Возможные механизмы вовлечения универсальных стрессовых белков в регуляцию морфологии семян и их прорастанияНИР

Possible mechanisms for the involvement of universal stress proteins in the regulation of seed morphology and germination

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 октября 2019 г.-2 сентября 2020 г. Возможные механизмы вовлечения универсальных стрессовых белков в регуляцию морфологии семян и их прорастания
Результаты этапа: Для начала был охарактеризован профиль экспрессии генов At3g11930 и At2g47710 в зависимости от органа, стадии развития и обработки регуляторами роста. Экспрессию анализировали методом ПЦР-анализа в режиме реального времени (qRT-PCR). Для этого РНК из растительных тканей была выделена стандартным методом с применением TRIZol-реагента, очищена от примеси ДНК обработкой ДНКазой I и использована для синтеза кДНК. В случае семян и зеленых стручков РНК была выделена методом, описанным в работе Mend and Feldman, 2010 (doi:10.1002/biot.200900211). Реакцию ПЦР осуществляли на приборе АНК-32 (Синтол, Россия) с применением реакционной смеси qPCRmix-HS SYBR (Евроген). Нормализация полученных результатов осуществлялась относительно уровня экспрессии референсного гена UBC10 (At5g53300). Согласно полученным результатам, ген At3g11930 имеет сходный с At3g58450 профиль экспрессии с максимумом в сухих семенах,однако транскрипты At3g11930 фиксируются с достаточной интенсивностью во всех органах и на всех стадиях развития, в отличие от At3g58450, чья экспрессия отсутствует в корнях и вегетативных розетках, и начинает фиксироваться на слабом уровне только в цветках с последующим накоплением мРНК в стручках и сухих семенах. При этом ген At2g47710 имеет приблизительно одинаковый уровень экспрессии во всех органах, за исключением корней, и на всех стадиях развития. Таким образом, в жизненном цикле Arabidopsis присутствует как минимум несколько стадий, когда в клетке обнаруживаются транскрипты всех трех генов одновременно, что не противоречит их потенциальному взаимодействию. Этими стадиями являются: формирование стручка, сухое семя и его прорастание. Затем мы проанализировали возможную регуляцию экспрессии этих генов ключевыми фитогормонами, контролирующими прорастание – абсцизовой кислотой (АБК) и гиббереллинами (ГК), а также регуляцию экспрессии в ответ на истощение по ГК в присутствии ингибитора их биосинтеза паклобутразола (РАС). Объектом исследования служили 10-дневные проростки дикого типа, росшие в стандартных условиях на агаризованной половинной среде MS в присутствии: 10 мкМ ГК4+7, 3 мкМ АБК или 5 мкМ РАС. Концентрации фитогормонов были экспериментально подобраны в лаборатории ранее. Согласно полученным результатам, экспрессия At3g11930 практически не изменялась в присутствии ГК, АБК или РАС. В то же время экспрессия At2g47710 снижалась в 2-3 раза в присутствии всех трех регуляторов роста. Далее, в процессе выполнения плана по данному проекту нами была проведена окончательная сегрегация инсерционных линий GK_884A06 (884A06) и GK_036E02 (036E02), несущих инсерцию Т-ДНК в генах At3g11930 и At2g47710 соответственно. Методом ПЦР-анализа доказано наличие вставки Т-ДНК в геномной ДНК соответствующих линий и их гомозиготность: на матрице геномной ДНК мутантов амплифицируется фрагмент, соответствующий вставке Т-ДНК, но не амплифицируется фрагмент, соответствующий геномной ДНК дикого типа. Затем нами было проанализировано влияние вставки Т-ДНК на экспрессию целевых генов методом qRT-PCR. РНК из 10-дневных проростков дикого типа и трансгенных линий была выделена стандартным методом с применением TRIZol-реагента, очищена от примеси ДНК обработкой ДНКазой I и использована для синтеза кДНК. Праймеры для qRT-PCR подбирались таким образом, чтобы захватывать участок гена, расположенный за инсерцией. По результатам qRT-PCR-анализа было выявлено, что линия 884А06 со вставкой в экзоне является полным мутантом (knock-out mutant), т.