Двойные конъюгаты цитостатических и гормональных препаратов с лигандами ПСМА - новый подход к комбинированной химиотерапии рака предстательной железыНИР

Cytostatic and hormonal double drug conjugates with PSMA ligands - new approach for combination therapy of prostate cancer

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 2 декабря 2019 г.-1 декабря 2020 г. Двойные конъюгаты цитостатических и гормональных препаратов с лигандами ПСМА - новый подход к комбинированной химиотерапии рака предстательной железы
Результаты этапа: Одной из основных задач проекта на первом этапе было разработка методов синтеза и получение серии лигандов простатического специфического мембранного антигена (ПСМА) на основе мочевины глутаминовой кислоты и лизина для создания на их основе двойных конъюгатов с терапевтическими агентами гормонального и цитостатического действия. А также, их дальнейшее биологическое исследование in vitro путем оценки ингибирования реакции расщепления N-ацетил-аспартил-глутамата, для выявления наиболее аффинных к ПСМА соедеинений.1 За основу лигандов была взята мочевина DCL, содержащая различные заместители в ароматическом фрагменте при атоме азота лизина (Рисунок 1). Данный выбор основан на ранее проведенных исследованиях, показавший, что такая структура способствует высокой аффинности к активному центру ПСМА.2 Рис 1. Структура вектор-молекулы ПСМА, взятой за основу новой серии лигандов Представленный на рисунке фрагмент представляет собой трет-бутил защищенный лиганд ПСМА на основе мочевины с различными заместителями в ароматическом фрагментом при атоме азота лизина. Также в структуру уже включена алифатическая часть линкера из фрагментов 6-аминогексановой кислоты и янтарного ангидрида, с помощью которого вводились фрагменты дипептидных цепочек, путем образования амидной связи (Рисунок 2). Рис 2. Общая структура лиганда. Зелѐным цветом выделена вектор-молекула на основе мочевины с ароматическим фрагментом при атоме азота лизина, заместители в котором будут варьироваться. Красным цветом выделена дипептидная цепочка на основе фенилаланина или тирозина. Синтез фрагмента вектор-молекулы на основе мочевины проводился по ранее отработанным методикам и включает в себя пять стадий (Рисунок 3).2 Рис 3. Синтез вектора с различными заместителями в ароматическом фрагменте при атоме азота лизина, селективно связывающегося с ПСМА Синтез лигандов ПСМА с фенилаланил-фенилаланиновым пептидным фрагментом Анализ литературных данных показал, что наличие ароматических фрагментов в линкере может способствовать повышению аффинности лиганда к мишени за счет гидрофобных взаимодействий.3,4 В связи с этим нами было принято решение синтезировать два дипептидных фрагмента на основе природных аминокислот L- фенилаланина и L-тирозина. Для выбора оптимальной синтетической схемы был проведѐн анализ литературы, так как существует довольно широкий спектр методов создания аминоксилотных последовательностей. Литературные источники свидетельствует о том, что одним из наиболее эффективных методом получения короткоцепочечных пептидов является RPPS (rapidrepetitive solution-phase synthesis) – метод повторяющегося синтеза пептидов в жидкой фазе.5 Данный подход состоит в использовании активированных эфиров карбоновых кислот, селективно образующих амидную связь. В качестве активаторов используют различные реагенты: N-гидроксисукцинимид (NHS), галогенпроизводные фенола, например пентафторфенол (PfpOH), производные бензотриазола (HOBt, HBTU, PyBOP) и другие. Существует большое количество методик постановки защитных групп в аминокислотах. В современной химии наибольшее распространение получили две основные защитные функции аминогруппы: Boc и Fmoc.6,7 В нашем случае была выбрана Boc-защита, так как снятие этой группы происходит на последней стадии в кислой среде. Fmoc-защита снимается в присутствии сильного основания, например пиперидина, что может привести к протеканию побочных реакций, например переаминирования амидных групп в целевом соединении, а также затруднить выделение конечного продукта синтетической цепочки. Первоначально проводилась реакция постановки Boc-защитной группы на амино- группы L-Phe с помощью ди-трет-бутил дикарбоната. В результате было получено соединение 7 с выходом 95% (Рисунок 4). Рис 4. Схема реакции постановки Boc-защитной группы Реакция не требовала дополнительных методов очистки, чистоту анализировали с помощью ВЭЖХ-МС. В спектре 1Н ЯМР наблюдался удвоенный набор сигналов, связанный с заторможенным вращением вокруг амидной связи. На втором этапе был получен дипептид L-Phe-L-Phe 8a. Для этого использовали реагенты EDC-Cl (гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимида) и PfpOH (пентафторфенол). В результате получался промежуточный активированный эфир, который селективно взаимодействует с амино-группой L-фенилаланина и является устойчивым к гидролизу. Особенностью данного синтеза является отсутствие необходимости в колоночной хроматографии. Продукт 8a был выделен с помощью последовательного осаждения реакционной смеси в петролейном эфире с использованием УЗИ-диспергирования. После этой процедуры было получено соединение, обладающей достаточной чистотой (100% в положительном режиме, 96% в отрицательном режиме по результатам ВЭЖХ-МС) для следующей стадии синтеза. Также на данном этапе была проведена оптимизация условий проведения реакции. Были использованы три реагента для получения активированного эфира l-фенилаланина. В качестве активаторов использовали PfpOH, N-гидроксисукцинимид (NHS) и 4-диметиламинопиридин (DMAP). В результате было выявлено, что пентафторфенол позволяет получить соединение 8a с наибольшим выходом (таблица 1). Таблица 1. Подбор оптимального реагента для проведения синтеза дипептида 8a. Реагент Выход соединения 8a, % PfpOH 58 NHS 46 DMAP 27 В оптимизированных условиях был получен дипептид L-фенилаланил-L-тирозин с использованием пентафторфенольного эфира L-фенилаланина. Реакция так же не требовала дополнительных методов очистки и соединение 8b было получено с выходом 58% (Рисунок 5). Рис 5. Схема реакции получения дипептидов 8a и 8b. На третьем этапе повторно была осуществлена активация карбоксильной группы дипептидов с последующим взаимодействием с 3-азидопропиламином 9. 3- азидопропиламин получали из гидробромида 3-бромпропиламина взаимодействием с азидом натрия по механизму SN2-замещения с выходом 49%. На данном этапе по результатам оптимизации (таблица 2) были использованы HBTU и HOBt. На этапе оптимизации были использованы полуторакратные избытки HBTU и EDC. В результате были получены модифицированные соединение 10a и 10b с выходами 75% и 66% соответственно (Рисунок 6). Рис 6. Схема получения 3-азидопропиламина и модифицированных дипептидов 10a и 10b. Таблица 2. Подбор оптимальных активирующих реагентов для синтеза соединения 10a. Реагент Выход соединения 10a, % PfpOH, EDC-Cl 55 HBTU, HOBt 75 Выделение соединений 10a и 10b проводили с помощью колоночной хроматографии в системе петролейный эфир:этилацетат. Структура продукта контролировалась методами ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрией. На последнем этапе проводили удаление Boc-защиты в 10% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане. На примере соединения 10a было оптимизировано время проведения реакции (таблица 3). Результаты оптимизации показали, что защита удаляется полностью в течение 5 часов, и нет необходимости выдерживать реакционную в смесь в течение 16 часов. Таблица 3. Подбор оптимального времени проведения реакции удаления защитной группы. Время проведения реакции, ч Выход соединения 11a, % 6 81 16 75 В результате были получены соединения 11a и 11b (Рисунок 7). После удаления растворителя, продукт высадили диэтиловым эфиром. Осадок трижды промыли диэтиловым эфиром. Строение продуктов подтверждено методами ЯМР-спетроскопии, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрией высокого разрешения. Чистоту соединений анализировали с помощью ВЭЖХ-МС. Рис 7. Схема удаления Boc- защитной группы. В основе пути синтеза лигандов 12a–12k лежит реакция создания между пептидным фрагментом и вектором амидной связи. В качестве катализаторов используются реактивы, приводящие к образованию активированных эфиров, которые селективно реагируют с амино-группой аминокислот.5 Аддукты с янтарным ангидридом 6a-6k были введены в реакцию с дипептидным фрагментом 11a в присутствии HBTU, HOBt и DIPEA. Таким образом в этих условиях были получены соединения 12a–12k (Рисунок 8). Рис 8. Схема реакции получения трет-бутилированных лигандов. Выделение соединений проводилось с помощью метода колоночной хроматографии в системе хлористый метилен: метанол (Interchim Puriflash 15μ 25g, от 3% метанола до 15% метанола за 20 минут, скорость потока – 20 мл/мин). Структура подтверждалась методами ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения. Чистота продуктов анализировалась с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. В дальнейшем было проведено удаление трет-бутильных защитных групп, т.