![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Аптамер – это олигонуклеотид, который связывается с мишенью за счет своей уникальной третичной структуры, именно структура определяет свойства аптамера. Аптамер, полученный при первичном отборе, редко имеет оптимальные характеристики: небольшая длина, высокая аффинность, устойчивость при физиологических условиях и др., - поэтому необходимым этапом конструирования функционального аптамера является оптимизация его структуры. В научном коллективе аспиранта предложены модели аптамеров и предполагается, что аптамеры описываются как каркас с узнающими петлями. Тогда оптимизация свойств аптамера сводится к изменению структуры петель без нарушения каркаса. Кроме того, существенным этапом исследования аптамера является определение участка его связывания с мишенью. В настоящий момент известно несколько аптамеров к гемагглютинину вируса гриппа А, в их числе ДНК-аптамеры RHA0385 и BV42. В научном коллективе аспиранта предложены структуры аптамеров в виде неканонического I-мотива и G-квадруплекса. Целью настоящей работы является оптимизация структурно-функциональных свойств аптамеров, включая минимизацию структуры. Изучение структуры будет проводиться методами кругового дихроизма, ЯМР и хроматографией. Аффинность аптамера будет определяться методами аптаферментного анализа и интерферометрии. ДНК-белковый контакт предполагается установить методом химических сшивок.
Aptamer is an oligonucleotide which binds target due to unique tertiary structure, and it is structure to determine aptamer function. Often aptamer which obtained by primary selection has no optimal characteristics, such as short length, high affinity, sustainability at physiological conditions et cetera, so the optimization of aptamer structure is an important stage of aptamer design. The research group of PhD student has proposed the aptamer model as scaffold with recognizing loops. In this case the optimization of aptamer properties means the alteration of loops without scaffold destabilization. Besides, the definition of aptamer binding site is an essential stage of aptamer research. At present there are some aptamers to influenza A virus hemagglutinin, and DNA aptamers RHA0385 and BV42 are among them. The research group of PhD student has suggested the G-quadruplex and I-motif structures of these aptamers respectively. The aim of this work is an optimization of structural and functional properties of these aptamers, which includes the structure minimization. The structural studies will be performed with spectroscopy of circular dichroism, nuclear magnetic resonance and chromatography. The affinity of aptamers will be determined by enzyme-linked aptamer assay and biolayer interferometry. The aptamer binding site on hemagglutinin is proposed to be found by chemical crosslinking method.
Первый год выполнения проекта. Для поиска оптимальных условий для связывания с гемагглютинином аптамера BV42, образующего I-мотив, планируется провести исследование влияния на аффинность сборки аптамера в различных условиях и оценить влияние: 1) буферных систем (фосфатного и фосфат-цитратного буфера) различной ионной силы, 2) различной кислотности среды (pH 5 — типичного для существования I-мотива, pH 7 — pH полуперехода аптамера из I-мотива в денатурированное состояние и физиологического pH, а также pH 8, при котором присутствует только денатурированная конформация аптамера BV42), 3) времени сборки аптамера (сравнить быстрое охлаждение предварительно денатурированного образца аптамера при комнатной температуре и постепенное охлаждение в течение 1,5 и 3 часов). Контроль за сборкой аптамера будет проводиться при помощи регистрации спектров кругового дихроизма при различных температурах, составлении и анализе кривых плавления. Аффинность всех полученных конформаций планируется определять методом биослойной интерферометрии при иммобилизации на стрептавидиновый сенсор биотинилированного аптамера, переформированного в соответствующих условиях, и при образовании комплекса с гемагглютининами на поверхности частиц вируса гриппа в фосфатном буфере. На основе полученных экспериментальных данных будут вычислены значения кинетических констант и равновесных констант диссоциации для комплексов гемагглютинина вируса гриппа с аптамером в различных условиях. Методика проведения анализа комплексов аптамер-гемагглютинин методом биослойной интерферометрии на данный момент разработана и применяется в лаборатории. Связывание аптамера, содержащего биотинилированную метку, в выбранных оптимальных условиях будет воспроизведено методом аптаферментного анализа, который предполагает иммобилизацию вируса гриппа на поверхность иммунологического планшета. Методика аптаферментного анализа, используемая в нашей лаборатории, была разработана совместно с д.б.н. Гамбарян А.С., в.н.с., заведующей лабораторией молекулярной биологии вируса гриппа Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова. Концентрацию вируса планируется определять при помощи либо реакции гемагглютинации, либо стандартных тестов с антителами. Для определения ключевых элементов структуры для функции и стабильности аптамеров BV42 и RHA0385 планируется создать две серии конструкций на их основе (минимум 7 в каждой серии) с изменениями в предполагаемых участках петель и каркаса. Все производные будут охарактеризованы с точки зрения структуры и стабильности методами спектроскопии кругового дихроизма и эксклюзионной хроматографии, для каждого производного будут рассчитаны термодинамические параметры процесса денатурации. Исследования аффинности и сравнение всех полученных аптамерных конструкций с точки зрения функции также будут проводиться описанным выше методом биослойной интерферометрии. Второй год выполнения проекта. На основе полученных данных будут сконструированы и синтезированы два минимальных аптамера с каркасом из I-мотива и G-квадруплекса путём минимизации участков, не являющихся ключевыми для структуры и функции аптамеров BV42 и RHA0385. Их структура и аффинность будут охарактеризованы при помощи методов спектроскопии кругового дихроизма, ядерного магнитного резонанса и эксклюзионной хроматографии, а также биослойной интерферометрии и аптаферментного анализа как минимум с двумя штаммами вирусов. Определение участка ДНК-белкового контакта в комплексе аптамера с гемагглютинином планируется провести методом химической сшивки. Для этого будут синтезированы биотинилированные производные двух минимальных аптамеров, содержащих модифицированный фотоактивируемый тимин с азидной функциональной группой. После облучения образовавшиеся конъюгаты с гемагглютинином вируса гриппа А будут обработаны протеазами; сшитые дезоксирибонуклеопротеиды будут выделены с помощью биотина и охарактеризованы методами масс-спектрометрии. На основе известной последовательности и структуры гемагглютинина вируса гриппа будут предложены участки контакта между аптамерами и белком.