к. вставка Т-ДНК привела к полной инактивации экспрессии гена At3g11930. При этом в случае линии 036Е02 вставка Т-ДНК вошла в 5’-нетранслируемый регион и не изменила уровня экспрессии гена At2g47710. Соответственно, эту линию нельзя будет использовать для получения двойных мутантов. Тем не менее, для первичного фенотипического анализа данная линия тоже была взята нами в анализ, поскольку наличие инсерции Т-ДНК в 5’-нетранслируемом регионе может повлиять на работу находящихся там регуляторных элементов; это, в свою очередь, может привести к формированию фенотипических отличий и позволит дать первичную оценку возможности взаимосвязи данного гена с процессом прорастания. После этого методом qRT-PCR-анализа нами было исследовано, как повлияла инсерция Т-ДНК в соответствующих мутантах на экспрессию генов гомологичных USP-белков. Широко распространено явление, когда инактивация одного из гомологов приводит к стимуляции экспрессии других, чтобы скомпенсировать фенотип. Например, такое наблюдается при регуляции экспрессии гомологичных генов биосинтеза ГК (Rieu et al., 2008, doi: 10.1111/j.1365-313X.2007.03356.x) или транскрипционных факторов одного семейства, регулирующих передачу фитогормонального сигнала (Lachowiec et al., 2018, doi: 10.3389/fgene.2018.00523). В нашем случае стимуляции не происходит; напротив, в линии 884А06 при отсутствии At3g11930 экспрессия At2g47710 снижается почти в 2 раза, и наоборот, в линии 036Е02, хотя экспрессия самого At2g47710 и не изменилась, зато снижается экспрессия и At3g11930, и At3g58450. Это не означает, что белки AT3G11930 и AT2G47710 не могут быть партнерами. Напротив, это указывает на некую взаимосвязь между этими белками, когда отсутствие одного из них влияет на экспрессию другого. Однако скорее всего, данные гомологи не являются функционально избыточными. Характер этой взаимосвязи позволят выяснить физиологические эксперименты с трансгенными линиями. Для проверки потенциального влияния гормонов и регуляторов роста на прорастание одиночных мутантов их семена, хранившиеся при комнатной температуре не менее чем 3 месяца, были высажены на твердую агаризованную (0,8%) половинную среду MS (1/2MS), содержащую 10 мкМ ГК4+7, 3 мкМ АБК или 5 мкМ РАС. В качестве контроля использовалась среда 1/2MS, содержащая равное по объему количество соответствующего растворителя (этанол 96% для ГК и АБК, вода дистиллированная для РАС). Семена были стратифицированы в течение 3 суток в темноте при +4оС, а затем перенесены в климатическую камеру в стандартные условия (+21оС, интенсивность освещения 100 μМ м−2 с−1, суточная периодичность освещения 16 ч света/8 ч темноты). Прорастание подсчитывали по моменту появления видимого невооруженным взглядом зародышевого корешка в течение 7 дней. Было обнаружено, что обе трансгенные линии не отличаются от дикого типа по темпам прорастания в нормальных условиях. Присутствие РАС и ГК также не вызывало никаких отличий в поведении трансгенных линий по сравнению с диким типом. Только в присутствии АБК были обнаружены небольшие отличия в прорастании: линия 036Е02 на второй день демонстрировала менее чем 10% проросших семян в присутствии АБК, в то время как у дикого типа и 884А06 проросло уже около 40% семян. Однако на третий день после окончания стратификации разница между 036Е02 и диким типом исчезала, и далее трансгенные линии вели себя аналогично дикому типу. Кроме темпов появления зародышевого корешка, важным показателем процесса прорастания являются темпы формирования семядолей. Для этого у прорастающих семян дикого типа, 884А06 и 036Е02 в течение 7 дней после окончания стратификации подсчитывали количество видимых вне семенной оболочки зеленых семядолей. Согласно полученным результатам, в темпе формирования семядолей также не фиксировалось никаких отличий по сравнению с диким типом. Таким образом, по большей части линия 884А06 не отличалась по поведению при прорастании от дикого типа, а линия 036Е02 демонстрировала лишь слабые отличия от дикого типа в присутствии АБК, которые, тем не менее, быстро исчезали со временем. Следующим этапом нашего исследования был анализ метаболизма и чувствительности к фитогормонам на уровне экспрессии генов. Для начала мы