к. для проявления активности в отношении ПСМА лиганды должны иметь свободные карбоксильные группы, которые обуславливают взаимодействие с белковой мишенью. Данное превращение осуществлялось в кислых условиях с трифторуксусной кислотой. Таким образом, были получены соединения 13a-13k (Рисунок 9). Рис 9. Схема реакции удаления трет-бутильных групп и получения лигандов. Очистка лигандов от примесей осуществлялась с помощью метода обращено- фазовой хроматографии в элюирующей системе вода: ацетонитрил (Interchim PuriflashC18 35g, от 25% ацетонитрила до 100% ацетонитрила в течение 20 минут, скорость потока – 20 мл/мин). Полученные вещества были охарактеризованы с помощью таких методов, как ЯМР-спектроскопия, ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия высокого разрешения. Чистота лигандов анализировалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Стоит отметить, что в случае соединения 13h целевое соединение не было выделено. В спектре 1Н ЯМР отсутствовали сигналы синглетной формы на 3.76-3.78 м.д., которые соответствовали метокси-группам, и мультиплет на 7.03 м.д., соответствующий ароматическим протонам заместителя при амино-группе лизина. Анализ результатов ВЭЖХ выявил наличие основного пика с моноизотопной массой 908,30. На основании анализа спектров было предложено строение для продукта реакции удаления трет- бутильной защиты 13h-1 (Рисунок 10). Рис 10. Предполагаемое строение для продукта реакции 13h-1. Вероятно, наличие сильных донорных заместителей в положении 2-, 4- и 6- в бензольном кольце заместителя при амино-группе лизина приводит к его отщеплению в кислых условиях, т.к. в кислых условиях образуется стабилизированный карбокатион. Предположительный механизм данного превращения приведен на Рисунке 11. Рис 11. Предполагаемый механизм образования соединения 13h-1. Таким образом, были получены 11 новых лигандов ПСМА содержащих терминальную азидо-группу – прекурсоров для синтеза конъюгатов ПСМА. Полученные лиганды были охарактеризованы методами 1H и 13C ЯМР-спектроскопии, ИК- спектроскопии и масс-спектрометрией высокого разрешения. Для всех лигандов были проведены in vitro исследования аффинности к ПСМА, по результатам которых (Таблица 4) был выбран лиганд-лидер 13g для дальнейших исследований. Из данных видно, что лиганд, содержащий карбоксильную группу в ароматическом фрагменте при атоме лизина, имеет аффинность, сопоставимую, хоть и уступающую, известным ранее лигандам, содержащим в этом фрагменте хлор и бром. BA-315.001.001.1r.esp 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shif t (ppm) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 Normalized Intensity 1.55 2.43 0.62 9.76 1.66 1.97 2.00 2.15 6.60 4.43 2.38 1.13 2.70 4.01 1.01 1.08 0.03 2.43 6.00 4.54 Ацетонитрил Вода 8.33 8.32 8.19 7.96 7.93 7.91 7.88 7.86 7.59 7.57 7.29 7.27 7.26 7.23 7.21 7.19 7.16 7.15 6.34 6.32 6.30 6.28 4.60 4.53 4.38 4.32 4.37 4.07 4.03 3.77 3.37 3.22 3.21 3.16 3.20 3.05 3.04 3.03 2.92 2.91 2.89 2.67 2.64 2.50 2.49 2.36 2.23 2.49 2.21 2.06 1.89 1.69 1.58 1.57 1.56 1.51 1.49 1.47 1.44 1.39 1.22 Рис 12. Спектр ЯМР 1H соединения 13g (400 МГц, ДМСО-d6, δ, м.д.) Синтез лигандов ПСМА с фенилаланил-тирозиновым пептидным фрагментом По результатам ранее полученных экспериментальных данных, было известно, что введение тирозинового фрагмента в дипептидный фрагмент линкера часто способствует улучшению аффинности лигандов к ПСМА. На основании данного эмпирического заключения нами было принято решение синтезировать лиганд, содержащий в качестве дипептидной части линкера последовательность L-Phe-L-Tyr и карбоксильную группу в пара-положении ароматического фрагмента при атоме азота лизина. Соединение 12l было получено по результатам реакции между соединением 6g и дипептидным фрагментом 11b в присутствии HBTU, HOBt и DIPEA с выходом 23%. Низкий выход связан с потерями во время проведения очистки соединения. Соединение было выделено с помощью метода колоночной хроматографии с элюентом хлористый метилен:метанол. Чистота соединения была подтверждена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, а структура подтверждалась с помощью ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Далее провели удаление трет-бутильных защит под действием 10% трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Таким образом, было синтезировано соединение 13l. Очистка лигандов от примесей осуществлялась с помощью метода обращено-фазовой хротомаграфии с элюирующей системе вода:ацетонитрил (Interchim PuriflashC18 15μ 35g, от 25% ацетонитрила до 100% ацетонитрила за 20 минут, скорость потока – 20 мл/мин). Полученные вещества были охарактеризованы с помощью таких методов, как 1H и 13C ЯМР-спектроскопия, ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия высокого разрешения. Чистота лигандов анализировалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. In vitro исследование аффинности лигандов ПСМА Для полученных лигандов была исследована аффинность к ПСМА методом анализа ингибирования реакции расщепления N-ацетил-аспартил-глутамата. Целью исследования было показать, насколько полученные лиганда хорошо взаимодействуют с ПСМА, и выбрать наиболее афинный лиганд. Результаты исследования представлены в таблице 4. Таблица 4. Результаты определения параметра аффинности IC50 для соединений 13a-13l. № Соединение IC50, нM 13a X1 = X2 = X4 = H, X3 = NO2, R=H 35±12 13b X1 = X4 H, X2 = X3 = OCH3, R=H 88±30 13c X2 = X3 = X4 = H, X1 = NO2, R=H 16±3 13d X1 = X2 = X4 = H, X3 = OCH3, R=H 112±38 13e X1 = X2 = X4 = H, X3 = OC2H5, R=H 51±9 13f X2 = X3 = X4 = H, X1 = OCH3, R=H 38±8 13g X1 = X2 = X4 = H, X3 = COOH, R=H 7±2 13i X1 = X3 = X4 = H, X2 = NO2, R=H 23±9 13j X2 = X3 = H, X1 = X4 = OCH3, R=H 23±4 13k X1 = X2 = X4 = H, X3 = OH, R=H 24±6 13l X1 = X2 = X4 = H, X3 = COOH, R=OH 19±5 А X1 = X2 = X4 = H, X3 = Br, R=OH 17±6 B X1 = X3 = X4 = H, X2 = Cl, R=OH 9±3 DCL - 2149±223 Рис 13. Структура лиганда DCL и общая структура исследованных лигандов ПСМА. Все модифицированные лиганды были более активны, чем DCL (Рисунок 13). Из этого можно сделать вывод, что ароматические заместители при амино-группе лизина и их наличие в линкере многократно увеличивают селективность ингибитора. Однако полученные соединения, за исключением лиганда с карбоксильной функцией в пара- положении, уступали ранее исследованным лигандам, содержащим хлор или бром в ароматическом фрагменте при атоме азота лизина и тирозин в пептидной части линкера. Неудовлетворительный результат показали лиганды с ди-метокси бензильным заместителям и различные алкокси-замещенные производные. Также был произведен скрининг активности лигандов в зависимости от положения заместителя на примере нитро-замещенной серии лигандов. По результатам, очевидно, что замещение по орто- положению (IC50 = 16±3 нМ) дает лучший результат по сравнению с мета- (IC50 = 23±9 нМ) и пара-положением (IC50 = 35±12 нМ). Если сравнить активности 4-гидрокси и 4-метокси производных, то можно сделать вывод о том, что свободная гидроксильная группа повышает связывание с мишенью, по сравнению с метиловым эфиром. Наибольшую активность показал лиганд, содержащий свободную карбоксильную группу в пара-положении (IC50 = 7±2 нМ). Данный лиганд был выбран как наиболее перспективный для оптимизации структуры и последующих исследований. Не смотря на то, что наше предположение о том, что введение тирозина в пептидный