ИСТИНА

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) лежит в основе патогенеза многих заболеваний, среди которых можно выделить атеросклероз, поражение ЦНС (болезни Паркинсона, Альцгеймера и Хантингтона), воспалительные процессы любого генеза и прочие. Для защиты от ПОЛ в системах in vivo недавно был предложен подход, основанный на использовании значительного изотопного эффекта в скорость-лимитирующей цепной реакции ПОЛ. Для этого предлагается использовать полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), содержащие атомы дейтерия вместо протонов в бис-аллильных положениях (D-ПНЖК), что приводит к эффективному подавлению ПОЛ при неизменности обычных химических свойств жирных кислот. В экспериментальных моделях нескольких нейродегенеративных заболеваний у мышей было продемонстрировано значительное подавление развития симптомов при введении в пищу D-ПНЖК. В клетках дрожжей при окислительном стрессе наличие менее 20 % D-ПНЖК от общего количества ПНЖК приводило к полной остановке ПОЛ. Механизм такого сильного подавления ПОЛ на настоящий момент неясен. Целью проекта является выяснение механизма защитного действия дейтерированных полиненасыщенных жирнокислотных остатков в составе фосфолипидов, образующих бислойные липидные мембраны, в условиях индукции ПОЛ. Для достижения поставленной цели планируется количественно оценить защитное действие фосфолипидов, содержащих D-ПНЖК, при индукции ПОЛ как по их влиянию на образование диеновых коньюгатов в липосомах, так и по их влиянию на вызванную ПОЛ пермеабилизацию липосом. Предполагается сравнить протекторное действие D-ПНЖК по отношению к ПОЛ в липосомах с влиянием D-ПНЖК на индуцированную ПОЛ проводимость плоской бислойной липидной мембраны. Планируется изучить зависимость порогового действия D-ПНЖК от вида использованного ПНЖК. Для выяснения взаимосвязи повреждающего действия ПОЛ на встроенные в мембрану белки с протеканием ПОЛ в липидной части бислоя, планируется изучить влияние D-ПНЖК на фотодинамическую инактивацию ионных каналов, образуемых пептидом грамицидином А.

Lipid peroxidation (LPO) underlies the pathogenesis of many diseases, including atherosclerosis, CNS damage (Parkinson's, Alzheimer's and Huntington's diseases), inflammatory processes of any genesis and others. To protect in vivo systems against LPO, an approach using a significant isotope effect in the rate-limiting LPO chain reaction has recently been proposed. In particular, it is suggested to use polyunsaturated fatty acids (PUFA) containing deuterium atoms instead of protons at bis-allylic positions (D-PUFA), which leads to effective suppression of LPO. In experimental models of several neurodegenerative diseases in mice, a significant suppression of development of the disease symptoms has been observed upon administration of D-PUFA. The presence of less than 20% D-PUFA of the total PUFA amount has resulted in complete blocking of LPO in yeast cells under oxidative stress. The mechanism of such a strong suppression of LPO is currently unclear. The aim of the project is to elucidate the mechanism of the protective effect of deuterated polyunsaturated fatty acyl residues of phospholipids forming bilayer lipid membranes upon the LPO induction. To achieve this goal, the protective effect of the D-PUFA-containing phospholipids will be quantitatively evaluated both by a decrease in the formation of diene conjugates in liposomes and by suppression of the LPO-induced liposome permeabilization. The antioxidant effect of D-PUFA, found previously in vivo, is expected to be confirmed for LPO in model membrane systems, such as liposomes and planar lipid bilayers. It is planned to study the dependence of the threshold action of D-PUFA on the type of PUFA used. To clarify the relationship of the damage caused by LPO to membrane proteins with LPO proceeding in the lipid part of the bilayer, it is planned to study the impact of the D-PUFA-containing phospholipids on the photodynamic inactivation of ion channels formed by gramicidin A.

1. Ожидается установить протекторное действие дейтерированных полиненасыщенных жирных кислот (D-ПНЖК) в условиях индукции ПОЛ в липосомах при фотодинамическом воздействии. 2. Планируется получить зависимость % порогового действия D-ПНЖК от вида использованного ПНЖК на примере липидов, содержащих остатки дейтерированной линолевой, линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой или докозагексаеновой кислоты. 3. Планируется установить зависимость протекторного действия D-ПНЖК от вида индукции перекисного окисления липидов на примере сравнения индукции ПОЛ комбинацией железа с аскорбатом и генерации синглетного кислорода при фотодинамическом воздействии. 4. Планируется изучить зависимость защитного действия D-ПНЖК от вида фотосенсибилизатора, используемого при фотодинамическом воздействии. 5. Планируется выявить взаимосвязь повреждающего действия ПОЛ на мембранные белки с протеканием ПОЛ в липидной части бислойной мембраны на примере измерения активности каналоформера грамицидина А в липидном бислое в присутствии H-ПНЖК и D-ПНЖК, которые будут входить в липидный бислой, окружающий ионный канал. Это позволит понять причины высокой эффективности защитного действия дейтерированных жирных кислот и обосновать применение D-ПНЖК в лечении большого числа болезней, связанных с протеканием ПОЛ.

Проведенное нами ранее исследование ингибирования фотодинамической инактивации грамицидина двойными связями жирнокислотных цепей липидов [Rokitskaya et al., Biochemistry (Moscow), 2015] выявило зависимость степени защиты каналообразующего пептида грамицидина А от глубины расположения фотосенсибилизатора в липидной мембране. В недавней работе [Belykh et al., Russian Chemical Bulletin, 2018] нами проведено сравнительное изучение фотогемолиза эритроцитов и фотоповреждения липосом, сенсибилизируемых производными хлорофилла а. В работе нашей лаборатории по исследованию фотодинамической инактивации бактерий [Omarova et al., PLOS ONE, 2015] руководителем настоящего проекта оценивалась эффективность борированного производного хлорина е6 как фотосенсибилизатора в системе индукции вытекания красителя карбоксифлуоресцеина из липосом по сравнению с хлорином е6. Нам удалось показать, что пероксидазная активность цитохрома с, приобретаемая этим белком при взаимодействии с кардиолипином, вызывает пермеабилизацию мембран липосом. Этот процесс наблюдается при условии, что и кардиолипин, и окружающий его липид содержат ненасыщенные жирнокислотные остатки. Нами было установлено, что агенты, подавляющие пероксидазную активность цитохрома с, ингибируют индукцию пермеабилизации липосом под действием комбинации цитохрома с с перекисью водорода [Firsov et al., 2015]. В ходе этого исследования нами был разработан и успешно применен метод измерения пермеабилизации липосом на основе флуоресцентной корреляционной спектроскопии с применением красителя сульфородамина Б. Путем сравнения поведения различных флуоресцентных маркеров при окислительном стрессе нами был выбран кальцеин как наиболее подходящий флуоресцентный краситель для наблюдения вытекания из липосом по разгоранию флуоресценции [Firsov et al., Anal. Biochem. 2018].