исследовали экспрессию генов 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ гиббереллинов (GAox), которые контролируют важнейшие этапы метаболизма ГК: GA20ox и GA3ox – заключительные этапы биосинтеза, а GA2ox – первую стадию инактивации биоактивных ГК. Для этого РНК из 10-дневных проростков дикого типа и трансгенных линий была выделена стандартным методом с применением TRIZol-реагента, очищена от примеси ДНК обработкой ДНКазой I и использована для синтеза кДНК. Методом qRT-PCR-анализа была исследована экспрессия ключевых генов из каждого из этих трех семейств: GA20ox1, GA3ox1, GA2ox2 и GA2ox6. Были получены данные по экспрессии важнейших генов GAox в 10-дневных проростках 036Е02 и 884А06 по сравнению с диком типом. У обеих линий снижена экспрессия GA3ox1 и увеличена экспрессия GA2ox6 по сравнению с диким типом. Экспрессия GA20ox1 подавлена у 036Е02, но не отличается от дикого типа у 884А06. Известно, что гены оксидаз ГК, в частности, GA20ox1 и GA3ox1, регулируются присутствием в среде ГК. Соответственно, по изменению их экспрессии можно косвенно судить о чувствительности растений к ГК или к их дефициту. Были получены данные по экспрессии GA20ox1 и GA3ox1 в 10-дневных проростках 036Е02 и 884А06 по сравнению с диким типом в присутствии экзогенных ГК или в условиях их дефицита в присутствии ингибитора их биосинтеза РАС: оба гена у дикого типа реагируют на присутствие ГК почти полной инактивацией. В то же время это лишь частично происходит у трансгенных линий. GA20ox1 и у 884А06, и у 036Е02 практически не изменяет свою экспрессию в ответ на присутствие ГК, а при истощении по ГК не происходит даже ожидаемого восстановления экспрессии до базового уровня. Более того, у 884А06 экспрессия GA20ox1 не только не восстанавливается, а даже наоборот, еще сильнее подавляется при дефиците ГК по сравнению с необработанным контролем. С другой стороны, классическую картину регуляции экспрессии гиббереллинами демонстрирует GA3ox1 у обеих линий. В присутствии ГК экспрессия GA3ox1 снижается аналогично дикому типу, а при дефиците ГК – индуцируется. При этом амплитуда индукции GA3ox1 даже выше у трансгенных линий, чем у дикого типа. При этом стоит отметить, что изначальный базовый уровень экспрессии GA3ox1 у обеих линий был ниже,чем у дикого типа; при этом индукция экспрессии GA3ox1 хоть и происходит интенсивнее у мутантов, чем у дикого типа, но не восстанавливается полностью до уровня дикого типа. В то же время GA20ox1, несмотря на то, что изначально экспрессировалась так же у 884А06 или хуже у 036Е02, чем у дикого типа, так и не реагирует на обработку РАС и остается на том же подавленном уровне, или подавляется еще сильнее. AT2G47710, согласно анализу базы данных IntAct, является опосредованным партнером GRUSP, в отличие от AT3G11930. Тем не менее, именно у линии 036Е02, содержащей вставку Т-ДНК в 5’-нетранслируемом регионе гена At2g47710, наблюдается наибольшее сходство с фенотипом линии grusp-115. Это выражается как в сниженном уровне экспрессии GA20ox1 и GA3ox1, так и в отставании при прорастании в присутствии АБК. Возможно, AT2G47710 как-то связан с контролем экспрессии GA20ox1, которая в трансгенной линии 036Е02 снижена по сравнению с диким типом и демонстрирует нечувствительность к обработке ГК и РАС. И, возможно, связь AT2G47710 и GA20ox1 осуществляется с участием AT3G11930, поскольку линия 884А06 с инактивированным At3g11930 демонстрирует сходное поведение GA20ox1. Однако о конкретных характеристиках этой взаимосвязи сложно судить из-за положения инсерции Т-ДНК в 5’-нетранслируемом регионе гена At2g47710 у линии 036Е02, из-за чего полной инактивации данного гена не происходит. Кроме того, нельзя исключать, что отставание 036Е02 в прорастании в присутствии АБК может быть следствием не только измененной экспрессии GAox, но и сниженной в линии 036Е02 экспрессии гена At3g58450. Таким образом, в рамках данного проекта за первый год мы впервые продемонстрировали возможную взаимосвязь USP-белков, кодируемых генами At2g47710, At3g11930 и At3g58450, в регуляции ГК-зависимого прорастания.