фрагмент линкера позволит увеличить аффинность лиганда, не подтвердилось, и лиганд 13l уступает лиганду 13g в аффинности, нами было принято решение продолжить изучение обоих соединений, как крайне перспективных. Таким образом, на основе лигандов 13l, 13g, а также ранее изученных A и B (Рисунок 13), было принято решение синтезировать новые лиганды ПСМА для создания в последствии двойных конъюгатов. Также в качестве структурного мотива для создания двойных конъюгатов были выбраны лиганды А и B, также обладающие высокой аффинностью к ПСМА Протокол проведения измерения ферментативной активности ПСМА. LNCaP – андроген-чувствительная клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками, растут в виде агрегатов и одиночных клеток. ПСМА-положительные. Клетки линии LNCaP культивировались в среде RPMI с 10% FBS (Gibco), 1хGlutamax (Gibco) и 1х смесью пенициллин-стрептомицин (Gibco). Для суспендирования клеток с 25 см2 флакона убирали культуральную среду, промывали клетки буфером PBS и инкубировали 5 минут с 0,25% трипсином (1 мл). Трипсин инактивировали полной культуральной средой (2 мл), промывали PBS, переносили 106 клеток в пробирку и добавляли 500 мкл лизирующего буфера (0,5% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1x Proteinase Inhibition cocktail). Суспензию инкубировали 30 минут во льду и обрабатывали ультразвуком (7 раз по 7 секунд с интервалами 20-30 секунд) во льду во избежание перегрева. Центрифугировали 10 мин 1000g на 4°C и надосадочный раствор использовали в дальнейшем анализе. Анализ ингибирования препаратами ПСМА проводился по нерадиоактивному протоколу с детекцией высвобождаемого в ходе реакции глутамата. Экстракт клеток линии LNCaP (10 μL) смешивался с 2 μL препарата соответствующего разведения. Для первичного тестирования использовалась серия разведений препаратов 2 нМ-100 мкМ с шагом разведения 3-5 раз. К полученной смеси добавлялся 1 μL 100 μM раствора NAAG. Полученная смесь инкубировалась 2 часа при 37°C. После инкубации смесь разводилась вдвое реакционным буфером (13 μL) из набора Amplex Red Glutamic Acid Kit (Molecular Probes Inc., Eugene) и добавлялась многокомпонентная реакционная смесь для детекции глутамата, приготовленная в соответствии с протоколом производителя (26 μL). Рабочий раствор Amplex Red: 5 мкл Amplex® Red reagent stock solution, 1,25 мкл HRP stock solution, 8 мкл L-glutamate oxidase, 2,5 мкл L-glutamate–pyruvate transaminase, 0,5 мкл Lalanine, 483 мкл 1X Reaction Buffer. Проводилась инкубация 1 час при 37°C. Флуоресценция резоруфина, полученного в результате сопряженных реакций глутамат- детектирующего набора детектировалась на планшетном мультидетекторе VICTORX5 (Perkin Elmer Inc.) при длине возбуждения 555 нм и детекции при 580 нм. В качестве контроля эндогенного уровня глутамата с заменой раствора NAAG на воду. Синтез лигандов ПСМА для двойных конъюгатов С целью получения двойных конъюгатов, содержащих два структурных фрагмента и абиратерона (или энзалутамида или др.), и доцетаксела (или монометилауристатина Е (ММАЕ) или др.), была разработана синтетическая схема получения лигандов ПСМА, позволяющего провести модификацию с помощью двух терапевтических агентов. Для этой цели в структуру лиганда был введен фрагмента L-лизина, наличие амино-группы в которой позволяет провести дополнительную модификацию с использованием активированных сложных эфиров карбоновых кислот. В структуру такого лиганда входит фрагмент трипептида, L-фенилаланин, L-тирозин и L-лизин. L-лизин был введен в структуру фрагмента для дальнейшего получения амидной связи между линкером и модифицированным противоопухолевым препаратом. Общая структура лигандов для получения двойных конъюгатов представлена на Рисунке 14. Рис 14. Структура лиганда для синтеза двойного конъюгата. В основу получения данных лигандов легла синтетическая схема, основанная на создании по отдельности векторных фрагментов (Рисунок 15) и частей линкера пептидной природа, а затем их соединение посредством создания амидной связи. Рис 15. Структура векторных фрагментов 5g, 16 и 17. Для синтеза трипептидного фрагмента использовался метод твердофазного пептидного синтеза (SPPS). Данный метод основан на модификации полимерной смолы путем последовательного наращивания аминокислотной последовательности до получения необходимого продукта.8 Для синтеза лигандов 20a-20d использовалась стандартная Fmoc/tBu стратегия синтеза, т.к. удаление Fmoc-защитной группы проходит в присутствии основания (20% раствор пиперидина) и в данных условиях защитные группы боковых цепей (t-Bu, Boc) не являются лабильными. В качестве полимерной смолы использовалась хлорид 2-хлортритильной смолы (CTC). Ее основные преимущества состоят в быстрой и свободной от рацемизации реакции образования эфира с первым аминокислотным остатком, подавление образования дикетопиперазина во время проведения реакции с первой аминокислотой, снятие полученного полипептида или его производного со смолы производится в мягких слабокислых условиях, что позволяет избежать удаления защитных групп боковых цепей.9 Предварительно была произведена активация смолы с использованием 5% раствора хлористого тионила в диметилформамиде (ДМФА) в дихлорметане течение 4 часов при 37 оС.10 Далее проводили реакцию иммобилизации первой аминокислоты Fmoc-L-Lys(Boc)- OH на активированной смоле в присутствии DIPEA в ДМФА (Рисунок 16). Для проведения реакции использовали двукратный избыток аминокислоты. Рис 16. Схема реакции иммобилизации аминоксилоты на активированной смоле. После проведения реакции был проведен опыт по определению степени загрузки аминокислоты на смолу. Для этого отобрали навеску смолы массой 10 мг и удалили Fmoc- защиту в 20% растворе 4-метилпииперидина в ДМФА. В данных условиях происходит удаление Fmoc-защиты и образуется дибензофульвен, который реагирует c пиперидином (Рисунок 17). Рис 17. Механизм удаления Fmoc-защитной группы. Полученный аддукт имеет максимум поглощения при длине волны 301 нм (ε = 7800 л*моль-1*см-1), по поглощению которого при 301 нм можно судить о степени загрузки аминокислоты на смолу. Исходя из формулы расчета загрузки смолы (Рисунок 18) было получено, что загрузка смолы составила 1,28 ммоль/г.11 Рис 18. Формула расчета загрузки смолы (L), где A301 – поглощение раствора при 301 нм, V – объем раствора пиперидина в ДМФА, d – степень разбавления, Ec – коэффициент экстинкции, w – длина оптического пути кюветы, M – масса образца смолы. Далее последовательно провели реакции с трет-бутил L-тирозином и L- фенилаланином. На каждом этапе использовался двукратный избыток аминокислоты. Особенностью применения 2-хлортритильной смолы является возможность снятия полипептидной цепи без удаления кислотно-лабильных групп, таких как t-Bu, Boc, Trt и т.д. Для этого было произведено частичное снятие со смолы под действием 0,75% раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Это позволило контролировать протекание синтеза на каждой стадии за счѐт физико-химических методов анализа. Рис 19. Схема снятия трипептидного фрагмента со смолы. Структуру полученного трипептида анализировали с помощью методов 1H и13C ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Наиболее характерными сигналами являются мультиплеты в области 7.18-7.39 м.д., соответствующие ароматическим протонам фенилаланинового остатка и ароматическим протонам Fmoc-защиты, дублеты в области 7.40-7.70 м.д., соответствующие ароматическим протонам тирозина, и набор синглетов в области 1.42 и 1.25 м.д., соответствующие трет-бутильным протонам Boc-защиты и t-Bu-защиты соответственно. Анализ вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии подтвердил его чистоту (100%). После подтверждения структуры трипептида, проводилась реакция создания амидной связи между соединениями 5g, 16 и 17 и другой частью трипептида, прикрепленного к смоле. Для активации кислоты использовали HBTU и HOBt. После окончания реакции и снятия вещества со смолы были получены соединения 18a-18d. После проводили реакцию модификации полученных соединений 18a-18d 3- азидопропиламином и на последнем этапе осуществлялось удаление защитных групп (Рисунок 20). Рис 20. Синтетическая схема синтеза лигандов 20a-20d. Структуры продуктов подтверждалась с помощью методов ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. В 1Н ЯМР-спектре наблюдались характерные для данной структуры наборы сигналов. В частности, в диапазоне 7.17-7.24 м.