ИСТИНА

Целью проекта является выяснение роли возникновения мутантных форм естественно-развернутых белков, содержащих замены остатков тирозина на остатки цистеина в результате ошибок трансляции, в развитии нейродегенеративных заболеваний.

The aim of the project is to elucidate the role of the occurrence of mutant forms of intrinsically disordered proteins containing replacements of tyrosine residues with cysteine ​​residues as a result of translation errors in the development of neurodegenerative diseases. The relevance of the study is related to the need to search for new mechanisms that cause pathological aggregation of amyloidogenic proteins (alpha-synuclein and others) to develop approaches for the prevention and treatment of diseases of amyloid nature. The project is based on the assumption that errors in the translation of amyloidogenic and other intrinsically disordered proteins can lead to the replacement of some tyrosine residues (encoded by the TAC triplet) by the cysteine ​​residue (triplet TGC). The appearance of additional cysteine ​​residues in amyloidogenic proteins may stimulate the formation of cross-linked disulfide bonds of aggregates that affect the development of amyloid diseases. During the realization of the project, it is proposed to clarify the mechanisms of substitution of some tyrosine residues for cysteine ​​residues in alpha-synuclein and other amyloidogenic proteins in both eukaryotic and prokaryotic cells. The question of the existence of A-I (adenosine-inosine) mRNA editing in bacterial cells is of key importance, since the high efficiency of substitution of tyrosine residue 136 for the cysteine ​​residue (up to 50%) in expression of alpha-synuclein in E. coli, found in our studies, is difficult to explain only by incorrect reading of the codon of cysteinyl-tRNA. Identification of the mutant alpha-synuclein with the substitution of the tyrosine residue 136 by the cysteine ​​residue in eukaryotic cells is of great scientific and practical importance since it indicates the existence of a new mechanism affecting the development of synucleinopathies. Consequently, it opens the possibility of finding new ways of preventing and treating these diseases. It is also possible that new mutant forms of other amyloidogenic proteins with such substitutions of tyrosine with cysteine will be detected, which will provide information on previously unknown causes of amyloid diseases.

За первый год реализации проекта будут отобраны амилоидогенные белки, наиболее перспективные с точки зрения дальнейшего изучения их роли в развитии нейродегенеративных заболеваний. На первом этапе отбора белки должны будут отвечать следующим критериями: • В их составе должны быть остатки тирозина, кодируемые триплетом ТАС, которые могут быть заменены на остатки цистеина. • Количество замененных остатков цистеина должно быть нечетным, поскольку в этом случае более вероятно образование дисульфидных связей между полипептидными цепями, стабилизирующее агрегаты. • Белки должны относится к полностью или частично естественно-развернутым белкам. Для отбора белков в первую очередь будут проверены последовательности известных амилоидогенных белков, содержащих тирозиновые остатки. Будут проанализированы нуклеотидные последовательности генов, и проверена возможность однонуклеотидной замены, приводящей к замене тирозина на цистеин. Кроме того, будет проведен поиск паттернов, схожих с паттерном (профиль) в подвергающемся замене участке альфа-синуклеина, и исследована возможность замены тирозина на цистеин в этих белках. В случае успешного поиска и экспериментальной проверки возможности такой замены для дальнейшего поиска будет использоваться новый профиль на основе этих белков. При этом будет исследована возможная корреляция этих позиций с известными полиморфизмами амилоидогенных белков людей, связанными с развитием амилоидных заболеваний. Наконец, аналогичный анализ будет проведен по отношению к другим естественно-развернутым белкам. Среди найденных на первом этапе белков будут отобраны белки, связанные с развитием нейродегенеративных заболеваний и других болезней амилодной природы. На следующих этапах реализации проекта будет проведен поиск отобранных белков, содержащих замены остатков тирозина на остатки цистеина в эукариотических клетках. В экспериментальной части реализации проекта планируются получить результаты, доказывающие, что при синтезе альфа-синуклеина в эукариотических клетках возможна замена остатка тирозина, кодируемого триплетом ТАС, на остаток цистеина, которая была продемонстрирована ранее на бактериальных системах. Для подтверждения этого предположения будет проведена экспрессия альфа-синуклеина человека в клетках нейробластомы и исследовано влияние условий культивирования клеток на образование мутантных форм альфа-синуклеина, содержащих замену 136 остатка тирозина на остаток цистеина. Для идентификации мутантных форм альфа-синуклеина будет использована иммуноаффинная хроматография на антителах к альфа-синуклеину, ковалентная хроматография на тиол-сефарозе и последующая масс-спектрометрия. Будет подготовлена, по крайней мере, одна статья для публикации в международном журнале и опубликованы тезисы на конференции.

Ранее при выполнении работ по госбюджетным темам, проектам РФФИ и РНФ нашим коллективом были получены важные результаты, имеющие прямое отношение к представленному проекту и являющиеся базой для его выполнения. Так, нами было начато исследование взаимодействия некоторых амилоидогенных белков (пептида бета-амилоида) с ненативными формами определенных глобулярных белков и доказана высокая прочность и специфичность такого рода взаимодействий [1]. Нами было также продемонстрировано накопление денатурированных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в мозге животных при различных способах моделирования болезни Альцгеймера [2]. Нами были подробно исследованы особенности агрегации различных белков методом лазерного светорассеяния, а также другими физико-химическими методами (флуоресцентной и КД-спектроскопии, калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования) [3-12]. Нами была предложена и подтверждена экспериментально гипотеза о блокировании системы шаперонов, участвующих в образовании амилоидных структур, неправильно свернутыми белками (misfolded proteins) [10, 11, 13]. Было доказано, что такое действие могут оказывать не только химически модифицированные или мутантные белки [11], но и развернутые окисленные полипетидные цепи [10]. Таким образом, на основании этих наблюдений можно сделать вывод, что влияние шаперонов на процессы формирования амилоидных структур, прежде всего, зависит от того, являются ли шапероны функционально активными. Например, в отсутствие кошаперонов и АТФ-зависимой активности шапероны могут лишь связывать неправильно свернутые белки, но не могут способствовать формированию нативных структур, а заблокированные шапероны, в принципе, могут стимулировать агрегацию белков вместо ее предотвращения [10, 11, 13]. В группе накоплен большой опыт по выделению рекомбинантных белков.