2 3 сентября 2020 г.-30 сентября 2021 г. Возможные механизмы вовлечения универсальных стрессовых белков в регуляцию морфологии семян и их прорастания
Результаты этапа: 1. Экспрессия генов At3g58450, At3g11930 и At2g47710 регулируется фитогормонами. Поскольку ранее нами была показана индукция экспрессии гена At3g58450 (GRUSP) при обработке АБК и связь его с АБК- и ГК-зависимой регуляцией прорастания (dx.doi.org/10.7868/S0869565218110221), cледующим этапом работы был анализ экспрессии генов его предполагаемых гомологов At3g11930 и At2g47710 по сравнению с геном At3g58450 при обработке фитогормонами. Согласно полученным результатам, все три гена обладают сходным профилем экспрессии в ответ на обработку фитогормонами, а именно: индуцируются при обработке АБК и подавляются при обработке цитокининами. При этом наиболее яркую реакцию на обработку АБК проявляет ген At3g58450: его экспрессия в ответ на 3 часа обработки 50 мкМ АБК возрастает на порядок, а спустя 24 часа обработки – на два порядка по сравнению с необработанным контролем. Такое поведение соответствует полученным ранее результатам, которые доказывают физиологическую роль At3g58450 в АБК-зависимой регуляции прорастания (dx.doi.org/10.7868/S0869565218110221). Гены At3g11930 и At2g47710 также индуцируются в ответ на обработку АБК, однако только спустя 24 часа обработки, а амплитуда ответа у этих генов менее выражена, чем у At3g58450: индукция наблюдается всего в 2-3 раза по сравнению с необработанным контролем. Кроме того, у всех трех генов реакция на цитокинины выражается в подавлении экспрессии в первые 3 часа обработки; спустя 24 часа обработки значения уровня экспрессии возвращаются к исходному уровню. Помимо сходства поведения, наблюдаются также и некоторые различия. Так, ген At3g58450 демонстрирует реакцию на присутствие предшественника этилена АЦК и ИУК: в обоих случаях наблюдается индукция экспрессии At3g58450 примерно в 2 раза спустя 24 часа обработки. Для генов At3g11930 и At2g47710 такой реакции на АЦК и ИУК не обнаруживается. Кроме этого, ген At3g58450 полностью подавляется за 24 часа в присутствии ГК, чего также не наблюдается для двух других его гомологов. Тем не менее, сходная реакция на АБК и цитокинины может быть косвенным свидетельством в пользу участия всех трех белков в одних и тех же процессах. 2. Фенотип линии 884А06 при переходе к цветению. Ранее нами было показано, что линия 115С08, несущая инсерцию Т-ДНК в гене At3g58450, проявляет фенотип отставания при переходе к цветению (https://doi.org/10.1134/S1607672921040062), сопровождающийся отклонениями в экспрессии генов гиббереллиновых оксидаз. В связи с этим был дополнительно проанализирован фенотип линии 884А06 по сравнению с диким типом при переходе к репродуктивной стадии. Согласно полученным результатам, разница между диким типом и 884А06 на стадии вегетативного развития и перехода к цветению отсутствует. В отличие от линии 115С08, отстающей в развитии в условиях длинного дня (16 часов света/8 часов темноты) примерно на 7-10 дней, растения линии 884А06 не отличаются от дикого типа ни на стадии вегетативных розеток, ни на стадии взрослых цветущих растений. Таким образом, несмотря на небольшие отличия в экспрессии генов гиббереллиновых оксидаз в проростках 884А06, инактивация гена At3g11930 в трансгенной линии 884А06 не повлияла на фенотип ни при прорастании, ни при переходе к цветению. 