д. находился сигнал ароматическим протонов фенилаланина, в диапазоне 7.91-7.99 м.д. находился дублет дублетов, соответствующий ароматическим протонам заместителя при амино- группе лизина векторной части молекулы, дублет на 6.88 м.д. соответствовал ароматическим протонам тирозина. Также присутствовал набор синглетов в диапазоне 1.28-1.58, который соответствовал трет-бутильным защитным группам. Для соединения 18c: zk-79.1r.esp 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shif t (ppm) 0 0.05 0.10 0.15 Normalized Intensity 1.97 2.03 2.00 9.29 2.01 0.83 2.01 3.02 1.01 1.00 1.07 0.95 2.16 3.86 3.78 1.07 8.36 0.97 1.85 2.20 5.1442.22 17.81 CH3CN Water DMSO 8.16 8.14 7.97 7.88 7.54 7.52 7.49 7.47 7.23 7.19 7.16 7.15 7.14 7.11 7.13 6.85 6.78 6.83 6.76 6.30 6.28 6.25 6.23 4.50 4.35 4.43 4.33 4.12 4.11 4.03 4.01 3.15 3.14 3.03 2.98 2.88 2.81 2.87 2.62 2.53 2.26 2.24 2.21 2.20 2.19 2.19 2.15 1.84 1.81 1.62 1.49 1.47 1.37 1.36 1.34 1.20 1.23 1.18 1.13 1.07 Рис 21. Спектр ЯМР 1H соединения 18c (400 МГц, ДМСО-d6) Далее была проведена модификация карбоксильной группы лизина с помощью 3- азидопропиламина в присутствии HBTU и HOBt. В результате реакции были получены соединения 19a-19d. Соединения были выделены с помощью метода колоночной хроматографии. Структуры продуктов была подтверждена с помощью методов ЯМР-спектроскопии, масс- спектрометрии высокого разрешения. Чистота анализировалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для соединения 19b: ZK-85-2.1r.esp 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shif t (ppm) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 Normalized Intensity 0.96 1.03 1.131.01 2.00 2.15 5.06 2.02 1.14 1.00 0.98 1.01 1.12 1.79 2.66 2.97 4.19 1.09 3.60 4.59 1.02 4.64 10.06 5.97 43.02 14.64 DCM Water DMSO 8.34 8.32 7.88 7.86 7.83 7.66 7.81 7.59 7.58 7.28 7.19 7.17 7.15 7.14 6.86 6.86 6.84 6.84 6.27 6.25 6.23 5.75 4.59 4.54 4.52 4.38 4.28 4.09 4.02 4.01 3.99 3.97 3.95 3.32 3.20 3.30 3.09 3.04 3.08 2.87 2.66 2.85 2.64 2.33 2.31 2.21 2.19 2.17 2.15 1.85 1.65 1.64 1.62 1.52 1.37 1.35 1.34 1.23 1.19 1.07 Рис 22. Спектр ЯМР 1H соединения 19b (400 МГц, ДМСО-d6) В качестве последнего этапа была проведена реакция снятия защитных групп в 50% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане с добавлением воды и триизопропилсилана (TIPS) в качестве вспомогательного агента, связывающего образующиеся в результате реакции карбокатионы. Таким образом, были получены соединения 20a-20d. Рис 23. Пример хроматограммы препаративного разделения соединения 20a Продукты выделяли с помощью метода обращено-фазовой хроматографии с элюирующей системе вода:ацетонитрил (Interchim Puriflash C18 35g, от 25% ацетонитрила до 100% ацетонитрила в течение 20 минут, скорость потока – 20 мл/мин). Структуры продуктов подтверждались с помощью методов ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения. Чистоту продуктов анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Таким образом, было получено 4 новых лиганда ПСМА, содержащих как азидо- так и амино-группу. Полученные лиганды были охарактеризованы методами 1H и 13C ЯМР- спектроскопии и масс-спектрометрией высокого разрешения, а также чистота подтверждена методом ВЭЖХ-МС. Для соединения 20b: ZK-88-1-1.1r.esp 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Chemical Shif t (ppm) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Normalized Intensity 1.78 1.20 1.04 2.88 1.06 1.98 2.07 2.98 2.01 1.97 1.97 1.93 2.00 3.06 2.83 2.08 2.34 4.29 3.17 1.16 1.94 2.01 4.141.045.20 9.25 6.90 Ацетонитрил Вода DMSO-d6 9.22 8.30 8.28 8.11 8.09 7.93 7.91 7.88 7.86 7.78 7.65 7.57 7.55 7.28 7.27 7.20 7.16 7.02 7.03 6.66 6.63 6.64 6.34 6.32 6.30 6.29 4.60 4.53 4.36 4.33 4.29 4.32 4.11 4.09 4.08 4.07 4.02 4.01 3.42 3.32 3.18 3.10 3.30 3.07 3.09 2.81 2.74 2.93 2.65 2.73 2.53 2.49 2.49 2.34 2.25 2.23 2.48 2.06 1.91 1.89 1.68 1.66 1.64 1.62 1.51 1.49 1.37 1.44 1.25 1.48 1.24 1.22 1.18 1.15 Рис 24. Спектр ЯМР 1H соединения 20b (400 МГц, ДМСО-d6) Для данной серии лигандов также было проведено in vitro исследование аффинности к ПСМА, так как введение дополнительного фрагмента лизина может оказывать влияние на эффективность взаимодействия с рецептором. Таблица 5. Результаты определения параметра аффинности IC50 лигандов для получения двойных конъюгатов. Соединение IC50, нM 20a 28±11 20b 48±18 20c 43±17 20d 58±12 Полученные данные свидетельствуют о снижении аффинности для всей серии лигандов 20a-20d, по сравнению с лигандами 13g, 13l, A и B соответственно. Тем не менее, данная серия лигандов, также демонстрирует высокую аффинность к ПСМА вследствие чего все данные лиганды 20a-20d будут использованы для получения двойных конъюгатов, с целью последующей оценки противоопухолевого эффекта и сравнения их цитостатического потенциала. Получение модифицированных препаратов для синтеза двойных конъюгатов В качестве противоопухолевых препаратов для получения двойных конъюгатов с лигандами 20a-20d планировалось использовать цитостатические препараты (доцетаксел и монометилауристатин) и препараты влияющие на андрогеновый рецептор (абиратерон и энзалутамид). Для модификации цитостатических препаратов был использован подход основанный на введении структурных фрагментов, содержащих терминальную тройную связь, для последующего введения в реакцию азид-алкинового циклоприсоединения. А для препаратов влияющих на андрогеновый рецептор использован подход, основанный на образовании активированных эфиров для последующей реакции ацилировании амино-группы лизина. Модификация доцетаксела Анализ литературных данных по влиянию модификаций различных структурных фрагментов доцетаксела на его активность позволяет предположить, что наиболее подходящим путем для введения линкера является образование сложноэфирной связи с одной из имеющихся вторичных гидроксильных групп.12 В клетках сложноэфирная связь подвержена гидролизу с высвобождением препарата,13 что позволяет использовать эту функциональную группу для конъюгации с векторным фрагментом. В качестве линкера, содержащего тройную связь для последующей реакции [3+2] азид-алкинового присоединения, была выбрана гексин-5-овая кислота. Для синтеза данного производного использовалась процедура образования сложного эфира в присутствии диизопропилкарбодиимида (DIC) и каталитического количества 4-(N,N-диметиламино)пиридина (DMAP) (Рисунок 25). Рис 25. Схема модификации доцетаксела. Структура и чистота продукта 21 была подтверждена данными 1H и 13C ЯМР- спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Модификация монометилауристатина Е. Для адресной доставки на основе моноклональных антител с ауристатинами широкое применение нашли линкеры, позволяющие эффективно высвобождать монометил ауристатин внутри клетки под действием внутриклеточных протеолитических ферментов, таких как катепсин b. Одним из таких линкеров является производное аминокислот валина и цитруллина. Использование валин-цитруллинового катепсин- расщепляемого линкера для связывания и доставки монометилауристатина Е нашло применение на практике.14 Для синтеза конъюгатов, содержащих такой структурный фрагмент, было решено ввести его на стадии модификации самого лекарственного препарата. Исходным соединением для синтеза является Fmoc-защищенный дипептид валил-цитруллин с уже присоединенным фрагментом PAB (фрагмент п-аминобензилового спирта) Fmoc-Val-Cit- PAB-OH. Для дальнейшего введения фрагмента, содержащего алкиновый фрагмент, была проведена реакция удаления Fmoc-защитной группы под действием диэтиламина, что позволило получить соединение Val-Cit-PAB-OH (Рисунок 26). Для создания конъюгата с помощью реакции азид-алкинового циклоприсоединения необходимо наличие терминального алкинового фрагмента в структуре линкера. Данный фрагмент вводили в молекулу Val-Cit-PAB-OH реакцией с гексин-5-овой кислотой. Реакция проводилась с использованием в качестве активирующего агента HBTU, в результате чего было получено соединение 23 - 5-гексинамидо Val-Cit-PAB-OH. Рис 26. Модификация фрагмента линкера L-Val-L-Cit-PAB-OH. Для дальнейшей модификации монометил ауристатина E получали смешанный карбонат 5-гексинамидо-Val-Cit-PAB-PNP 24 реакцией соединения 5-гексинамидо-Val- Cit-PAB-OH 23 с бис(4-нитрофенил)карбонатом (Рисунок 27). Реакция протекает через образование тетраэдрического интермедиата, в котором пара-нитрофенолят является хорошей уходящей группой. В результате происходит отщепление аниона пара- нитрофенолята и образуется целевой карбонат. Рис 27. Получение L-Val-L-Cit-PAB-PNP 24. Получение модифицированного монометилауристатина Е проводили реакцией между ранее полученным валил-цитруллиновым линкером 5-гексинамидо-Val-Cit-PABPNP и немодифицированным препаратом, с получением соединения 5-гексинамидо-Val- Cit-PAB-MMAE 25 (Рисунок 28).