![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Уникальное место среди некодирующих РНК занимает 6S РНК, которая взаимодействует с РНК-полимеразой (РНКП) и ингибирует ее активность. Однако в определенных условиях фермент способен препятствовать этому процессу, используя саму 6S РНК как матрицу для транскрипции, и синтезировать короткие олигорибонуклеотиды – пРНК (от англ. product RNA, pRNA). Данный проект направлен на изучение свойств пРНК бактерий E. coli, R. sphaeroides и B. subtilis, имеющих прикладное значение. Мы предполагаем, что пРНК не только играют роль регулятора в конформационных изменениях 6S РНК и последующей диссоциации РНКП, но также могут выступать в качестве антисенсовых олигонуклеотидов к мРНК и регулировать их стабильность и/или трансляцию. По сути пРНК могут являться аналогами эукариотических микроРНК и выполнять похожие функции. Таким образом, целью данного проекта является выяснение значения пРНК в регуляции экспрессии генов бактерий E. coli, R. sphaeroides и B. subtilis в различных условиях клеточного роста, а также установление конкретного механизма, определяющего длину синтезируемых пРНК и, как следствие, регулирующего взаимодействие 6S РНК с РНКП. Наши исследования предполагают детализацию механизма структурной перестройки 6S РНК, возникающей за счет синтеза молекул пРНК. Также мы планируем проверить, как эффективность синтеза пРНК зависит от функционально значимых мутаций в CRE-«кармане» РНКП, связывающем в ДНК последовательности СRE (cAMP response elements). Если нами будет доказана способность пРНК взаимодействовать с мРНК-мишенями, то 6S РНК станет первой известной молекулой, обладающей двойным механизмом регуляции экспрессии генов, как на уровне транскрипции (ингибирование РНКП), так и на уровне трансляции (за счет пРНК-зависимого контроля стабильности мРНК-мишеней и/или их доступности для рибосом). Кроме того, пРНК будут первым экспериментально подтвержденным примером бактериальной микроРНК, открывающим совершенно новые возможности регуляции биосинтеза белка в бактериях.
6S RNA is a unique among all noncoding RNAs, as interacts with RNA polymerase (RNAP) and inhibits its activity. However, under certain conditions, the enzyme is able to prevent this process, using 6S RNA as a template for transcription, and synthesize short oligoribonucleotides – pRNA (product RNA). This project aims studying the properties of pRNAs of E. coli, R. sphaeroides and B. subtilis bacteria having applied relevance. We suggest that pRNAs not only play a regulator role in the conformational changes of 6S RNA and subsequent dissociation of RNAP, but can also act as antisense oligonucleotides to mRNA and regulate their stability and/or translation. In fact, pRNAs might turn out to be analogues of eukaryotic microRNAs and perform similar functions. Thus, the aim of this project is to reveal the contribution of pRNAs in the regulation of gene expression in E. coli, R. sphaeroides and B. subtilis in various conditions of cell growth. Also, we will clarify a specific mechanism determining the length of the synthesized pRNA and, as result, regulation of the interaction between 6S RNA and RNAP. Our studies suggest detailization the mechanism of structural rearrangements in 6S RNA, which occurs due to the synthesis of pRNA molecules. We also plan to examine, how the effectiveness of pRNA synthesis depends on functionally significant mutations in the CRE-"pocket" of RNAP that binds CRE (cAMP response elements) sequences in DNA. If we prove the ability of pRNAs to interact with mRNA targets, then 6S RNA will become the first known molecule with a dual mechanism of gene expression regulation occurring at transcription level (RNA inhibition) as well as at translation (due to pRNA-dependent control of target mRNA stability and/or their accessability for ribosomes). In addition, pRNAs will be the first experimentally confirmed example of bacterial microRNAs, opening up completely new possibilities for the regulation of protein biosynthesis in bacteria.