3. Получение двойных мутантов, несущих инсерции Т-ДНК в генах At3g58450 и At3g11930. Поскольку линия 036Е02 содержит инсерцию Т-ДНК в области промотора гена At2g47710, и эта инсерция не повлияла на уровень его экспрессии, то эту линию для получения двойных мутантов не использовали. В качестве материнских растений для скрещивания использовали следующие линии: 115С08 и 884А06. Кроме этого, для скрещивания была получена из коллекции SALK Европейского исследовательского центра NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, Великобритания) гомозиготная линия SALK_067681C (NASC ID: N656610), несущая инсерцию Т-ДНК в кодирующей области гена At3g11930. Эта линия несет кассету устойчивости к канамицину, в отличие от линий коллекции GABI-Kat, несущих кассету устойчивости к сульфадиазину. Скрещивание линий, устойчивых к различным антибиотикам, облегчает отбор мутантов впоследствии. Таким образом, использование этих линий позволяет получить двойные мутанты, несущие инсерции Т-ДНК одновременно в генах At3g58450 и At3g11930. Скрещивание было поставлено по следующей схеме: (1) f 884A06 X m 115C08; (2) f 115C08 X m 884A06; (3) f SALK_067681C X m 115C08; (4) f 115C08 X m SALK_067681C, где f – материнское растение (female), а m – отцовское растение (male). Реципрокные скрещивания позволяют выявить фенотипические отклонения, которые могут наследоваться строго по материнской или по отцовской линии. Скрещивание двух линий GABI-Kat (884А06 и 115С08) является не очень удобным для последующего отбора мутантов, так как отцовское и материнское растения несут кассеты устойчивости к одному и тому же антибиотику. Однако мы все равно провели это скрещивание, поскольку для линий SALK распространено явление «замалчивания» кассеты устойчивости к канамицину, и в таком случае получение двойных мутантов может осложниться. Семена поколения F1 были собраны и высажены на селективную среду, содержащую антибиотики: для потомства скрещиваний 1 и 2 – сульфадиазин в концентрации 4,5 мг/мл, а для потомства скрещиваний 3 и 4 – сульфадиазин в концентрации 4,5 мг/мл и канамицин в концентрации 25 мг/мл. В результате работы были проведены скрещивания и получены гетерозиготные растения F1, несущие инсерции Т-ДНК одновременно в генах At3g58450 и At3g11930 (см. Методы и подходы). Фенотипически эти растения не отличались от дикого типа. Семена поколения F2 были собраны для дальнейшего отбора. К сожалению, в связи с длительными ограничениями, вызванными пандемией короновируса, закончить отбор гомозиготных двойных мутантов в срок не удалось. Однако работа в этом направлении ведется и растения будут получены и охарактеризованы в дальнейшем. 4. Поиск других генов USP-белков, которые регулируются фитогормонами. Согласно работам Kerk et al., 2003 и Bhuria et al., 2019, у Arabidopsis обнаружено около 50 генов различных USP-белков. Поскольку гены At3g58450, At3g11930 и At2g47710 проявляют реакцию на обработку фитогормонами, нами был дополнительно предпринят поиск других генов USP-белков, которые потенциально могут регулироваться фитогормональными воздействиями. Это могло бы дать информацию о возможной функциональной активности других членов семейства USP-белков с перспективой дальнейшего исследования их функций и расширения представлений о роли USP-белков в растениях. На основании информации, опубликованной в материалах базы данных по транскриптомному анализу eFP Browser, были выбраны 12 генов USP-белков, которые демонстрируют реакцию как минимум на два фитогормона. Экспрессия этих генов была проанализирована в двухнедельных проростках дикого типа в ответ на обработку различными фитогормонами. Большинство из анализируемых генов реагирует на присутствие в среде АБК. Однако только у 3 генов (At1g77280, At2g21620, At5g47740) экспрессия возрастает по мере увеличения времени обработки, в то время как у двух генов (At3g53990 и At3g62550) индукция наблюдается только в первые 3 часа обработки, но спустя 24 часа уровень их экспрессии возвращается к прежним значениям. По амплитуде ответа на АБК выделяется ген At5g47740. Его экспрессия в ответ на обработку 50 мкМ АБК возрастает на 1-2 порядка по сравнению с необработанным контролем. Остальные гены изменяют свою экспрессию примерно в 2-3 раза по сравнению с необработанным контролем. Поскольку АБК играет важную роль при формировании устойчивости к абиотическим