Структуры получаемых продуктов подтверждены данными 1H ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Рис 28. Модификация монометил ауристатина Е с использованием фрагмента линкера LVal- L-Cit-PAB-PNP. Модификация абиратерона Модификация абиратерона производилась по следующей трѐхстадийной схеме (Рисунок 29). На первой стадии производилось удаление ацетильной группы в щелочных условиях, степень протекания данной реакции оценивалось методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в элюирующей системе дихлорметан/метанол (15/1). По данным ТСХ было установлено, что уже через 1 час в реакционной смеси отсутствовало исходное соединение, и целевое соединение 1 было выделено с помощью экстракции. Рис 29. Схема модификации абиратерона. Последующая реакция ацилирования показала существенно меньшую скорость протекания реакции. Для оценки полноты протекания процесса также использовалась ТСХ в элюирующей системе дихлорметан/метанол (15/1). По данным ТСХ-контроля было установлено, что реакция была полностью завершена только по истечении ~75 часов (Таблица 6), данный факт может быть обусловлен низкой нуклеофильностью гидроксильной группы абиратерона. Таблица 6. ТСХ-контроль протекания реакции получения соединения 27. Время 2 ч 24 ч 48 ч 72 ч 75 ч ТСХ-контроль, 15/1 (дихлорметан / метанол) Вывод: Реакция прошла не полностью, образовалось незначительное количество целевого Реакция прошла не полностью, ~на 50%. Принято решение Реакция прошла не полностью, ~на 75%. Решено добавить дополнительно 0,3 мольных эквивалента Реакция прошла не полностью, осталось небольшое количество исходного В реакционной смеси осталось незначительное количество примеси исходного Реакц. Исх. Абиратерон Абиратерон сукцинат соедиенеия проводить дальнейшую реакцию при кипячении в дихлорметане (40 оС) для ускорения ее протекания. янатарного ангидрида и и триэтиламина.. абиратерона. Решено добавить дополнительно 0,1 мольных эквивалента янатарного ангидрида и триэтиламина. соединения. Заключительной стадией модификации абиратерона было получение NHS активированного эфира 28. Которая была полностью прошла через ~25 часов. Таблица 7. ТСХ-контроль протекания реакции получения соединения 28. Время 2 ч 4 ч 24 ч 25 ч ТСХ-контроль, 15/1 (дихлорметан / метанол) Вывод: Реакция прошла не полностью, образовалось целевое соедиенеия Реакция прошла не полностью. Принято решение проводить ещѐ реакцию. Реакция прошла не полностью, ~на 90%. Решено добавить дополнительно 0,2 мольных эквивалента EDC*HCl, NHS и триэтиламина.. Реакция прошла полностью, исходный продукт отсутствует. Таким образом, было получено соединение 28 с высокими выходами на каждой синтетической стадии. Структура целевого продукта, а также промежуточных соединений подтверждалась с помощью методов 1Н ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Исх. Реакц. Абиратерон сукцинат NHS-эфир Абиратерон сукцинат Чистота соединения контролировалась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В дальнейшем модифицированный абиратерон использовался для получения двойного конъюгата. Модификация энзалутамида Рис 30. Схема модификации энзалутамида. Для модификации энзалутамида была предложена следующая синтетическая схема (Рисунок 30). Основанная на получении NHS активированного эфира для модификации лиганда ПСМА, содержащего свободную амино-группу. Для реализацииданного синтетического подхода на первой стадии необходимо проведение реакции гидролиза метиламидной группы энзалутамида с целью получения энзалутамид карбоновой кислоты. Для проведения гидролиза была взята за основу методика описанная в публикации Han с соавторами.15 В основе данной методики лежит реакиця кислотно- катиализируемого гидролиза амидной связи с использованием концентрированной HCl и диоксана в соотношении 1 к 10 соответственно. Согласно опубликованным данным, время протекания такой реакции составляет ~2 часа, при кипячении реакционной смеси. Однако, при проведении реакции при таком соотношении реагентов в течении более 72 часов, так и не удалось добиться полного протекания данного процесса, а после разделения хроматографической смеси было обнаружено лишь незначительное количество целевого соединения, а 85% исходного соединения было выделено в неизменном виде. Вследствие чего, в дальнейшем планируется оптимизация методики получения экзалутамид карбоновой кислоты, в том числе за счет повышения концентрации исходной соляной кислоты. А также, дальнейшее получение NHS активированного эфира энзалутамид карбоновой кислоты и использование данного синтетического производного для получения двойных конъюгатов на его основе. Синтез двойных конъюгатов лигандов ПСМА с терапевтическими агентами Синтез двойных конъюгатов с абиратероном и доцетакселом Двойные конъюгаты получали с использованием реакции создания амидной связи с помощью NHS-эфира абиратерона 28 с лигандами 20a-20d. На следующей стадии проводилась реакция [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения с производным доцетаксела 21. Реакция катализировалась ионами меди (I), полученными in situ из сульфата меди под действием аскорбата натрия. Таким образом, были получены двойные конъюгаты 30a-30d (Рисунок 31). Рис 31. Схема получения двойных конъюгатов лигандов ПСМА с абиратероном и доцетакселом. Продукты выделяли с помощью препаративной обращено-фазовой обращенной хроматографии. Полученные двойной конъюгаты был охарактеризованы с помощью 1Н ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Чистота соединений подтвердилась по результатам анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Все полученные конъюгаты были выделены с чистотой не менее 95% (Рисунок 32), для проведения дальнейших in vitro исследований. (а) (б) (в) Рис 32. Результаты ВЭЖХ-МС исследования реакции получения конъюгата 30a: (а) полный ионный ток, в положительных ионах, содержание целевого соединения 100%; (б) «извлечение» иона целевого соединения [M+2H]2+ из общего ионного тока; (в) хроматограмма «пустого» образца, зарегистрированная в положительных ионах. Синтез двойных конъюгатов с абиратероном и монометилауристатином Е В дальнейшем нами был осуществлен синтез двойных конъюгатов на основе абиратерона и монометилауристатина Е вместо доцетаксела. Для получения таких конъюгатов нами была выбрана синтетическая схема аналогичная той, которая была использована при получении конъюгатов 30a-30d. Оптимизация схемы осуществлялась на примере модифицированного абиратероном лиганда 29d (Рисунок 33). 