными фазами, разделяемыми мембраной, согласно уравнению Нернста. Общепринятым является мнение, что органический ион с делокализованным или экранированным зарядом достаточно хорошо проникает через липидные мембраны. Для выяснения роли делокализации заряда липофильных ионов в эффективности их проникновения через липидные мембраны мы сравнили свойства алкилированных производных трифенилфосфония, трициклогексилфосфония и тригексилфосфония на природных и искусственных мембранах. Измерение накопления липофильных катионов в ответ на генерацию отрицательного потенциала внутри митохондрий с помощью ион-селективного электрода выявило одинаковую степень накопления бутилтрициклогексилфосфония и бутилтрифенилфосфония в митохондриях. Константы скорости проникновения липофильных катионов через бислойные липидные мембраны (БЛМ), оцененные с помощью метода измерения релаксации тока, незначительно увеличиваются в следующей последовательности: тригексилтетрадецилфосфоний < трифенилтетрадецилфосфоний < трициклогексилдодецилфосфоний. В соответствии с этими результатами измерения стационарной проводимости БЛМ показали, что проницаемость мембраны для бутилтрициклогексилфосфония в 2.5 раза больше чем для бутилтрифенилфосфония. Величины разности свободной энергии сольватации ионов в воде и октане, рассчитанные с помощью теории функционала плотности и модели поляризуемого континуума для растворителя, оказались очень близки для метилтрифенилфосфония, трициклогексилметилфосфония и тригексилметилфосфония. Наши результаты доказывают, что как циклические, так и ароматические фрагменты не являются необходимыми для эффективного проникновения липофильных ионов через липидные мембраны. | ||
| 3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Поиск наиболее перспективных аналогов проникающего катиона трифенилфосфония на модельных и биологических липидных мембранах |
| Результаты этапа: Липофильные катионы широко применяются для создания митохондриально-направленных соединений. Поскольку проникновение таких катионов через гидрофобный слой липидной мембраны зачастую является лимитирующей стадией процесса их накопления в клетках и митохондриях, мы синтезировали ряд аналогов додецилтрифенилфосфония (C12TPP-X) с различными заместителями в фенильном кольце для выявления наиболее проникающих аналогов. С помощью метода измерения релаксации электрического тока бислойной липидной мембраны (БЛМ) после прикладывания напряжения были определены константы скорости трансмембранной диффузии (флип-флопа) этих соединений. Оказалось, что введение одного метильного заместителя в пара положении фенильного кольца значительно ускоряет процесс флип-флопа проникающего катиона. Увеличение количества метильных групп привело к дальнейшему ускорению проникновения катиона. С другой стороны, галогенирование замедлило проникновение катиона через гидрофобный слой, что противоположно действию галогеновых заместителей в липофильных анионах. Полученные результаты нельзя объяснить изменением размера иона, что, безусловно, должно влиять на высоту энергетического барьера процесса перехода иона с одного на другой монослой липидной мембраны. Было обнаружено, что введение метильной группы в пара положении увеличивает константу скорости флип-флопа приблизительно в 30 раз, а введение метоксигруппы в этом же положении увеличивает константу лишь в 2.5 раза. Для изучаемых катионов был определен коэффициент распределения в октанол-воде методом, основанном на корреляции этой величины с временем удерживания соединения в обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Оказалось, что для некоторых аналогов увеличение гидрофобности коррелирует с увеличением константы скорости проникновения, однако полного соответствия не наблюдается. С помощью теории функционала плотности и модели поляризуемого континуума для растворителя были рассчитаны свободные энергии сольватации аналогов метилтрифенилфосфония и метилтрифенилбората. Следует отметить, что хорошая корреляция наблюдается между разницей свободных энергий сольватации ионов в воде и октане и величиной центрального барьера свободной энергии в липидной мембране, которая была вычислена из экспериментальных данных. Для выяснения роли делокализации заряда липофильных ионов в эффективности их проникновения через липидные мембраны мы сравнили свойства алкилированных производных трифенилфосфония, трициклогексилфосфония и тригексилфосфония на природных и искусственных мембранах. Измерение накопления липофильных катионов в ответ на генерацию отрицательного потенциала внутри митохондрий с помощью ион-селективного электрода выявило одинаковую степень накопления бутилтрициклогексилфосфония и бутилтрифенилфосфония в митохондриях. Константы скорости проникновения липофильных катионов через бислойные липидные мембраны, оцененные с помощью метода измерения релаксации тока, незначительно увеличиваются в следующей последовательности: тригексилтетрадецилфосфоний < трифенилтетрадецилфосфоний < трициклогексилдодецилфосфоний. В соответствии с этими результатами измерения стационарной проводимости БЛМ показали, что проницаемость мембраны для бутилтрициклогексилфосфония в 2.5 раза больше чем для бутилтрифенилфосфония. Величины разности свободной энергии сольватации ионов в воде и октане, рассчитанные с помощью теории функционала плотности и модели поляризуемого континуума для растворителя, оказались очень близки для метилтрифенилфосфония, метилтрициклогексилфосфония и метилтригексилфосфония. Наши результаты доказывают, что как циклические, так и ароматические фрагменты не являются необходимыми для эффективного проникновения липофильных ионов через липидные мембраны. Впервые на плоских бислойных липидных мембранах было изучено проникновение широко используемой ионной жидкости тригексилтетрадецилфосфония. Было показано, что этот липофильный катион обладает способностью увеличивать слабо селективную проводимость БЛМ в диапазоне нейтральных и щелочных рН. Липофильные катионы с алкилом додецилом обладают высокой гидрофобностью, что значительно замедляет процесс их десорбции с поверхности липидной мембраны. За счет замедления стадии десорбции может уменьшаться проницаемость катионов через липидные мембраны из одного водного раствора в другой и снижаться энергозависимое накопление в митохондриях. В этой связи для измерения проницаемости аналогов алкил трифенилфосфония и определения лимитирующей стадии процесса проникновения был синтезирован ряд липофильных катионов с коротким алкилом бутилом (C4TPP-X). Измерение токов через БЛМ в присутствии изучаемых катионов позволило рассчитать величины их проницаемости, которые варьировали в пределах шести порядков. Оказалось, что наблюдается хорошая корреляция между проницаемостью катионов C4TPP-X и константой скорости флип-флопа для аналогов C12TPP-X. В то же время коэффициент распределения октанол-вода для C4TPP-X изменялся в пределах двух порядков. Таким образом, лимитирующей стадией процесса проникновения липофильных катионов C4TPP-X является стадия их флип-флопа через липидную мембрану, а не стадия связывания/десорбции с поверхностью мембраны. Коэффициент распределения аналогов бутилтрифенилфосфония, полученный из расчетов разности свободных энергий сольватации в воде и октане с помощью квантово-механических методов, хорошо коррелирует со значениями проницаемостей аналогов. Можно утверждать, что взаимодействие липофильных ионов с молекулами воды определяет их способность проникать через липидные мембраны. Используя ион-селективный электрод, мы обнаружили меньшую степень накопления галогенированных аналогов C4TPP-X на выделенных митохондриях печени крысы, что согласуется с их меньшей проницаемостью по сравнению с другими аналогами. В то же время для других аналогов была характерна приблизительно одинаковая степень накопления. Протонофорное действие ионной пары – липофильного катиона C4TPP-X и пальматиновой кислоты – было изучено на выделенных митохондриях печени крысы, липосомах, нагруженных рН-чувствительным флуоресцентным красителем пиранином, и БЛМ. Наибольшую разобщающую и протонофорную активность проявлял катион бутил[три(3,5-диметилфенил)] фосфоний. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".