воздействиям, наблюдаемая у генов USP-белков реакция на АБК вполне ожидаемая и подтверждает ранее полученные данные, демонстрирующие важную роль растительных белков USP в условиях стресса. Интересно, что ген At3g13690 демонстрирует не типичное для USP-генов двукратное снижение уровня транскриптов после 24 часов обработки АБК. Согласно материалам базы данных eFP Browser, транскрипты этого гена отсутствуют в сухом семени, но появляются при прорастании. Возможно, белок AT3G13690 также задействован в фитогормон-регулируемом выходом семени из состояния покоя. Обработка АЦК выявила три гена чувствительных к этилену: два из них, At3g25930 и At3g62550 индуцировались в первые 3 часа обработки, а ген At5g47740 – спустя 24 часа. Реакция этих генов согласуется с ролью USP-белков в формировании устойчивости к стрессу и подтверждается ранее опубликованными результатами. Так, At3g62550 индуцируется в стареющих листьях (Gepstein et al., 2003, doi:10.1046/j.1365-313X.2003.01908.x), а At5g47740 экспрессируется в корнях в ответ на присутствие в среде неорганического фосфата (Bari et al., 2006, doi:10.1104/pp.106.079707), что соответствует роли этилена в процессах старения листьев и роста корня при фосфорном голодании (Gepstein et al., 2003, doi:10.1046/j.1365-313X.2003.01908.x, Song et al., 2015, doi:10.3389/fpls.2015.00796). Интересно, что в присутствии метилжасмоната среди изученных USP-генов индуцируется только ген At5g47740. Поскольку метилжасмонат участвует в регуляции роста корня (Adams et al., 2010, doi:10.1093/jxb/erq240), это может быть связано с упомянутой выше индукцией At5g47740 в корнях в присутствии неорганического фосфата. При этом в данной постановке эксперимента на проростках отсутствует реакция гена At3g62550, однако существуют данные о его участии в МЖ-регулируемом развитии тычинок (Mandaokar et al., 2003, doi:10.1023/a:1025045217859). Возможно, остальные гены USP-белков не проявили предсказанной реакции на МЖ при обработке проростков по той же причине, поскольку их ответ на обработку может зависеть от реализации специфических программ развития. Салициловая кислота не вызывает заметных отклонений в экспрессии выбранных генов USP-белков. Также и обработка ГК практически не влияет на экспрессию выбранных генов: для пяти генов (At1g11360, At3g01520, At3g17020, At5g14680, At5g63940) мы не обнаружили предсказанную в ходе анализа транскриптомов реакцию на обработку. Однако согласно материалам базы данных eFP Browser, транскрипты ряда генов, экспрессия которых анализировалась в данном исследовании (At1g11360, At1g77280, At3g53990, At5g47740), накапливаются в сухих семенах. Поскольку ГК являются одним из ключевых факторов, контролирующих прорастание, ГК-зависимая регуляция экспрессии этих генов может проявляться не на стадии двухнедельных проростков, как в данном исследовании, а непосредственно при набухании и прорастании семени. При обработке проростков ауксином реакция наблюдается только для гена At1g77280. В этом случае наблюдается небольшое подавление только в первые 3 часа обработки. Спустя 24 часа уровень транскрипции At1g77280 возвращается к исходным значениям. При этом согласно опубликованным данным этот ген относится к ауксин-индуцибельным генам (Goda et al., 2004, doi:10.1104/pp.103.034736). Среди гормонов, ассоциированных с ростом и развитием в стандартных нестрессовых условиях, обработка транс-зеатином приводит к небольшому снижению уровня транскриптов большинства генов в первые 3 часа обработки, однако спустя 24 часа возвращается в норму. По материалам результатов, полученных в результате выполнения проекта, подготовлен текст научно-квалификационной работы, которая прошла защиту на биологическом факультете МГУ. Текст НКР представляет собой основу для текста диссертации. Диссертация будет представлена на защиту в течение ближайшего года.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".