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 1:BPC(+) 23813156 250 500 750 1000 1250 1500 1750 m/z 0,0 2,5 Inten. (x1,000,000) 835,95 1253,30 324,30 427,45 540,15 637,55 753,25 868,60 957,15 1090,70 1203,00 1325,45 1484,75 1671,40 1880,05 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 250000 500000 750000 1000000 1250000 1500000 1750000 2000000 2250000 2500000 2750000 1:BPC(+) Рис 33. Схема получения двойных конъюгатов 31b и 31d с ММАЕ на основе лигандов ПСМА с абиратероном и монометил ауристатином Е. Однако, при выделении продукта реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения. Для очистки реакционной смеси был использован аналогичный подход, основанный на применении препаративной обращенно-фазовой хроматографии. Несмотря на это, нами была получена смесь целевого продукта с примесью, на что указывают данные ВЭЖХ-МС (Рисунок 34). При этом содержание целевого компонента в полученной фракции составила 73 %. При этом повторная очистка смесевой фракции также не позволила получить целевое соединение с чистотой не менее 95%. (а) (б) 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 1:BPC(+) 1413166 26818860 76185701 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 1:1414,00(+) Рис 34. Результаты ВЭЖХ-МС исследования реакции получения конъюгата 31d: (а) полный ионный ток, в положительных ионах, содержание целевого соединения 73%; (б) «извлечение» иона целевого соединения [M+2H]2+ из общего ионного тока. Аналогичный синтез был проведен и на примере модифицированного абриратероном ПСМА лиганда 29b. При этом целевое соединение 31b также не удалось выделить в индивидуальном виде (а) (б) Рис 35. Результаты ВЭЖХ-МС исследования реакции получения конъюгата 31b: (а) полный ионный ток, в положительных ионах, содержание целевого соединения 76%; (б) «извлечение» иона целевого соединения [M+2H]2+ из общего ионного тока. Однако, при детальном анализе двух реакций, было установлено, что природа образования примесного соединения в обеих реакциях получения конъюгатов 31b и 31d имеет общую природу. Данный вывод был сделан на оснований анализа масс-спектров полученный реакционных смесей, в частности молекулярных ионов образующихся примесей. Было установлено, что основной примесью как при получении вещества 31d, так и вещества 31b является соединение с массой {M+116}. Одной, из возможных причин образования такого соединения может быть образование устойчивого комплексного 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 1:BPC(+) 13330622 43210574 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 250000 500000 750000 1000000 1:1419,20(+) соединения Cu2+, которое не удается отделить от целевого соединения ранее исследованными методами. Также ввиду сложности образуемых молекул, возможно протекание побочной реакции. В связи с этим, природа образования побочного продукта требует дальнейшего тщательного исследования. Ввиду того, что на данный момент не удалось реализовать схему получения конъюгата ММАЕ, аналогичную схеме, реализованной на примере доцетаксела, было предложено осуществлять реакции получения двойных конъюгатов абиратерона и ММАЕ в другом порядке. На первом этапе будет проводиться реакция азид-алкинового циклоприсоединения, а на втором, модификация амино-группы с помощью активированного эфира абиратерона (Рисунок 36). Рис 36. Модифицированная схема получения двойного конъюгата 33 лиганда ПСМА с абиратероном и монометил ауристатином Е. На данный момент осуществлена реакция азид алкинового циклоприсоедиения лиганда 20d с монометилауристатином Е. В результате которой удалось выделить индивидуальное соедиение 32d с выходом 49%. При этом чистота данного соединения составила 100% по данным ВЭЖХ-МС. 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 1:BPC(+) 24426672 (а) (б) (в) Рис 37. Результаты ВЭЖХ-МС исследования реакции получения конъюгата 32d: (а) полный ионный ток, в положительных ионах, содержание целевого соединения 100%; (б) «извлечение» иона целевого соединения [M+2H]2+ из общего ионного тока; (в) хроматограмма «пустого» образца, зарегистрированная в положительных ионах; В дальнейшем планируется осуществить модификацию соединения 32d с помощью NHS-активированного эфира абиратерона. При успешной реализации данной синтетической схемы, данный подход будет реализован для получения полной серии двойных конъюгатов абиратерон/ММАЕ 33a-33d. In vitro исследование цитотоксичности двойных конъюгатов лигандов ПСМА с абиратероном и доцетакселом. Для полученных двойных конъюгатов была исследована цитотоксичность in vitro на ключевых клеточных линиях рака предстательной железы: LNCaP, 22Rv1 (ПСМА- положительные) и PC-3 (ПСМА-отрицательная). Полученные результаты в графическом виде представлены на рисунках 38-40. Для оценки цитотоксичности использовали стандартный MTT/MTS-тест16. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что вся серия конъюгатов 30a- 30d обладает близким цитотоксическим профилем на клеточных линиях LNCaP, 22Rv1. При этом большим потенциалом обладают конъюгаты 30b и 30с на примере данных клеточной линии 22Rv1. Также конъюгат 30b продемонстрировал несколько больший 500 750 1000 1250 1500 1750 m/z 0,0 2,5 Inten. (x1,000,000) 799,30 1198,45 318,30 421,85 609,50 755,70 914,05 1027,35 1133,30 1598,15 1756,40 1857,10 1955,25 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 min 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 1:BPC(+) цитотоксический потенциал на клеточной культуре LNCaP. Тем не менее, на данном этапе не удалось выявить явного соединения-лидера. Стоит отметить, что цитотоксичность данных конъюгатов уступает контрольному препарату доцетаксел, особенно в малых концентрациях используемого препарата. Также не удалось достигнуть явного ингибирования клеточного роста на клеточной линии PC-3 во всем исследуемом диапазоне концентраций, как для двойных конъюгатов так и для контрольного препарата. В связи с указанными результатами в дальнейшем планируется расширить диапазон концентраций тестируемых препаратов, при тестировании на всех приведенных клеточных культурах. В том числе для достижения видимого цитотоксического эффекта тестируемых соединений на клеточной линии PC-3. Ввиду того, что в настоящий момент производится отработка методик получения двойных конъюгатов на основе препаратов абиратерон/MMAE, для данной пары терапевтических соединений также планируется получить аналогичную серию конъюгатов, на основе 4 лигандов ПСМА. И провести для полученной серии конъюгатов исследование цитотоксичности на аналогичных клеточных линиях. По результатам данных о цитотоксичности двойных конъюгатов, полученных на основе пар препаратов абиратерон/доцетаксел и абиратерон/ММАЕ планируется осуществить выбор соединений лидеров для проведения последующих in vivo испытаний. При выборе соединения-лидера также будет взята во внимание аффинность соответствующего лиганда, на основе которого будет сделан двойной конъюгат. Рис 38. Данные, полученные при in vitro исследовании полученных двойных конъюгатов 30a-30d на клеточной линии 22Rv1 (ПСМА-положительная клеточная линия). Рис 39. Данные, полученные при in vitro исследовании полученных двойных конъюгатов 30a-30d на клеточной линии LNCaP (ПСМА-положительная клеточная линия). 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 2,5 5 10 20 50 100 200 Выживаемость клеток (%) Концентрация препарата (нM) DOC 30d 30b 30c 30a 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 2,5 5 10 20 50 100 200 Выживаемость клеток (%) Концентрация препарата (нM) DOC 30d 30b 30c 30a Рис 40. Данные, полученные при in vitro исследовании полученных двойных конъюгатов 30a-30d на клеточной линии PC-3 (ПСМА-отрицательная клеточная линия). Проведение исследования цитотоксичности В данной работе использовались клеточные линии: иммортализованные клетки LNCaP – андроген-чувствительная клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгезивными эпителиальными клетками, растут в виде агрегатов и одиночных клеток (ПСМА-положительные). 