Аспирант работает с аптамерами к гемагглютинину с 2016 года. В 2017 году защитила дипломную работу по теме «Неканонические структуры ДНК как каркас для аптамеров к гемагглютинину вируса гриппа» на «отлично». К настоящему моменту успешно освоила методы изучения как структуры (спектроскопия кругового дихроизма, в том числе вычисление термодинамических параметров структуры, ядерный магнитный резонанс, эксклюзионная хроматография), так и аффинности аптамеров (поверхностный плазменный резонанс, биослойная интерферометрия, аптаферментный анализ). В 2018 – 2019 гг. Новосельцева А.А. руководила курсовыми работами по аптамерной тематике у студентов 1, 2 и 4 курса химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
На основе данных о структуре и функции аптамеров G7 и G6 сконструированы два минимальных аптамера с каркасом из G-квадруплекса параллельной и гибридной топологии соответственно. Методом рационального дизайна были минимизированы участки, не являющиеся ключевыми для структуры и функции аптамеров, а именно: в случае аптамера G7nt-T-A-T усечены фланкирующие последовательности и большая петля, внесены замены в однонуклеотидные петли, а в случае аптамера G6/2 – выделен индивидуальный G-квадруплексный модуль гибридной топологии, уникальной для узнающего элемента на основе нуклеиновой кислоты. Структура и аффинность данных аптамеров охарактеризованы при помощи методов спектроскопии кругового дихроизма, ядерного магнитного резонанса и эксклюзионной хроматографии, а также интерферометрии биокомплексов с двумя штаммами вируса гриппа А в виде рекомбинантного белка и белка на поверхности вирусных частиц. Минимизация аптамеров не привела к изменению сайта связывания, который предположительно располагается вблизи активного центра гемагглютинина, отвечающего за узнавание сиаловых кислот клетки хозяина.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 октября 2019 г.-30 сентября 2020 г. | Оптимизация аптамеров, узнающих гемагглютинин вируса гриппа А, на основе двух неканонических структур ДНК |
Результаты этапа: Отработка методик – на аптамере G7 Исследования аффинности G-квадруплексного аптамера G7 (или RHA0385) 5′-TTGGGGTTATTTTGGGAGGGCGGGGGTT-3′ различными методами (поверхностным плазмонным резонансом (ППР), аптаферментным анализом (АФА)) показывают низкие значения кажущейся константы диссоциации кКд порядка десяти нМ. Все методики применимы не только к аптамерам серии G7, но и к аптамерам серии I5, с той лишь разницей, что в фосфатный буфер для преформирования квадруплексных аптамеров был добавлен хлорид калия для достижения концентрации K+ 10 мМ, а для I-мотивов использовали фосфатный и фосфат-цитратный буферы различных рН, что достигалось различным соотношением компонентов буфера. Концентрации аптамеров в преформируемых образцах составляли 2 мкМ во всех случаях, кроме ЯМР. ИБК с вирусом гриппа Впервые разработана методика для анализа аффинности аптамеров к ГА на поверхности частиц вируса гриппа при помощи ИБК на приборе Octet RED96 (ForteBio, США). Методика опробована на аптамере G7, для которого ранее другими методами была показана наномолярная аффинность к ГА вируса гриппа А. Инактивированные вируссодержащие аллантоисные жидкости с частицами вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) и куриные эритроциты для проведения реакции гемагглютинации любезно предоставлены д.б.н., в.н.с. Гамбарян А.С., Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН. Измеренная при помощи данной методики кажущаяся константа диссоциации кКд комплекса аптамера G7 и ГА на поверхности частиц вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) находится в наномолярном диапазоне и составляет 3,4±0,6 нМ, что хорошо согласуется с полученными ранее данными (8±3 нМ для комплекса с ГА на поверхности вирусных частиц штамма A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) (метод АФА) [Structural and functional aspects of G-quadruplex aptamers which bind a broad range of influenza a viruses / A. A. Novoseltseva, N. M. Ivanov, R. A. Novikov et al. // Biomolecules. — 2020. — Vol. 10, no. 1. — P. 119]) и свидетельствует о применимости методики для исследования аффинности аптамеров к ГА на поверхности частиц вируса гриппа при помощи ИБК. Впервые разработана методика для анализа аффинности аптамеров к рекГА вируса гриппа при помощи ИБК на приборе Octet RED96 (ForteBio, США). Методика опробована на аптамере G7, для которого ранее другими методами была показана наномолярная аффинность к