Целью проекта являлось выяснение роли возникновения мутантных форм естественно-развернутых белков, содержащих замены остатков тирозина на остатки цистеина, в развитии нейродегенеративных заболеваний. Прежде всего, была проверена возможность продукции альфа-синуклеина с заменой остатка тирозина, кодируемого триплетом ТАС, на остаток цистеина, в эукариотических системах, а именно в клетках нейробластомы и дрожжевых клетках. Продукция мутантных форм альфа-синуклеина с заменой Tyr136Cys не была обнаружена ни в клетках нейробластомы, ни в дрожжевых клетках. Таким образом было показано, что ошибочное узнавание цистеинил-тРНК кодона мРНК UAC как UGC при синтезе альфа-синуклеина не характерно для эукариотических клеток. При этом в эукариотических клетках не происходит редактирования мРНК альфа-синуклеина аденозиндезаминазами, которое могло бы приводить к заменам не только Tyr136, но и других тирозиновых остатков, кодируемых триплетом UAU. Эти экспериментальные данные были подтверждены анализом установленных ранее сайтов редактирования мРНК аденозиндезаминазами, среди которых отсутствуют соответствующие сайты альфа-синуклеина. С помощью анализа различных баз данных был проведен поиск белков, в которых могли бы происходить замены остатков тирозина на остатки цистеина. Критериями отбора было наличие TAC кодона, который потенциально может быть мишенью для аденозиндезаминаз, участие белка в нейрогенезе и присутствие в белке протяженных «естественно-развернутых» участков. Среди 18291 генов, содержащих тирозиновый кодон ТАС было найдено 19 генов, кодирующих белки, содержащие неструктурированные участки, причем два из них были связаны с нейрогенезом: белок P49757 («Protein numb homolog») и P26367 («Paired box protein Pax-6»). Поиск белков-кандидатов с помощью анализа установленных ранее сайтов редактирования РНК, выявил естественно-развернутый белок O43236 («septin 4 – септин 4»), участвующий в нейродегенеративных процессах. Три найденных белка были выбраны для дальнейшего экспериментального изучения. Плазмидами для индуцируемой экспрессии, содержащими гены белков P49757, P26367 и 13 изоформы септина 4, были трансформированы клетки E.coli , а затем выделены соответствующие белки. В выделенных препаратах белков не было обнаружено сшитых дисульфидными связями полипептидных цепей. Следовательно, для трех исследованных белков не характерна замена Tyr-Cys, обнаруженная для альфа-синуклеина. Вероятно, возможность замены Tyr-Cys зависит от контекста, в котором находится кодон UAC. Был также проведен поиск белков-кандидатов среди клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов нейродегенеративных заболеваний, выявивший 4 белка, удовлетворяющих критериям отбора: Q04656 (“Copper-transporting ATPase 1»), Q92793 («CREB binding protein»), P09651 («heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(HNRNPA1)») и P53041 («Serine/threonine-protein phosphatase 5»). Таким образом было обнаружено ещё 4 белка с естественно-развернутыми участками, вовлеченных в возникновение и развитие нейродегенеративных заболеваний, для которых возможна замена остатков тирозина на остатки цистеина. Далее для поиска замен Tyr/Cys при экспрессии белков человека, ассоциированных с нейродегенеративными заболеваниями, был использован пакет инструментов REDItools, позволяющий вычислить потенциальные точки редактирования РНК по данным RNA-seq. При анализе данных секвенирования тканей мозга пациентов с болезнью Паркинсона и неврологически здоровых людей были найдены гены, по-разному модифицированные у пациентов с болезнью Паркинсона (GRIK1, GRIK2, GRIA2, GABRA3, GIPC1 и PLIN4). В целом у страдающих болезнью Паркинсона людей найдено меньше потенциальных сайтов редактирования. Нельзя исключить, что невозможность замен Tyr-Cys стимулирует развитие нейродегенерации, поскольку альфа-синуклеин, содержащий остатки цистеина не подвергается патологической трансформации. Возникновение в белках замен тирозиновых остатков на цистеиновые, происходящие в бактериальных системах, необходимо учитывать при моделировании патологической трансформации рекомбинантых белков. Кроме того, это явление можно использовать в биотехнологии для синтеза белков с дополнительными сульфгидрильными группами. Таким образом, при реализации проекта все запланированные эксперименты были проведены, а полученные результаты позволили получить важную информацию об особенностях замены в белках остатка тирозина, кодируемого триплетом ТАС, на остаток цистеина. На основании полученных результатов были опубликованы две экспериментальные статьи в международных журналах и одна обзорная статья принята в печать. Было также сделано 3 доклада на конференциях и опубликованы тезисы этих докладов.