ИСТИНА

Внеклеточные везикулы (прежде всего экзосомы и микровезикулы) привлекают внимание исследователей в области молекулярной и клеточной медицины в связи со значимостью этих наноструктур в функционировании многоклеточных организмов, а также их ролью в развитии онкологических заболеваний. При этом многие результаты исследований состава и физиологических свойств внеклеточных везикул оказываются противоречивы и трудно воспроизводимы – на это указывает международное экспертное сообщество (консорциум EV-TRACK, Международное сообщество по изучению внеклеточных везикул ISEV). Причинами этих сложностей являются гетерогенность везикул (частицы, продуцируемые одними и теми же клетками, могут обладать разной морфологией, отличаться по молекулярному составу и функциональному значению), а также несовершенство методик их выделения и анализа. Данный проект направлен на изучение полиморфизма внеклеточных везикул, секретируемых клетками злокачественных опухолей, методами микроскопии высокого разрешения (просвечивающей электронной микроскопии, ПЭМ, сканирующей электронной микроскопии, СЭМ, и атомно-силовой микроскопии, АСМ), а также на развитие методик подготовки образцов для таких исследований, проведения измерений и обработки данных. Для визуализации внеклеточных везикул обычно используется ПЭМ с негативным контрастированием, причем получаемые изображения обрабатывают вручную. В данном проекте будут предложены следующие усовершенствования этого подхода. Будет разработана программа для обработки изображений на основе нейронных сетей, которая позволит обрабатывать большое количество изображений для определения размеров и формы внеклеточных везикул по популяциям, содержащим сотни частиц. С помощью этой программы будет проведена классификация внеклеточных везикул по размерам и морфологии. Метод АСМ будет впервые использован для визуализации везикул, осажденных на сетку для ПЭМ. Это позволит охарактеризовать деформацию везикул, вызванную их адсорбцией, и более корректно определить их размеры. Впервые будет сделана попытка провести скоррелированные измерения внеклеточных везикул (выполненные на одном и том же поле зрения двумя методами) с помощью ПЭМ и АСМ. Будет использована методика иммуномечения образцов коллоидным золотом, чтобы оценить популяции внеклеточных везикул, которые несут на себе определенный белковый маркер. Будет реализована методика визуализации внеклеточных везикул методом СЭМ, будет проанализировано влияние различных аспектов пробоподготовки (фиксация, выбор подложки) на СЭМ-изображения везикул. Актуальность проекта связана с высоким интересом международного научного сообщества к исследованию внеклеточных везикул (и в частности экзосом), а также к развитию процедур их выделения, контроля и характеризации. Методики, разработанные в рамках данного проекта (иммуномечения, скоррелированных измерений и обработки данных), будут востребованы для оптимизации выделения и стандартизации препаратов внеклеточных везикул, оценки их морфологии и размера, классификации везикул.

Extracellular vesicles (most importantly, the exosomes and microvesicles) attract the attention of researchers in molecular and cellular medicine due to their importance in the functioning of multicellular organisms, as well as their role in the development of oncological diseases. At the same time, many results of studies of the biomolecular composition and physiological properties of extracellular vesicles turn out to be contradictory and difficult to reproduce. This problem has been indicated by the international expert community (EV-TRACK consortium, International Society for the Study of Extracellular Vesicles ISEV). The reasons for these difficulties partly consist in the fact that vesicles are extremely heterogeneous (particles produced by the same cells may have different morphologies differ in molecular composition and functional value), and the methods for their isolation and analysis are not sufficiently perfect. This project aims to study the polymorphism of extracellular vesicles secreted by malignant tumor cells using high-resolution microscopy techniques (transmission electron microscopy, TEM, scanning electron microscopy, SEM, and atomic force microscopy, AFM), improved measurement procedures and data processing. For visualization of extracellular vesicles, TEM with negative contrast is commonly used, and the resulting images are processed manually. This project will offer the following improvements to this approach. A program for image processing based on neural networks will be developed, which will allow processing a large number of images to determine the size and shape of extracellular vesicles by populations containing hundreds of particles. With this program, the classification of extracellular vesicles by size and morphology will be carried out. The AFM method will be used for the first time to visualize vesicles deposited on a TEM network. This will allow us to characterize the deformation of the vesicles caused by their adsorption, and more correctly determine their size. For the first time, an attempt will be made to carry out correlated measurements of extracellular vesicles (performed on the same field of view using two methods) using TEM and AFM. The method of immunogold labeling will be used to estimate populations of extracellular vesicles that carry a certain protein marker. The technique of extracellular vesicles visualization by SEM will be implemented, the influence of various aspects of sample preparation (fixation, choice of the substrate) on SEM images of vesicles will be analyzed. The relevance of the project is connected with the interest of the international scientific community in extracellular vesicles (particularly the exosomes), procedures for their isolation, control and characterization. The methods developed in the framework of this project (immunogold labeling, correlated measurements, and automated data processing) will be in demand to optimize the isolation and standardization of extracellular vesicle preparations, assess their morphology and size, and classify vesicles.