ГА вируса гриппа А. Измеренная при помощи данной методики кажущаяся константа диссоциации кКд комплекса аптамера G7 и рекГА штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) является наномолярной и составляет 4±2 нМ, что согласуется с полученными ранее данными (13±3 нМ для комплекса с рекГА из штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (метод ППР) [Structural and functional aspects of G-quadruplex aptamers which bind a broad range of influenza a viruses / A. A. Novoseltseva, N. M. Ivanov, R. A. Novikov et al. // Biomolecules. — 2020. — Vol. 10, no. 1. — P. 119]) и свидетельствует о применимости методики для исследования аффинности аптамеров к ГА на поверхности частиц вируса гриппа при помощи ИБК. Круговой дихроизм Эксперименты по спектроскопии кругового дихроизма (КД) выполнены совместно с к.х.н. Арутюняном А.М., НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова. КД спектры всех исследованных аптамеров получены на спектрометре Chirascan (Applied Photophysics Ltd., Великобритания), оснащённом термоконтроллером. При температуре 20°С аптамер G7 имеет спектр, характерный для параллельного G-квадруплекса с положительным максимумом при 263 нм и отрицательным при 242 нм. При повышении температуры наблюдается снижение интенсивности обоих максимумов со скачкообразным переходом. Температура полуперехода, она же температура плавления Тпл, составляет 50,1±0,2°С, что свидетельствует о стабильности G-квадруплекса аптамера G7. Из графика линейной зависимости lnK от 1/T (рис. 4Б) были вычислены термодинамические параметры сборки аптамера G7: изменение энтальпии ΔH° составило -160±5 кДж/моль, изменение энтропии ΔS°T при температуре 25°С ― -148±4 кДж/моль, ΔG°298 ― -12,4±0,7 кДж/моль, что свидетельствует о термодинамической стабильности G-квадруплекса аптамера G7. Таким образом, данный метод оценки стабильности и структуры подходит для исследуемых аптамеров. эВЭЖХ Эксперименты эВЭЖХ были выполнены совместно с к.х.н. Ташлицким В.Н., Химический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, при помощи хроматографической системы Agilent 1200 HPLC с автосемплером и детектором с диодной матрицей (Agilent, США) при температуре 25°C. Использовали ВЭЖХ-колонку TSKgel G2000SWXL (Tosoh Bioscience, США), предназначенную для разделения белков массой 5-150 кДа (длина 30 см, диаметр 0,78 см, диаметр частиц 5 мкм, средний диаметр поры 12.5 нм). Согласно расчётам хроматографических пиков при помощи калибровочной кривой аптамер G7 обладает почти исключительно мономолекулярной структурой в разбавленном растворе (2 мкМ) (рис. 5). При увеличении концентрации до 200 мкМ содержание мономолекулярной структуры падает до 34%, и в растворе начинают преобладать разнообразные олигомерные формы. Разработанный метод эВЭЖХ позволяет определять олигомерный состав олигонуклеотидов. ЯМР Эксперименты по ядерному магнитному резонансу выполнены совместно с к.х.н. Новиковым Р.А., ИМБ РАН им. В.А. Энгельгардта. Образец исследуемого аптамера концентрацией от 12 до 510 мМ объёмом 550 мкл в фосфатном буфере на основе бидистиллированной H2O и D2O (Helicon, Россия) в соотношении 9:1 помещали в стеклянную пробирку для ЯМР (Duran, Германия) и преформировали нагреванием при 95°С в течение 5 мин, затем охлаждали при комнатной температуре. Спектры ЯМР регистрировали с помощью спектрометров «Bruker AVANCE III HD 300» и «Bruker AVANCE III 400» (300.1 и 400.1 МГц для 1H соответственно) от фирмы Bruker, США. ЯМР-спектр образца аптамера G7 концентрацией 240 мкМ опубликован в [Structural and functional aspects of G-quadruplex aptamers which bind a broad range of influenza a viruses / A. A. Novoseltseva, N. M. Ivanov, R. A. Novikov et al. // Biomolecules. — 2020. — Vol. 10, no. 1. — P. 119]. Наличие пиков в области имино-протонов 10―12 м.д. свидетельствует о наличии G-тетрад, стэкинг которых образует G-квадруплекс. При концентрации G7 12 мкМ его спектр имеет такое же расположение пиков, характерное для олигомерного G-квадруплекса. Однако накопить достаточный сигнал довольно трудно и спектр получается очень шумным, поэтому для получения ЯМР-спектров предпочтительнее использовать высокие концентрации аптамеров. Ввиду интереса к результатам спектроскопии ЯМР для исследуемых аптамеров данная работа, запланированная к выполнению во 2 год, проведена в 1 году. Структура и аффинность производных G7 В научном коллективе с участием аспиранта [Structural and functional aspects of G-quadruplex aptamers which bind a broad