![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Пыльца и споры растений – один из основных компонентов биологических аэрозолей и, одновременно, одна из основных причин аллергических заболеваний. По данным ВОЗ, от них страдает более 20% населения земного шара, в первую очередь жители мегаполисов экономически развитых стран. Обязательным элементом комплекса противоаллергических мероприятий является аэробиологический мониторинг, позволяющий отслеживать и прогнозировать динамику концентрации основных аллергенов в атмосфере, корректировать терапию и образ жизни больных поллинозами. Стандартным методом идентификации пыльцы в образцах воздуха является метод световой микроскопии. Этот метод обладает рядом ограничений, одно из наиболее существенных - невозможность провести видовую идентификацию пыльцы в образцах воздуха. Необходим более эффективный и чувствительный метод идентификации пыльцы в сложных по составу смесях, позволяющий точно определять источник аллергенного белка в атмосфере, что может иметь решающее значение в современной персонализированной медицине при внедрении в аллергологическую практику компонент-специфической диагностики. Таким методом может стать ДНК-штрихкодирование, позволяющее проводить качественный (на уровне вида или рода) и количественный анализ смесей биологического происхождения. Использование ДНК-штрихкодирования в аэробиологии началось в последние 3-4 года (Kraaijeveld et al, 2015; Mohanty, Buchheim, Levetin, 2017; Leontidou et al, 2017; Ghitarrini et al, 2018), однако до настоящего времени удовлетворительные результаты не были получены. В России аэробиологические исследования с применением параллельного высокопроизводительного секвенирования (ПВС) для идентификации состава биологических аэрозолей не проводились. Предлагаемый проект направлен на разработку протоколов выделения и идентификации ДНК пыльцы из проб воздуха и оценку их эффективности для пыльцевого мониторинга атмосферы. Отработку методики предлагается провести на основе анализа пыления злаков, пыльца которых сходна морфологически, но обладает разной аллергенной активностью. В работе будет использован метагеномный анализ образцов с помощью высокопроизводительного секвенирования ДНК-штрихкодов (маркеров) trnL-F, ITS и ETS на приборах второго поколения (Illumina). Также впервые будет исследована возможность создания экспресс-технологии анализа проб пыльцы с помощью секвенирования на платформе третьего поколения Oxford Nanopore. Результаты анализа будут сопоставлены с данными аэробиологического и фенологического мониторинга.
Pollen and spores are one of the main components of biological aerosols and, at the same time, one of the main causes of allergic diseases. According to the WHO, more than 20% of the world's population suffers from them, primarily residents of megapolises of economically developed countries. An obligatory element of anti-allergic strategy is aerobiological monitoring, which allows you to track and predict the dynamics of the concentration of major allergens in the atmosphere, correct the therapy and lifestyle of patients with pollinosis. The standard method of pollen identification in air samples is light microscopy. This method has several limitations; one of the most significant is the inability of species identification on the base of pollen morphology. It is necessary to develop a more effective and sensitive method for identification of pollen in complex mixtures, which allows one to determine accurately the source of allergenic protein in the atmosphere. Precise identification is extremely important in modern personalized medicine, in allergology this approach is based on the component-resolved diagnosis. The problems of species identification can be solved by DNA barcoding, which allows not only identify but also make quantitative analysis of biological mixtures. DNA barcoding in aerobiology started to use in the last 3-4 years (Kraaijeveld et al, 2015; Mohanty, Buchheim, Levetin, 2017; Leontidou et al, 2017; Ghitarrini et al, 2018), but to date, satisfactory results have not been obtained. In Russia, aerobiological studies using DNA barcoding were not carried out. The proposed project aims to develop protocols for the isolation and identification of pollen DNA from air samples and to evaluate their effectiveness for pollen monitoring of the atmosphere. Pollination of Poaceae will be used as test-system: grass pollen is morphologically similar, but different species have different allergenic activity. We propose a metagenomic analysis of samples using high-performance sequencing of trnL-F, ITS and ETS DNA barcodes (markers) on devices of the second generation (Illumina).For the first time there will be investigated the express technology of analysis of pollen samples using sequencing on the third generation platform Oxford Nanopore. The results of the analysis will be compared with the data of aerobiological and phenological monitoring.