22Rv1 – клеточная линия карциномы человека, являются адгезивными эпителиальными клетками (ПСМА-положительные). PC-3 – клеточная линия аденокарциномы человека, являются адгезивными эпителиальными клетками (ПСМА-отрицательные). При рутинном ведении клетки линии LNCaP, PC3, 22Rv1 культивировали в среде RPMI без фенолового красного с 10% FBS (Gibco), 1хGlutamax (Gibco), 1× смесью пенициллин-стрептомицин (Gibco), 1× смесью витаминов для RPMI среды. Клетки культивировали в культуральных флаконах T25 в CO2 инкубаторе при 5% СО2 и температуре 37°С до достижения 80% конфлюэнтного монослоя. Клеточные культуры были проверены на отсутствие микоплазмы. Проведение МТТ-теста (3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил тетразолий бромид - тест) был проведено в соответствии с методикой, опубликованной в статье Ferrari с соавторами.17 Клетки 22Rv1, LNCaP PC-3 рассевались в количестве 2500 на лунку 96-луночного планшета в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки 0 20 40 60 80 100 120 0 0,5 1 2,5 5 10 20 50 100 200 Выживаемость клеток (%) Концентрация препарата (нM) DOC 30d 30b 30c 30a FBS (Gibco, США), стрептомицином (0.05 мг/мл) и пенициллином (50 ед/мл). Через 24 часа после посева клеток к ним добавлялись химические препараты, разведенные в соответствующей культуральной среде. Для каждой концентрации препарата использовали три технических реплики. Далее клетки инкубировались 72 часа с препаратами при 37°С и 5% СО2. Затем к клеткам прибавлялся МТТ до 0,5 г/л (использовался 10х кратный раствор в стандартном буфере PBS) и клетки инкубировались еще 2 часа. После инкубации среда отбиралась и осадок растворялся в 140 мкл ДМСО (ООО «Фармамед», Россия) в течении 15 минут при перемешивании на орбитальном шейкере (60 об/мин). Измеряли оптическую плотность каждой лунки при длине волны 565 нм. Каждый эксперимент проводился в трех репликах. Данные обрабатывали с помощью ПО “GraphPad Prism 5” (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), строя зависимости доза-ответ и определяя СC50. Заключение Таким образом, по результатам первого года реализации проекта были осуществлены: Дизайн и синтез серии из 11 ранее неописанных низкомолекулярных лигандов простатического специфического мембранного антигена, содержащих различные заместители (-COOH, -NO2, -OCH3, -OC2H5, -OH) в ароматических структурных фрагментах, а также осуществлена оптимизация условий получения таких лигандов. По данным анализа аффинности полученных лигандов in vitro, был найден перспективный лиганд 13g, содержащий свободную карбоксильную группу в пара-положении и дипептидный фрагмент L-Phe-L-Phe (IC50 = 7±2 нМ). При этом, ранее наилучшую аффинность демонстрировал лиганд B, содержащий мета-хлор заместитель в ароматическом кольце и дипептидный фрагмент L-Phe-L-Tyr (IC50 = 9±3 нМ) в составе линкера. Также высокий потенциал, показали лиганды 13c (IC50 = 16±3 нМ, о-нитро, L-Phe-L-Phe) и 13l (IC50 = 19±5 нМ, п-COOH, L-Phe-L-Tyr). Из полученной серии лигандов, в качестве структурных мотивов для получения лигандов для двойных конъюгатов были выбраны наиболее аффинные соединения: 2 ранее неописанных лиганда 13g и 13l, а также 2 структуры A и B, полученные ранее. На основе структуры данных соединений с использованием подходов твердофазного пептидного синтеза были разработаны синтетические методики, для получения лигандов 20a-20d для последующего получения конъюгатов, содержащих два лекарственных препарата в своей структуре. Полученная серия из 4 соединений 20a-20d также продемонстрировала высокую аффинность к ПСМА. На их основе были отработаны методики получения двойных конъюгатов конъюгата на основе пары препаратов абиратерон/доцетаксел, и получено 4 ранее неописанных соединения. Также в настоящий момент производится разработка синтетических подходов к получению конъюгатов на основе пары препаратов абиратерон/монометил ауристатин Е. Оценка цитотоксичности конъюгатов на основе абиратерона и доцетаксела продемонстрировала, что вся серия конъюгатов 30a-30d обладает схожим цитотоксическим профилем на клеточных линиях LNCaP, 22Rv1. При этом набольшим потенциалом обладает конъюгат 30b (п-COOH, L-Phe-L-Tyr). Однако, на данном этапе превосходство данного конъюгата на основе лиганда 20b, по сравнению с другими соединениями оказывается слабо выраженным. Вследствие этого необходимо проведение дальнейших исследований цитотоксичности данных конъюгатов. А также синтез и оценка цитотоксического потенциала аналогичной серии соединений на основе препаратов абиратерон/монометил ауристатин Е, для выявления наиболее эффективного лиганда ПСМА для адресной доставки на основе двойных конъюгатов. Список литературы (1) Shakhbazyan, A. G.; Koteliansky, V. E.; Ivanenkov, Y. A.; Machulkin, A. E.; Majouga, A. G.; Sandulenko, Y. B.; Veselov, M. S.; Aladinskaya, A. V.; Aladinskiy, V. A.; Beloglazkina, E. K. Small-Molecule PSMA Ligands. Current State, SAR and Perspectives. J. Drug Target. 2016, 24 (8), 679–693. https://doi.org/10.3109/1061186x.2016.1154564. (2) Мачулкин, А. Э.; Успенская, А. А.; Бер, А. П.; Петров, С. А.; Салтыкова, И. В.; Иваненков, Я. А.; Скворцов, Д. А.; Ерофеев, А. С.; Горелкин, П. В.; Белоглазкина, Е. К.; Белов, Е. Ю.; Хазанова, Е. С.; Мажуга, А. Г. СРЕДСТВО ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ, ВКЛЮЧАЮЩЕЕ ПСМА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЛИГАНД НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНОГО МОЧЕВИНЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА С ЛЕКАРСТВЕННЫМ И ДИАГНОСТИЧЕСКИМ АГЕНТОМ. патент RU2697519C1, 2019. (3) Kularatne, S. A.; Wang, K.; Santhapuram, H. K. R.; Low, P. S. Prostate-Specific Membrane Antigen Targeted Imaging and Therapy of Prostate Cancer Using a PSMA Inhibitor as a Homing Ligand. Mol. Pharm. 2009, 6 (3), 780–789. https://doi.org/10.1021/mp900069d. (4) Schmidt, A.; Wirtz, M.; Färber, S. F.; Osl, T.; Beck, R.; Schottelius, M.; Schwaiger, M.; Wester, H. J. Effect of Carbohydration on the Theranostic Tracer PSMA I&T. ACS Omega 2018. https://doi.org/10.1021/acsomega.8b00790. (5) Montalbetti, C. A. G. N.; Falque, V. Amide Bond Formation and Peptide Coupling. Tetrahedron 2005, 61 (46), 10827–10852. https://doi.org/10.1016/j.tet.2005.08.031. (6) Yamada, K.; Hashizume, D.; Shimizu, T.; Ohki, S.; Yokoyama, S. A Solid-State 17O NMR, X-Ray, and Quantum Chemical Study of N-α-Fmoc-Protected Amino Acids. J. Mol. Struct. 2008, 888 (1–3), 187–196. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2007.11.059. (7) Han, S. Y.; Kim, Y. A. Recent Development of Peptide Coupling Reagents in Organic Synthesis. Tetrahedron. 2004. https://doi.org/10.1016/j.tet.2004.01.020. (8) Jaradat, D. M. M. Thirteen Decades of Peptide Synthesis: Key Developments in Solid Phase Peptide Synthesis and Amide Bond Formation Utilized in Peptide Ligation. Amino Acids. 2018. https://doi.org/10.1007/s00726-017-2516-0. (9) Ieronymaki, M.; Androutsou, M. E. len.; Pantelia, A.; Friligou, I.; Crisp, M.; High, K.; Penkman, K.; Gatos, D.; Tselios, T. Use of the 2-Chlorotrityl Chloride Resin for Microwave-Assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Biopolymers 2015. https://doi.org/10.1002/bip.22710. (10) García-Martín, F.; Bayó-Puxan, N.; Cruz, L. J.; Bohling, J. C.; Albericio, F. Chlorotrityl Chloride (CTC) Resin as a Reusable Carboxyl Protecting Group. QSAR Comb. Sci. 2007, 26 (10), 1027–1035. https://doi.org/10.1002/qsar.200720015. (11) Eissler, S.; Kley, M.; Bächle, D.; Loidl, G.; Meier, T.; Samson, D. Substitution Determination of Fmoc-Substituted Resins at Different Wavelengths. J. Pept. Sci. 2017. https://doi.org/10.1002/psc.3021. (12) Guénard, D.; Guéritte-Voegelein, F.; Potier, P. Taxol and Taxotere: Discovery, Chemistry, and Structure-Activity Relationships. Acc. Chem. Res. 1993, 26 (4), 160–167. https://doi.org/10.1021/ar00028a005. (13) Srinivasarao, M.; Galliford, C. V.; Low, P. S. Principles in the Design of Ligand-Targeted Cancer Therapeutics and Imaging Agents. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14 (3), 203–219. https://doi.org/10.1038/nrd4519. (14) Senter, P. D.; Sievers, E. L. The Discovery and Development of Brentuximab Vedotin for Use in Relapsed Hodgkin Lymphoma and Systemic Anaplastic Large Cell Lymphoma. Nat. Biotechnol. 2012, 30 (7), 631–637. https://doi.org/10.1038/nbt.2289. (15) Han, X.; Wang, C.; Qin, C.; Xiang, W.; Fernandez-Salas, E.; Yang, C. Y.; Wang, M.; Zhao, L.; Xu, T.; Chinnaswamy, K.; Delproposto, J.; Stuckey, J.; Wang, S. Discovery of ARD-69 as a Highly Potent Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Degrader of Androgen Receptor (AR) for the Treatment of Prostate Cancer. J. Med. Chem. 2019, 62 (2), 941–964. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.8b01631. (16) Barltrop, J. A.; Owen, T. C.; Cory, A. H.; Cory, J. G. 5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-Dimethylthiazolyl)-3-(4-Sulfophenyl)Te Trazolium, Inner Salt (MTS) and Related Analogs of 3-(4,5-Dimethylthiazolyl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) Reducing to Purple Water-Soluble Formazans As Cell-Viability Indica. Bioorganic Med. Chem. Lett. 1991, 1 (11), 611–614. https://doi.org/10.1016/S0960-894X(01)81162-8. (17) Ferrari, M.; Fornasiero, M. C. MTT Colorimetric Assay for Testing Macrophage Cytotoxic Activity in Vitro. J. Immunol. Methods 1990, 131, 165–172.
2 2 декабря 2020 г.-1 декабря 2021 г. Двойные конъюгаты цитостатических и гормональных препаратов с лигандами ПСМА - новый подход к комбинированной химиотерапии рака предстательной железы
Результаты этапа: По результатам реализации проекта были осуществлены: Дизайн и синтез серии из 11 ранее неописанных низкомолекулярных лигандов простатического специфического мембранного антигена, содержащих различные заместители (-COOH, -NO2, -OCH3, -OC2H5, -OH) в ароматических структурных фрагментах, а также осуществлена оптимизация условий получения таких лигандов. Структура всех полученных лигандов и промежуточных соединений подтверждена комплексом физико-химических методов анализа. По данным анализа аффинности полученных лигандов in vitro, был найден перспективный лиганд 13g, содержащий свободную карбоксильную группу в пара-положении и дипептидный фрагмент L-Phe-L-Phe (IC50 = 7±2 нМ). При этом, ранее наилучшую аффинность демонстрировал лиганд B, содержащий мета-хлор заместитель в ароматическом кольце и дипептидный фрагмент L-Phe-L-Tyr (IC50 = 9±3 нМ) в составе линкера. Также высокий потенциал, показали лиганды 13c (IC50 = 16±3 нМ, о-нитро, L-Phe-L-Phe) и 13l (IC50 = 19±5 нМ, п-COOH, L-Phe-L-Tyr). Из полученной серии лигандов, в качестве структурных мотивов для получения лигандов для двойных конъюгатов были выбраны наиболее аффинные соединения: 2 ранее неописанных лиганда 13g и 13l, а также 2 структуры А и Б, полученные ранее. На основе структуры данных соединений с использованием подходов твердофазного пептидного синтеза были разработаны синтетические методики, для получения лигандов 20a-20d для последующего получения конъюгатов, содержащих два лекарственных препарата в своей структуре. Полученная серия из 4 соединений 20a-20d также продемонстрировала высокую аффинность к ПСМА. На их основе были отработаны методики получения двойных конъюгатов конъюгата на основе пары препаратов абиратерон/доцетаксел, и получено 4 ранее неописанных соединения; пары препаратов абиратерон/монометил ауристатин Е, 4 ранее неописанных соединения. Оценка цитотоксичности конъюгатов на основе абиратерона и доцетаксела продемонстрировала, что вся серия конъюгатов 30a-30d обладает схожим цитотоксическим профилем на клеточных линиях LNCaP, 22Rv1. При этом набольшим потенциалом обладает конъюгат 30b (п-COOH, L-Phe-L-Tyr). Однако, на данном этапе превосходство данного конъюгата на основе лиганда 20b, по сравнению с другими соединениями оказывается слабо выраженным. Вследствие этого необходимо проведение дальнейших исследований цитотоксичности данных конъюгатов. А также синтез и оценка цитотоксического потенциала аналогичной серии соединений на основе препаратов абиратерон/монометил ауристатин Е, для выявления наиболее эффективного лиганда ПСМА для адресной доставки на основе двойных конъюгатов. Проведена оптимизация схемы синтеза лигандов 20a-20d. На основе данных соединений была получена серия неописанных ранее в литературных источниках бимодальных терапевтических конъюгатов содержащих в своей структуре терапевтические агенты монометил ауристатин Е и абиратерон 33a-33d. Структура и чистота полученных препаратов подтверждена комплексом физико-химических методов анализа. Проведена оценка цитотоксичности полученных новых соединений in vitro на клеточных моделях рака предстательной железы. Полученные данные биологических исследований показали схожий профиль цитотоксичности у всех полученных соединений, но исходя из анализа этих данных в качестве конъюгата-лидера был выделен конъюгат 33d, на основе лиганда 20d. Таким образом, в рамках реализации проекта, были проведены in vitro исследования 12 конъюгатов на клеточных линиях рака предстательной железы. Из них 4 бимодальных конъюгата с парой препаратов доцетаксел/абиратерон (30a-30d), 4 бимодальных конъюгата парой препаратов монометил ауристатин Е/абиратерон (33a-33d) и 4 мономодальных конъюгата предшественника с препаратом монометил ауристатин Е (32a-32d). Внутри каждой из серий цитотоксичность конъюгатов была сопоставима друг с другом и контрольными конъюгатами и препаратами (I, MMAE, Doc, I+II) при этом бимодальные конъюгаты 33a-33d показали наибольшую активность и были выбраны в качестве наиболее перспективных для дальнейших исследований. На основе лиганда был проведён синтез двух ранее не описанных бимодальных конъюгатов 34 (содержащий пару терапевтических агентов монометил ауристатин Е и энзалутамид) и 35 (содержащий пару терапевтических агентов монометил ауристатин Е и испинесиб). Полученный конъюгат 34 был выбран на ряду с конъюгатом 33d в качестве конъюгата лидера для последующих in vivo исследований. Таким образом, в рамках реализации проекта были синтезированы в общей сложности 10 новых, ранее не описанных бимодальных терапевтических конъюгатов с различными препаратами. Из них: 4 конъюгата с парой препаратов доцетаксел/абиратерон (30a-30d), 4 конъюгата с парой препаратов монометил ауристатин Е/абиратерон (33a-33d), один конъюгат с парой препаратов монометил ауристатин Е/энзалутамид (34) и один конъюгат с парой препаратов мономети ауристатин Е/испинесиб (35). Структура всех полученных соединений подтверждена комплексом физико-химических методов анализа. Проведены in vivo исследования двух бимодальных конъюгатов-лидеров, выбор которых обоснован корректностью сравнения соединений с одинаковыми заместителями в ароматическом фрагменте при атоме лизина и одинаковой структурой ароматических пептидных фрагментов в линкере (33d и 34) и одного мономодального конъюгата (I) на ксенографтных моделях рака предстательной железы. Проведена оценка динамики скорости роста опухолей и выживаемости экспериментальных животных. Анализ полученных в рамках этого эксперимента показал, что при сравнительном изучении противоопухолевой эффективности конъюгатов I, 33d, 34 у животных с ксенографтами предстательной железы 22Rv1 и РС-3, выявлены преимущества лечения животных с опухолями 22Rv1, что возможно связано с более высоким уровнем экспрессии ПСМА. Наиболее низкий эффект выявлен при использовании препарата MMAE. Следует отметить, что введение лиганда ПСМА в молекулу способствует увеличению эффективности противоопухолевой терапии. Наибольшую эффективность и специфичность в эксперименте in vivo продемонстрировали конъюгаты I (PSMA-MMAE) и 33d (PSMA-Abi-MMAE). В случае конъюгата 34 (PSMA-Enza-MMAE) было обнаружено незначительное снижение эффективности, при существенном уменьшении специфичности к ПСМА-экспрессирующим моделям. Данный эффект может быть обусловлен не сколько дополнительным воздействием на андрогеновый рецептор, сколько с влиянием на фармакокинетику конъюгата. В данном случае необходимы последующие дополнительные доклинические исследования полученных конъюгатов. Полученные данные in vitro и in vivo исследований на данный момент свидетельствуют о том, что комбинационная терапия цитостатическими (ММАЕ, доцетаксел) и гормональными препаратами (абиратерон, энзалутамид), обладает сопоставимым противоопухолевым потенциалом с соответствующими моноконъюгатами цитостатических препаратов. В проводимом исследовании не было обнаружено антагонистического влияния комбинации препаратов в составе двух конъюгатов, однако, многократного синергетического увеличения терапевтической эффективности или селективности обнаружено не было. Несмотря на это, полученный двойной конъюгат33d (PSMA-Abi-MMAE) обладает как высокой эффективностью, так и высокой селективностью в терапии ПСМА-экспрессирующим опухолей, что делает его хорошим кандидатом для дальнейших испытаний в качестве средства для лечения опухолей предстательной железы. Также, актуальной задачей для последующих исследований является замена фрагмента гормонального препарата, на другие терапевтические молекулы, с целью поиска и создания более эффективных терапевтических молекул.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".