range of influenza a viruses / A. A. Novoseltseva, N. M. Ivanov, R. A. Novikov et al. // Biomolecules. — 2020. — Vol. 10, no. 1. — P. 119] было показано, что уменьшение длины большой петли G-квадруплексного аптамера G7 с 7 до 3 нуклеотидов существенно не снижает аффинность аптамера, при этом увеличивает его стабильность и склонность к мономолекулярному составу. В связи с этим возникла необходимость исследовать влияние фланкирующих участков, однонуклеотидных петель и минимизации длины большой петли на структуру, стабильность и аффинность аптамера с целью получить минимальный функциональный G-квадруплексный аптамер. Производные сконструированы исходя из предполагаемой модели структуры G7 с тремя G-квартетами, соединенных тремя пропеллерными петлями длиной 7, 1 и 1 нуклеотидов, и имеющего выступающие 5′- и 3′-концевые участки. Аптамер G7nt представляет собой аптамер G7 без предположительных фланкирующих последовательностей, у аптамеров G7n3t и G7n5t отсутствуют 3′- и 5′-конец соответственно. Аптамеры с названием G7nt-X-Y-Z (G7nt-T-T-T, G7nt-A-T-T, G7nt-T-A-T, G7nt-T-T-A) представляют собой G7nt, в котором все петли являются однонуклеотидными: первая петля состоит из нуклеотида X, вторая - из Y, третья - из Z соответственно. Все изучаемые производные сохранили структуру параллельного G-квадруплекса с небольшими отличиями в спектрах КД при 20°С. Наибольшие различия наблюдаются в области отрицательного максимума, причём у аптамеров без фланкирующих последовательностей данная область весьма сходна (G7nt, G7nt-T-T-T, G7nt-A-T-T, G7nt-T-A-T, G7nt-T-T-A). По положению положительного максимума и его интенсивности отличается аптамер G7n3t (265 нм вместо 263 нм у прочих), а спектр аптамера G7n5t - только по интенсивности. По изменению положительного максимума от температуры были построены кривые плавления и сборки (рис. З, чёрные квадратики и красные кружки соответственно). Кривые плавления аппроксимированы для получения Тпл аптамеров (таблица 1). Все аптамеры имеют высокие Тпл (выше 40°С), а для производных с однонуклеотидными петлями (Рис. 8Г-Ё) Тпл даже превышает 75°С, что свидетельствует об очень высокой стабильности данных G-квадруплексов. Из наложения кривых плавления и сборки также видно отсутствие гистерезиса для аптамеров G7nt, G7n3t, G7n5t -- необходимое условие для вычисления термодинамических параметров из КД спектров по описанной выше методике. Термодинамические параметры для аптамеров с однонуклеотидными петлями (G7nt_T-T-T, G7nt-A-T-T, G7nt-T-A-T, G7nt-T-T-A) не удалось определить из-за наличия гистерезиса. Все полученные производные являются несколько менее стабильными с термодинамической точки зрения, чем исходный аптамер, особенно G7nt, ΔG°298 которого на единицу меньше по модулю - несмотря на существенное увеличение по модулю вклада изменения энтальпии, энтропийный вклад в образование структуры также велик по модулю и компенсирует ΔH°. Такая ситуация характерна и для остальных производных, но менее выражена. Согласно анализу эВЭЖХ почти все производные аптамеры имеют значительное содержание олигомеров даже в разбавленных растворах. Только для G7n3t наблюдается мономолекулярная структура, в то время как в образце G7nt почти одинаково содержание мономера и димера, а в образцах однонуклеотидных производных и G7n5t наряду с мономером присутствует тетрамер. Интересно, что все аптамеры, в том числе производные с минимальной длиной 15 нуклеотидов, содержащие только однонуклеотидные петли, сохранили функциональную активность к мишени. В качестве лидера для последующего изучения сайта связывания выбран аптамер G7nt-T-A-T, обладающей лучшей аффинностью среди 15-нуклеотидных производных аптамера G7. ЯМР-спектр аптамера G7nt-T-A-T свидетельствует о преобладании в растворе тетрамера на основе G-квадруплекса, что согласуется с результатами эВЭЖХ. Аптамер BV42 - сборка и аффинность Влияние кислотности среды. Существование неканонической структуры типа i-мотив связано с образованием неканонических пар С-С+, где С – цитозин, а С+ - протонированный цитозин, рКа которого составляет 4,45. Таким образом, кислотность среды порядка pH5 типична для существования I-мотива [Solution equilibria of cytosine- and guanine-rich sequences near the promoter region of the n-myc gene that contain stable hairpins within lateral loops /Benabou S, Ferreira R, Aviñó A, et al. // Biochim Biophys Acta. 2014;1840(1):41-52. doi:10.1016/j.bbagen.2013.08.028]. Ранее было показано [Aptamers to hemagglutinin: a novel tool for influenza virus recognition and neutralization / A. Kopylov, V. Legatova, A. Novoseltseva et al. // 5th ISIRV AVG Conference Abstract book. — ISIRV Shanghai, 2017. — P. 103–104.], что в фосфатном буфере с рН5 аптамер BV42 образует неканоническую структуру типа I-мотив наряду с дуплексом. Интересно, что рН полуперехода BV42 в денатурированное состояние составляет 7,7, что свидетельствует о стабильности структуры типа i-мотив и в нейтральных средах. При pH8 присутствует только денатурированная конформация аптамера BV42. Информация о наличии или отсутствии вторичной структуры получена методом спектроскопии кругового дихроизма (КД). В кислой среде рН5 присутствуют характерные для i-мотива максимумы: положительный при 285 нм и отрицательный при 263 нм, а в щелочной (рН8) КД спектр аптамера имеет вид, характерный для одноцепочечной нити и двойной спирали. Для собранной (рН5) и полусобранной (рН7) форм аптамера BV42 были выполнены эксперименты по плавлению на КД-спектрометре. Температуры плавления Тпл составили 77,8±0,4 °С и 37,4±0,2 °С соответственно. Структура при рН5 действительно является гораздо более стабильной. Для обеих форм (собранной (рН5) и полусобранной (рН7)) аптамера изучено сродство к ГА на поверхности частиц вируса гриппа А (штамм A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1)). Для сенсограмм комплексов иммобилизованного на сенсоре аптамера BV42 и ГА на поверхности вирусных частиц, полученных при рН5, невозможно рассчитать аффинность, поскольку после вычитания буфера сигнал ведёт себя анормальным образом, уходя в отрицательную область В растворе при рН 7 для аптамера BV42 была впервые получена кажущаяся константа диссоциации в комплексе с гемагглютинином на поверхности вирусной частицы. Аптамер имеет высокую аффинность (кКд=0,08±0,05 нМ), поэтому для дальнейших экспериментов с аптамером BV42 была выбрана именно нейтральная кислотность среды. Влияние буферных систем (фосфатного и фосфат-цитратного буфера) различной ионной силы. Наряду с кислотностью буфера, было также исследовано влияние его состава на аффинность и сборку аптамера. Предполагается проводить исследования аптамера BV42 и его производных в средах различной кислотности, поэтому важно найти систему компонентов, которая позволит достигать различных значений рН. Классический фосфатный буфер имеет ограничения кислотности с 5,8 до 8,0. Практически рН5 достижим в растворе дигидрофосфата с небольшим содержанием гидрофосфата, но полученный раствор не будет иметь буферных свойств, хотя в целях удобства наименования в данной работе этот раствор называется фосфатным буфером. Из этих соображений была поставлена задача исследовать также фосфат-цитратный буфер, который за счёт многозарядного аниона лимонной кислоты может иметь рН в диапазоне от 2,2 до 8,0. Согласно спектрам КД (рис. 15) аптамер BV42 при рН7 имеет идентичную, частично разобранную структуру в фосфатном и фосфат-цитратном буферах. Аптамер BV42 имеет примерно одинаковую аффинность при преформировании в фосфатном и фосфат-цитратном буфере рН7 с учётом погрешности (кКд составляет 0,08±0,05 нМ и 0,02±0,01 нМ соответственно при иммобилизации аптамера на сенсор). Интересно, что при иммобилизации рекГА и образовании комплекса с аптамером в растворе значения кКд также весьма сходны, и также с небольшим преимуществом в пользу фосфат-цитратного буфера (0,5±0,3 нМ для фосфат-цитратного и 0,9±0,2 нМ для фосфатного буфера). Полученные буферы имеют небольшое различие в ионной силе (I(фосфатный буфер)=164,54 мМ, I(фосфат-цитратный буфер)=150,3 мМ) - вероятно, именно этим объясняется некоторое различие в полученных значениях кКд и аптамер BV42 имеет более высокую аффинность в растворах с более низкой ионной силой. Тем не менее, компоненты для фосфатного буфера являются широко доступными, в том числе в таблетированной форме, при этом фосфатный буфер идеально подходит для ЯМР-исследований, поскольку не даёт интенсивных сигналов на спектрах и не создаёт помех для их анализа. С учётом вышеперечисленных факторов для дальнейших исследований аффинности и структуры выбран именно фосфатный буфер. Влияние времени сборки аптамера Перед проведением любого эксперимента необходимо обеспечить преформирование аптамера в оптимальных условиях. В данной работе образец аптамера концентрацией 2 мкМ в нужном буфере преформировали в течение 5 мин при 95°С. Для оценки влияния времени сборки аптамера была поставлена задача сравнить разные режимы охлаждения образца