1 год Создание референсной базы (выделение ДНК из живых или гербарных референсных образцов) Подбор праймеров для ETS Закладка пробных площадей для фенологических наблюдений, оценка на этих пробных площадях видового состава злаков и их обилия. Определение пыльцевой продуктивности основных видов злаков средней полосы. Отработка методики расчета фенологического индекса с учетом реальных значений пыльцевой продуктивности. Аэробиологический мониторинг при помощи волюметрических пыльцевых ловушек (Москва Рязань) Отбор образцов воздуха для секвенирования (Москва и Рязань) Отработка методики смыва пыльцы с лент пыльцевых ловушек на материале, отобранном в Москве летом 2019г. и весной 2020г. Секвенирование отобранных аэробиологических образцов, анализ результатов
Участники рабочего коллектива имеют опыт по всем планируемым направлениям исследований и доступ ко всему необходимому для проведения проекта оборудованию. В двух точках наблюдений – Москве и Рязани – станции аэробиологического мониторинга существуют длительное время, в Москве с 1992 г., в Рязани – с 2007 г. В 2015-2018 гг были проведены исследования, направленныена определение региона, отраженного в составе пыльцевого спектра, выявления зависимости состава спектра от высоты установки пыльцевой ловушки и оценки влияния локальной растительности на его состав. В 2018 году в Москве были начаты предварительные исследования, направленные на детализацию кривой пыления злаков. В настоящий момент отработана методика описания фенологического состояния злаков, собран материал для оценки их пыльцевой продукции, опробована методика расчета фенологического индекса. В течение вегетационных сезонов 2018 и 2019 были опробованы разные методики отбора аэробиологических проб для ДНК-штрихкодирования . Д.Омельченко, А.Криницына, А.Сперанская имеют большой опыт в проведении молекулярно-биологических исследований, владеют необходимыми навыками для проведения работ по выделению ДНК из пыльцы растений, постановке ПЦР, созданию ДНК-библиотек для секвенирования. А.Касьянов имеет большой опыт в разработке биоинформатических баз данных и метагеномном анализе. Он участвовал в разработке базы данных HOCOMOCO и TRAVA, в проекте de novo сборки генома C. bursa-pastoris и de novo сборки транскриптомов F.tatricum и F.esculentum. Д.Омельченко, А.Криницына, А.Сперанская и А.Касьянов выступали в качестве исполнителей в проекте по разработке методик для анализа видового состава пищевой продукции растительного происхождения с помощью высокопроизводительного секвенирования, успешно завершенного в 2019 году, где в частности получили опыт работы с выделением, секвенированием ДНК и анализом пыльцы в составе продуктов питания (мёд).
1. Будет создана референсная библиотека последовательностей генетических маркеров trnL-F, ITS и ETS для видов злаков, наиболее распространенных в средней полосе России. Создание референсной библиотеки предполагается завершить на первом этапе реализации проекта. 2. Будут проверены и оптимизированы условия для амплификации ETS в сложных смесях 3. Будет охарактеризована внутригеномная и внутри- и межвидовая изменчивость маркерных участков исследованных видов, будут выбраны оптимальные пороги для идентификации 4. Будет проведен анализ проб воздуха, собранных в двух точках в течение основного периода пыления злаков в 2020-2022 годах с помощью двух методов – палинологического и молекулярного (меташтрихкодирование). Результаты исследования будут сопоставлены с данными фенологических наблюдений. 6. Будет получен детализированный (на уровне видов и родов) усредненный за три года календарь пыления злаков средней полосы России. 6. Будет предложен протокол отбора, выделения и видовой идентификации пыльцы в аэробиологических образцах методом ДНК-штрихкодирования.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 4 декабря 2019 г.-4 декабря 2020 г. | Идентификация и количественный анализ пыльцы в образцах воздуха методом ДНК-штрихкодирования |
Результаты этапа: Исследования на первом этапе реализации проекта проводились по трем направлениям: аэропалинологический мониторинг, фенологические наблюдения, отработка методики выделения ДНК злаков из образцов воздуха и анализ искусственных смесей пыльцы. Был проведен ежедневный мониторинг концентрации пыльцы злаков в двух точках наблюдения, получены аэробиологические кривые. Проведен расчет пыльцевой продуктивности наиболее широко распространенных видов злаков, для 7 видов это сделано впервые. На основании фенологических наблюдений, данных о пыльцевой продукции и обилии злаков на пробных площадях рассчитан фенологический индекс, динамика которого хорошо согласуется с ходом кривых пыления (r=0,8 в двух точках