В научном коллективе на протяжении последних десяти лет успешно изучаются свойства 6S РНК в бактериях B. subtilis, Е. сoli и R. sphaeroides, выращенных в различных, в том числе и стрессовых условиях. Впервые показана способность 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis ингибировать транскрипцию генов и влиять на уровень экспрессии различных белков, большинство из которых вовлечены в клеточный ответ на различные стрессовые условия. Также впервые был продемонстрирован синтез коротких пРНК на матрицах 6S-1 и 6S-2 РНК, определены их нуклеотидные последовательности и установлен факт их комплексообразования с 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis. Показано, что клетки R. sphaeroides с делецией гена 6S РНК чувствительны к солевому стрессу и согласно предварительным данным содержат большое количество свободной пРНК. В E. coli обнаружены гены, 6S РНК-зависимая регуляция экспрессии которых обеспечивает устойчивость клетки к окислительному стрессу, вызванному добавлением 17 мМ пероксида водорода. Накоплен опыт по конструированию новых классов олигонуклеотидов с помощью специально разработанной стратегии гибкого варьирования типа и позиции модификации в нуклеиновой кислоте. Члены коллектива имеют опыт в области изучения механизмов катализа в активном центре бактериальных РНК-полимераз. Отработаны методики экспрессии и выделения РНКП различных бактерий. Получены плазмиды, которые содержат гены мутантных вариантов РНКП E. coli с заменами и делециями в CRE-кармане РНКП. Методами транскрипции in vitro изучено влияние мутаций в области CRE-«кармана» на функционирование РНКП. Показана важная роль специфических и неспецифических контактов РНК-полимеразы Е. coli с нематричной цепью ДНК на всех стадиях транскрипции. Члены коллектива обладают необходимым экспериментальным опытом в области микробиологии и работы с культурами клеток, проведении ПЦР, создании генетических конструкций.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 22 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции |
Результаты этапа: В первый год реализации проекта была выделена РНКП α-протеобактерии Rhodobacter sphaeroides, синтезирована соответствующая 6S РНК и показано образование комплекса между двумя молекулами, а также продемонстрирован синтез пРНК в условиях in vitro. Детектированы пРНК с диапазоном длин от 16 до 23 нуклеотидных остатков (н.о.), определена их стартовая точка транскрипции. С помощью сервиса mfold выявлены наиболее вероятные вторичные структуры 6S РНК R. sphaeroides, отличающиеся организацией центральной расплетенной области. Предложен один из вариантов возможных изменений вторичной структуры 6S РНК при взаимодействии с синтезирующимися на ней пРНК. Мы полагаем, что пРНК длиной 18 н.о. достаточно для инициации конформационных изменений 6S РНК. Для изучения этого процесса синтезированы 8-, 12-, 14-, 18- и 22-звенные аналоги пРНК. Основываясь на полученных данных, мы приступили к проверке выдвинутой нами оригинальной гипотезы о возможном существовании ранее не предполагаемой антисенсовой функции пРНК и ее роли в регуляции экспрессии генов в бактериях. Для детекции этих потенциальных мишеней пРНК как антисенсовых олигорибонуклеотидов в бактерии R. sphaeroides под руководством доц. Д.Д. Первушина (Сколковский институт науки и технологий) был проведён биоинформатический анализ её генома и обнаружено 49 генов, мРНК которых содержали комплементарные к пРНК участки длиной 11 н.о. (включая два «мисматча»). Первый этап экспериментальной проверки гипотезы о функционировании пРНК как антисенсовых РНК был выполнен для бактерии Bacillus subtilis. С помощью ОТ-кПЦР было измерено относительное количество мРНК семи генов, содержащих участки комплементарности к пРНК в клетках дикого типа по сравнению с клетками с нокаутом гена 6S-1 РНК и, соответственно, в отсутствие пРНК. Для 6 генов наблюдалось 2-5-кратное увеличение количества мРНК в ответ на отсутствие 6S-1 РНК. Максимальный эффект обнаружен для мРНК гена srfAA, в котором находится наибольшее количество комплементарных пРНК участков. | ||
2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции |
Результаты этапа: 6S РНК - малая некодирующая РНК бактерий, которая взаимодействует с РНК-полимеразой (РНКП) и ингибирует ее активность. РНКП способна использовать 6S РНК как матрицу для транскрипции и синтезировать короткие олигорибонуклеотиды – пРНК (от англ. product RNA). Небольшая часть этих коротких транскриптов остается связанной с 6S РНК и меняет конформацию последней. В результате происходит высвобождение РНКП. В проекте предполагается, что пРНК взаимодействуют с комплементарными им последовательностями мРНК, выступая в роли антисенсовых РНК. Они могут «привлекать» нуклеазы, гидролизующие мРНК, и, следовательно, понижать количество мРНК определенных генов. Отсутствие пРНК должно приводить к увеличению количества мРНК этих генов. Были выбраны 8 наиболее вероятных генов-кандидатов бактерии B. subtilis, в которых содержатся от 2 до 8 возможных участков гибридизации с пРНК6S-1. Для оценки влияния пРНК на стабильность мРНК выбранных генов методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией определяли количества мРНК в клетках дикого типа по сравнению с клетками с нокаутом гена 6S-1 РНК и, следовательно, с отсутствием пРНК6S-1. В поздней стационарной фазе роста клеток и на стадии выхода из нее нокаут гена 6S-1 РНК достоверно приводил к повышению количества мРНК генов gidA, pabC, holB и srfAA. Внесение гена 6S-1 РНК B. subtilis в мутантные штаммы приводило к восстановлению количества мРНК этих генов до уровня, характерного для клеток дикого типа. В нокаутном штамме, в который был вставлен экспрессирующийся ген 6S РНК E. coli, количества мРНК генов gidA, pabC, holB и srfAA оставались повышенными. По-видимому, на количество выбранных мРНК влияет именно пРНК6S-1, а не 6S РНК. Изучено влияние ионов Mg2+ и Mn2+ на транскрипцию пРНК с матрицы 6S РНК R. sphaeroides РНК-полимеразой R. sphaeroides в присутствии и в отсутствие σ-субъединицы. Установлено, что кор- и холофермент РНКП R. sphaeroides синтезируют 15-23-звенные пРНК на 6S РНК только при наличии ионов Mn2+. Мы предположили, что CRE-район β-субъединицы РНКП E. coli может быть вовлечен в синтез пРНК на матрице 6S РНК E. coli. Для проверки этой гипотезы были исследованы свойства мутантных форм РНКП. Варианты РНКП с заменами D446A, E546А, W183A в CRE-районе синтезировали 17-19-звенные пРНК с той же эффективностью, что и нативный холофермент. Однако замена 5 остатков 443-451 из петли CRE-района на Gly приводила к преждевременной остановке синтеза пРНК на уровне 14-мера, что свидетельствует о важности этого фрагмента РНКП для эффективной РНК-зависимой транскрипции. Известно, что остаток D446 РНКП E. coli непосредственно вовлечен в специфические контакты с +2G в нематричной цепи промотора. Нами исследовано сродство 6S РНК к нативной и мутантной РНКП(D446A), а также взаимодействие РНКП с 6S РНК E. coli, содержащей замену G143C (соответствует позиции +2G в промоторе), in vitro и in vivo. Показана незначительная роль контактов остатка D446 РНКП с G143 6S РНК в формировании комплекса РНКП с 6S РНК. В ходе работы метод «молекулярных маяков» был адаптирован для анализа сродства 6S РНК к флуоресцентно меченному холоферменту РНКП E. coli, которое понижается в результате синтеза пРНК. Это указывает на разрыв связей между σ-субъединицей РНКП и -10-подобным элементом 6S РНК E. coli. Оказалось, что при нарушении контактов CRE-кармана с G143 происходит двукратное увеличение скорости высвобождения РНКП из комплекса с 6S РНК. Показано, что замена ключевых остатков С в -10-подобном элементе в позициях 132 и 133 6S PHK E. coli на G заметно снижает эффективность связывания такой РНК с РНКП E. coli in vitro и препятствует синтезу пРНК. Для детекции пРНК, образующихся в процессе транскрипции на матрице 6S РНК, предложен метод «зеркального» нозерн-блоттинга. Он позволяет осуществлять быстрый скрининг способности новых 6S РНК или их мутантных вариантов выступать в качестве матрицы для синтеза пРНК, а также оценивать эффективность данного процесса. | ||
3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Короткие некодирующие РНК - продукты транскрипции 6S РНК прокариот: синтез, свойства, функции |
Результаты этапа: Проведен повторный более детальный анализ имеющихся данных транскриптома мутантных штаммов B. subtilis (∆bsrA, ∆bsrB и ∆bsrAB) в сравнении с диким типом в стационарной фазе с целью подтверждения повышения уровня экспрессии генов gidA, pabC, holB, srfAA. Методом ОТ-кПЦР в клетках R. sphaeroides дикого типа и штамме с делецией гена 6S РНК проведен сравнительному анализу эффективности транскрипции предполагаемых мРНК-мишеней пРНК (гены hmgL, flgK1 и RSP_0333). Осуществлен транскриптомный анализ этих штаммов в экспоненциальной и стационарной фазах роста клеток (в этих фазах в клетках дикого типа присутствует значительное количество 6S РНК). Проведено детальное исследование солевого фенотипа клеток R. sphaeroides с делецией 6S РНК с целью выявления условий, в которых 6S РНК и/или пРНК наиболее важны для клетки (различные концентраций NaCl и KCl, влияние стрессовых агентов на синтез мРНК гена мембранного белка SspA, связанного с солевым стрессом). |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".