аптамера: быстрое охлаждение предварительно денатурированного образца аптамера при комнатной температуре и постепенное охлаждение до комнатной температуры в течение 90 и 180 минут. Данные режимы охлаждения оказывают существенное влияние на сборку аптамера BV42, о чём свидетельствуют спектры КД. Интересно, что долгое охлаждение вызывает не структуризацию, как ожидалось, а деструктурирование аптамера (об этом свидетельствует смещение положительного максимума с 282 нм на 278 нм). При быстром охлаждении аптамера BV42 до комнатной его аффинность в комплексе с ГА на поверхности частиц вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) максимальна (кКд=0,08±0,05 нМ), затем немного снижается при охлаждении в течение 90 минут, хотя и в пределах погрешностей, и остаётся неизменной при увеличении времени охлаждения (кКд в обоих случаях равна 0,2±0,1 нМ), причём происходит это за счёт уменьшения константы скорости ассоциации, в то время как константа скорости диссоциации остаётся на одном уровне. Быстрое охлаждение при комнатной температуре после преформирования нагреванием является оптимальным для аффинности аптамера. Таким образом, оптимизированы условия для исследования функции аптамера BV42: фосфатный буфер рН7, преформирование нагреванием до 95°С в течение 5 мин и последующее быстрое охлаждение при комнатной температуре. Запланированный эксперимент по связыванию аптамера в выбранных оптимальных условиях методом аптаферментного анализа, который предполагает иммобилизацию вируса гриппа на поверхность иммунологического планшета и является сложным в исполнении и воспроизводимости, был заменён на аналогичный, более простой эксперимент с помощью метода интерферометрии биокомплексов с использованием подобной системы, включающей в себя аптамер в растворе и иммобилизованный на сенсор рекомбинантный гемагглютинин штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Кажущаяся константа диссоциации кКд комплекса аптамера BV42 c рекГА штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) составила 0,08±0,05 нМ. Структура и аффинность производных BV42 Аптамеры I5-T и I5-C5 представляют собой аптамер BV42, у которого полицитозиновая последовательность фазирована, то есть предварительные участки петель заменены на политиминовые последовательности разной длины. У аптамеров I5-1, I5-2 и I5-T_loop изменена последовательность большой петли. В аптамере I5-7 все предположительные участки петель заменены на политиминовые последовательности. Аптамер I5-6 представляет собой аптамер BV42 без 5′- и 3′- концевых участков, образующих дуплекс. Ранее было показано, что все эти аптамеры образуют вторичную структуру типа I-мотив, однако имеют разную термическую и рН-стабильность. Так, аптамер со всеми тиминовыми петлями (I5-7) является более структурированным, чем исходный, поскольку в условиях эксперимента (рН7, 20°С, 2 мкМ) более других склонен сохранять структуру I-мотива. Далее в порядке убывания структурированности (это видно по уменьшению интенсивности и смещению положительного максимума в более коротковолновую область) располагаются аптамеры с изменениями в большой петле - I5-1, I5-2, I5-T_loop. Структурированностью меньшей, чем исходный аптамер BV42, обладают аптамеры с полицитозиновым блоком, фазированным тиминовыми петлями - I5-T и I5-C5. Наконец, самым неструктурированным является аптамер I5-6, лишённый дуплексной части. Интересно, что этот аптамер I5-6 также имеет самую низкую температуру плавления, так что уже при комнатной температуре он находится в полуденатурированном состоянии. Все остальные аптамеры - стабильные при комнатной температуре. Стоит отметить, что аптамеры с фазированным полицитозинованным блоком имеют температуру плавления выше, чем исходный аптамер. Это говорит о том, что стабильность, определяемая при воздействии факторов температуры или рН, имеет не только разную природу, но и разное значение для структуры I-мотива. По данным эВЭЖХвсе аптамеры являются мономолекулярными. Интересно, что все внесённые изменения, включая изменение состава предположительных петель и удаление дуплексной концевой части, не привели к снижению аффинности. В качестве лидера для последующего изучения сайта связывания выбран аптамер I5-6, обладающей одновременно одним из наиболее низких значений кКд и минимальной длиной (36 нуклеотидов) среди производных аптамера BV42. | ||
2 | 1 октября 2020 г.-30 сентября 2021 г. | Оптимизация аптамеров, узнающих гемагглютинин вируса гриппа А, на основе двух неканонических структур ДНК |