наблюдений), однако не позволяет детализировать их полностью. Отработаны методики отбора проб для ДНК анализа при помощи волюметрических пыльцевых ловушек и выделения ДНК из аэробиологических образцов, опробован метод отбора образцов при помощи циклонных ловушек. Для выбранных референсных видов злаков (14 видов) были секвенированы и проанализированы полные последовательности ядерных маркеров ITS1, ITS2 и хлоропластного маркера – межгенного участка trnL-F. На основе этих маркеров была создана база данных для метагеномного анализа состава образцов пыльцы злаков с помощью высокопроизводительного секвенирования. Для оценки специфичности и чувствительности маркеров и методики была секвенирована ДНК образцов искусственных смесей пыльцы злаков и проведен анализ результатов секвенирования. Были подобраны праймеры для специфичной амплификации фрагмента ядерного участка 5`-ETS злаков, длина и вариабельность которого также позволяет использовать его в качестве маркера для идентификации злаков с помощью высокопроизводительного секвенирования. Данный фрагмент был секвенирован у всех исследованных видов и добавлен в созданную нами базу маркеров. Проведено секвенирование пластидных геномов 5 видов злаков, полные пластомы которых отсутствовали в открытых базах данных. Пластомы были собраны путем гибридной сборки из коротких парных прочтений с платформы Illumina MiSeq и длинных прочтений с платформы Oxford Nanopore, и аннотированы автоматически с последующей ручной проверкой аннотаций. | ||
2 | 1 марта 2021 г.-25 декабря 2021 г. | Идентификация и количественный анализ пыльцы в образцах воздуха методом ДНК-штрихкодирования |
Результаты этапа: Исследования на втором этапе реализации проекта проводились по трем направлениям: аэропалинологический мониторинг, фенологические наблюдения, анализ искусственных смесей пыльцы и образцов воздуха, отобранных вихревой ловушкой. Был проведен ежедневный мониторинг концентрации пыльцы злаков в двух точках наблюдения, получены аэробиологические кривые. Расчёты пыльцевой продуктивности дополнены данными о трех однолетних видах, пыльцевая продукция которых ранее не изучалась. Показана связь длины пыльника с его пыльцевой продукцией, что открывает возможность ее грубой оценки без трудоемких подсчетов. Проведены фенологические наблюдения на 13 пробных площадях, расположенных на разном расстоянии от пыльцевых ловушек. На основании фенологических наблюдений, данных о пыльцевой продукции и обилии злаков на пробных площадях рассчитан фенологический индекс, который, однако, не позволяет полностью детализировать кривые пыления. На втором этапе работы собраны и аннотированы полные последовательности хлоропластных геномов Elymus repens, Phleum pratense, Briza media, Dactylis glomerata, Festuca pratensis, все пластомы (10 видов за два года исследований) были загружены в общедоступную базу данных GenBank. На основе выравнивания последовательностей пластомов были подобраны универсальные праймеры на наиболее богатые полиморфизмами участки пластомов в качестве новых потенциальных маркеров злаков. Был завершен анализ маркеров для анализа пыльцевых смесей с помощью высокопроизводительного секвенирования. В дополнение к анализу ITS1, ITS2 и trnL-F маркеров, выполненному на первом этапе работы, проведен анализ эффективности разрешения последовательностей пыльцы разных видов злаков по 5`-ETS маркеру на искусственных смесях пыльцы. Анализ результатов секвенирования показал, что все маркеры показывают хорошее разрешение пыльцы злаков до рода и позволяют проводить качественную оценку состава пыльцевой смеси, однако количественное определение состава искусственной смеси чаще всего не соответствует заданному соотношению. Наилучшие результаты чаще всего отмечались для маркеров ITS1 и ITS2, и, в меньшей степени для 5`-ETS, у которого была выявлена недопредставленность прочтений для некоторых видов (Bromus inermis). Эффективность амплификации для разных маркеров варьирует от вида к виду, наименьшая эффективность показана для пластомного маркера trnL-F. Проведено секвенирование полевых образцов, собранных с помощью вихревой пыльцевой ловушки. Как и при анализе искусственных смесей, геномные маркеры показали достаточную эффективность амплификации и степень разрешения последовательностей для детекции состава в большинстве образцов, тогда как для пластомного маркера trnL-F она оказалась крайне низкой. Таким образом, в дальнейшем для анализа пыльцы рекомендуется использовать только геномные маркеры. | ||
3 | 28 марта 2022 г.-28 декабря 2022 г. | Идентификация и количественный анализ пыльцы в образцах воздуха методом ДНК-штрихкодирования |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".