ИСТИНА

Уникальное место среди некодирующих РНК занимает 6S РНК, которая взаимодействует с РНК-полимеразой (РНКП) и ингибирует ее активность. Однако в определенных условиях фермент способен препятствовать этому процессу, используя саму 6S РНК как матрицу для транскрипции, и синтезировать короткие олигорибонуклеотиды – пРНК (от англ. product RNA, pRNA). Данный проект направлен на изучение свойств пРНК бактерий E. coli, R. sphaeroides и B. subtilis, имеющих прикладное значение. Мы предполагаем, что пРНК не только играют роль регулятора в конформационных изменениях 6S РНК и последующей диссоциации РНКП, но также могут выступать в качестве антисенсовых олигонуклеотидов к мРНК и регулировать их стабильность и/или трансляцию. По сути пРНК могут являться аналогами эукариотических микроРНК и выполнять похожие функции. Таким образом, целью данного проекта является выяснение значения пРНК в регуляции экспрессии генов бактерий E. coli, R. sphaeroides и B. subtilis в различных условиях клеточного роста, а также установление конкретного механизма, определяющего длину синтезируемых пРНК и, как следствие, регулирующего взаимодействие 6S РНК с РНКП. Наши исследования предполагают детализацию механизма структурной перестройки 6S РНК, возникающей за счет синтеза молекул пРНК. Также мы планируем проверить, как эффективность синтеза пРНК зависит от функционально значимых мутаций в CRE-«кармане» РНКП, связывающем в ДНК последовательности СRE (cAMP response elements). Если нами будет доказана способность пРНК взаимодействовать с мРНК-мишенями, то 6S РНК станет первой известной молекулой, обладающей двойным механизмом регуляции экспрессии генов, как на уровне транскрипции (ингибирование РНКП), так и на уровне трансляции (за счет пРНК-зависимого контроля стабильности мРНК-мишеней и/или их доступности для рибосом). Кроме того, пРНК будут первым экспериментально подтвержденным примером бактериальной микроРНК, открывающим совершенно новые возможности регуляции биосинтеза белка в бактериях.

6S RNA is a unique among all noncoding RNAs, as interacts with RNA polymerase (RNAP) and inhibits its activity. However, under certain conditions, the enzyme is able to prevent this process, using 6S RNA as a template for transcription, and synthesize short oligoribonucleotides – pRNA (product RNA). This project aims studying the properties of pRNAs of E. coli, R. sphaeroides and B. subtilis bacteria having applied relevance. We suggest that pRNAs not only play a regulator role in the conformational changes of 6S RNA and subsequent dissociation of RNAP, but can also act as antisense oligonucleotides to mRNA and regulate their stability and/or translation. In fact, pRNAs might turn out to be analogues of eukaryotic microRNAs and perform similar functions. Thus, the aim of this project is to reveal the contribution of pRNAs in the regulation of gene expression in E. coli, R. sphaeroides and B. subtilis in various conditions of cell growth. Also, we will clarify a specific mechanism determining the length of the synthesized pRNA and, as result, regulation of the interaction between 6S RNA and RNAP. Our studies suggest detailization the mechanism of structural rearrangements in 6S RNA, which occurs due to the synthesis of pRNA molecules. We also plan to examine, how the effectiveness of pRNA synthesis depends on functionally significant mutations in the CRE-"pocket" of RNAP that binds CRE (cAMP response elements) sequences in DNA. If we prove the ability of pRNAs to interact with mRNA targets, then 6S RNA will become the first known molecule with a dual mechanism of gene expression regulation occurring at transcription level (RNA inhibition) as well as at translation (due to pRNA-dependent control of target mRNA stability and/or their accessability for ribosomes). In addition, pRNAs will be the first experimentally confirmed example of bacterial microRNAs, opening up completely new possibilities for the regulation of protein biosynthesis in bacteria.

В научном коллективе на протяжении последних десяти лет успешно изучаются свойства 6S РНК в бактериях B. subtilis, Е. сoli и R. sphaeroides, выращенных в различных, в том числе и стрессовых условиях. Впервые показана способность 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis ингибировать транскрипцию генов и влиять на уровень экспрессии различных белков, большинство из которых вовлечены в клеточный ответ на различные стрессовые условия. Также впервые был продемонстрирован синтез коротких пРНК на матрицах 6S-1 и 6S-2 РНК, определены их нуклеотидные последовательности и установлен факт их комплексообразования с 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis. Показано, что клетки R. sphaeroides с делецией гена 6S РНК чувствительны к солевому стрессу и согласно предварительным данным содержат большое количество свободной пРНК. В E. coli обнаружены гены, 6S РНК-зависимая регуляция экспрессии которых обеспечивает устойчивость клетки к окислительному стрессу, вызванному добавлением 17 мМ пероксида водорода. Накоплен опыт по конструированию новых классов олигонуклеотидов с помощью специально разработанной стратегии гибкого варьирования типа и позиции модификации в нуклеиновой кислоте. Члены коллектива имеют опыт в области изучения механизмов катализа в активном центре бактериальных РНК-полимераз. Отработаны методики экспрессии и выделения РНКП различных бактерий. Получены плазмиды, которые содержат гены мутантных вариантов РНКП E. coli с заменами и делециями в CRE-кармане РНКП. Методами транскрипции in vitro изучено влияние мутаций в области CRE-«кармана» на функционирование РНКП. Показана важная роль специфических и неспецифических контактов РНК-полимеразы Е. coli с нематричной цепью ДНК на всех стадиях транскрипции. Члены коллектива обладают необходимым экспериментальным опытом в области микробиологии и работы с культурами клеток, проведении ПЦР, создании генетических конструкций.