Результаты этапа: Согласно плану, основные работы по 2 этапу выполнения гранта должны быть посвящены исследованиям минимальных аптамеров, сконструированных на основе неканонической структуры исходных аптамеров RHA0385 (G7) и Bv42 (I5). Для того, чтобы убедиться, что образование неканонической структуры необходимо для узнавания ГА, были проведены эксперименты по комплексообразованию исходных аптамеров G7 и I5 в условиях, нарушающих сборку искомой конформации. Для аптамера G7 такими условиями является отсутствие катионов калия, которое приводит к изменению конформации аптамера, что наблюдается по спектрам кругового дихроизма (КД) (рис. 1). Соответствующие изменения наблюдаем при исследовании аффинности аптамера: комплекс в присутствии ионов калия является на порядок более стабильным (значения кажущихся констант диссоциации кКд, полученных методом интерферометрии биокомплексов на рекомбинантном гемагглютинине, составляют 0,6 ± 0,3 нМ и 4 ± 2 нМ для комплексов в присутствии и в отсутствие К+ соответственно). Из этого можно сделать вывод, что сохранение каркасной структуры G-квадруплекса важно для функции аптамера. В ходе выполнения 1 этапа работ по гранту на основе аптамера G7 сконструированы несколько производных, из которых в качестве лидера был выбран минимальный 15-звенный G-квадруплекс параллельной топологии с тремя G-тетрадами G7nt-T-A-T (GGGTGGGAGGGTGGG), полученный путём усечения фланкирующих последовательностей и большой петли и замен в однонуклеотидных петлях. Его аффинность которого к штамму вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) сопоставима с исходным аптамером. С опережением плана работ на прошлом этапе был выполнен анализ структуры (методами ЯМР и КД), стабильности (КД) и олигомерности (ВЭЖХ) G7nt-T-A-T, а также его связывание с гемагглютинином на поверхности частиц вируса гриппа A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) методом интерферометрии биокомплексов. Сохранение аффинности аптамера I5 при рН8 свидетельствует о том, что для связывания с мишенью структурированная конформация олигонуклеотида не является обязательной. Таким образом, дальнейшее исследование аптамера I5 и выявление структурных участков, отвечающих за узнавание ГА, является затруднительным, в связи с этим решено исследовать аптамер RHA0006 (G6), который обладает неканонической структурой ДНК в виде G-квадруплекса. Конструирование производных G6 Аптамер RHA0006, как и RHA0385 (G7), получен к ГА1 субъединице гемагглютинина (ГА) штамма A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Shiratori et al., 2014) и обладает уникальной способностью узнавать гемагглютинины 11 различных штаммов вируса гриппа А. В лаборатории аспиранта было выдвинуто обоснованное предположение о G-квадруплексной пространственной структуре G6 на основе первичной структуры и предварительных экспериментов по спектроскопии кругового дихроизма (КД) (5’-GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGAAAAA-3’, выделенные гуанины предположительно образуют GQ). Для того, чтобы уточнить структуру аптамера, а также определить, насколько необходимо сочетание двух модулей для узнавания ГА, был сконструирован предположительный одномодульный вариант и другие производные аптамера G6. ЯМР G6 и G6/2 В спектрах G6 и G6/2 (рис. 4) присутствуют сигналы, соответствующие имино-протонам GQ в области 10–12 м.д. (Adrian et al., 2012). Главное различие состоит в наличии в спектре G6 пиков, характерных для уотсон-криковских пар (13–14 м.д.), которые можно отнести к АТ-парам, что отражает возможность образования дуплекса между мостиковыми тиминами и 5′-концевыми аденинами. Аптамер G6 имеет три конформации. Межмолекулярная конформация с отношением Mэксп/Mтеор 2,4 (предположительно димерная) встречается только в образце с высокой концентрацией олигонуклеотида. В разбавленных же растворах присутствуют два плохо разделяющиеся пика со степенями олигомеризации 1,0 и 1,4 соответственно. Можно предположить, что эти пики отражают присутствие двух мономолекулярных конформаций различной топологии. Примечательно, что аптамер G6/2 как в разбавленных, так и в концентрированных растворах содержит только две эти плохо разделяющиеся конформации (значения Mэксп/Mтеор 1,1 и 1,4 соответственно), причём первая проявляется лишь как плечо, а не отдельный пик (рис. 5Б). Таким образом, если следовать предположению, что на хроматограммах в виде двух близкорасположенных пиков отражены конформации с GQ различной топологии, то в G6/2 почти отсутствует одна из конформаций. Кроме того, для G6/2 нехарактерны межмолекулярные структуры даже в концентрированных растворах, то есть выделение одного GQ модуля из аптамера G6 приводит к подавлению олигомеризации. Результаты экспериментов эксклюзионной ВЭЖХ показывают, что в растворах большинства аптамеров серии G6 преобладают две мономолекулярные конформации, вероятно, относящиеся к GQ разной топологии, и только G6/2 содержит преимущественно одну из конформаций, предположительно, гибридной топологии. Спектр КД аптамера G6/2 характерен для гибридной («3+1») топологии GQ, поскольку сочетает в себе положительные максимумы, характерные как для параллельной топологии (около 260 нм), так и антипараллельной топологии (около 295 нм). Объединение двух модулей G6/2 в аптамер G6 приводит к значительному увеличению максимума при 260 нм и получению КД спектра с преобладанием максимума около 260 нм, характерного для GQ параллельной топологии, с компонентной антипараллельного или гибридного GQ. Следовательно, при объединении двух модулей G6/2 (гибридной топологии) конформации одного из модулей меняется на параллельный GQ. GQ аптамеры G6 и G6/2 являются стабильными при комнатной температуре и в условиях проведения экспериментов по аффинности. Для G6 и G6/2 температуры плавления составили соответственно 48,3 ± 0,2 °С и 58,1 ± 0,5 °С, то есть в данном случае один модуль G6/2 стабильнее, чем бимодульный G6. Высокие температуры плавления для гибридного GQ с тремя квартетами известны в литературе (Dai et al., 2008). Аффинность аптамеров G6, G7 и их минимальных производных Для исследования комплексов аптамеров с рекомбинантным ГА штамма A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) был применён метод интерферометрии биокомплексов с иммобилизацией белка на поверхность биосенсоров. Что касается аптамера G6 и выделенного из него гибридного G6/2, то отсутствие параллельного GQ модуля приводит к ухудшению связывания с рекГА в 2 раза, при этом аффинность остаётся высокой (кКд составила 0,35 ± 0,09 нМ для G6 и 0,7 ± 0,3 нМ для G6/2, см. табл. 1). Разница наблюдается и для обеих кинетических констант (для G6/2 медленнее и ассоциация, и диссоциация), что свидетельствует о разной кинетике связывания GQ разной топологии. Следует отметить, что в целом аффинность комплексов аптамеров серий G7 и G6 с рекГА близки, следовательно, у этих GQ могут быть общие элементы структуры, отвечающие за аффинность к ГА. Исследования аффинности аптамеров к белку на поверхности вирусных частиц также проводили методом интерферометрии биокомплексов (ИБК), который имеет большое преимущество перед аптаферментным анализом, предполагавшимся к использованию при планировании работ гранта – он позволяет вычислять не только равновесную константу аффинности, но и кинетические константы комплексообразования, которые позволяют более точно раскрыть характер изменений в аффинности при минимизации структуры аптамера. Для комплекса G6 с вирГА штамма A/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) метод ИБК показал высокую субнаномолярную аффинность (рис. 12А), кКд в пересчёте на концентрацию тримера вирГА составила 0,2 ± 0,1 нМ (табл. 2). Для комплекса аптамера G6/2 аффинность также высока, но, как и в случае с комплексом с рекГА, кКд выше и составляет 0,8 ± 0,4 нМ. Список литературы 1. Adrian M., Heddi B., Phan A.T. NMR spectroscopy of G-quadruplexes. // Methods. 2012. Vol. 57. P. 11–24. 2. Bing T., Zheng W., Zhang X., et al. Triplex-quadruplex structural scaffold: a new binding structure of aptamer. // Sci Rep. 2017. Vol. 7. P. 15467. 3. 130. Dai J., Carver M., Yang D. Polymorphism of human telomeric quadruplex structures. // Biochimie. 2008. Vol. 90. P. 1172−83. 4. Kypr J., Kejnovská I., Renčiuk D., Vorlíčková M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 1713–1725. 5. Mergny J.L., Phan A.T., Lacroix L. Following G-quartet formation by UV-spectroscopy. // FEBS Lett. 1998. V. 435. P. 74–78. 6. Shiratori I., Akitomi J., Boltz D. A., et al. Selection of DNA aptamers that bind to influenza A viruses with high affinity and broad subtype specificity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. Vol. 443. P. 37–41. 7. Smargiasso N., Rosu F., Hsia W., et al. G-quadruplex DNA assemblies: Loop length, cation identity, and multimer formation. // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130. P. 10208–10216. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".