ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Белки SFPQ и NONO относятся к семейству белков DBHS (Drosophila behavior/human splicing), содержат РНК- и ДНК-связывающие мотивы и существуют в клетке как в виде гомодимеров, так и гетеродимера SFPQ/NONO. Существует несколько работ, в которых показано участие SFPQ и NONO в регуляции ранних стадий репликации ВИЧ-1 и их взаимодействие с некоторыми вирусными белками, включая интегразу, однако данные достаточно противоречивы, и пути такой регуляции остаются невыясненными. Ранее нами было обнаружено негативное влияние SFPQ на экспрессию репортерного белка с вирусного промотора LTR, но механизм также неясен. В этой связи цель данного исследования заключается в изучении роли белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1 и определении механизма их участия. Для понимания механизма регуляции репликации ВИЧ-1 белками SFPQ и NONO необходимо решить следующие задачи: 1) Определить, на какую стадию экспрессии репортерного белка в модельной системе влияют белки SFPQ и NONO, и изучить механизм этого влияния. 2) Охарактеризовать взаимодействие вирусных белков обратной транскриптазы и интегразы с белками SFPQ и NONO. 3) Выяснить функциональное значение взаимодействия белков SFPQ и NONO с обратной транскриптазой и/или интегразой для ранних стадий репликации ВИЧ-1.
HIV infection is a disease caused by the human immunodeficiency virus, continues to spread actively and remains incurable. The main problems encountered in the fight against this disease are viral latency, in which transcription from the integrated provirus is suppressed, and the developing resistance of the virus to antiviral drugs. The study of cellular proteins involved in the regulation of transcription from the HIV-1 promoter is extremely important, because, on the one hand, it will help to understand the mechanism of establishment, maintenance and release of the virus from the latent state and find approaches to its regulation. On the other hand, the complex of these proteins with viral proteins may be a potential target for the creation of drugs with minimal risk of resistance. To date, a series of reports on the effect of cell proteins SFPQ and NONO on HIV-1 replication has been accumulated, but no mechanism to explain their effect has been proposed. This project will be the first to systematically investigate the involvement of SFPQ and NONO proteins in the early stages of HIV-1 replication, including reverse transcription, integration and expression of viral genes. The interaction of viral integrase and reverse transcriptase proteins with SFPQ and NONO proteins in vitro will be studied for the first time and the structural determinants of this interaction will be determined. In addition, the functional role of this interaction on VSV-G pseudotyped replication-incompetent virus will be studied. This will help to understand whether the complex of viral reverse transcriptase proteins and/or integrase with SFPQ and NONO can be considered as potential targets for the development of new antiretroviral drugs. This strategy for creating HIV-1 replication inhibitors is being formulated for the first time. It is still unclear how SFPQ and NONO affect viral gene transcription and whether they affect post-transcription regulation of viral proteins. In this project, a systematic study of the regulation of HIV-1 gene expression by SFPQ and NONO proteins on a reporter system developed earlier in the laboratory will be conducted for the first time.
В результате выполнения проекта планируется выяснить механизм регуляции репликации ВИЧ-1 белками SFPQ и NONO. В частности будет определено, на какую стадию экспрессии репортерного белка в модельной системе влияют эти белки, и будет изучен механизм этого влияния. Также будет исследовано взаимодействие вирусных белков обратной транскриптазы и интегразы с белками SFPQ и NONO, и определено функциональное значение этих взаимодействий для ранних стадий репликации ВИЧ-1. Полученные данные об участии клеточных белков в регуляции транскрипции с промотора ВИЧ-1 позволят приблизиться к пониманию молекулярных механизмов установления, поддержания и выхода вируса из латентного состояния и найти подходы к его регуляции. Кроме того, комплексы SFPQ и NONO с вирусными белками могут оказаться потенциальными мишенями для создания противовирусных препаратов с минимальным риском развития устойчивости, а понимание функционального значения этих взаимодействий может привести к созданию нового поколения препаратов для антиретровирусной терапии.
В коллективе есть опыт и все необходимое оборудование для работы с клеточными культурами. Накоплен большой опыт по изучению клеточных белков, взаимодействующих с интегразой ВИЧ-1. В частности, показано, что связывание интегразы с клеточным белком Ku необходимо для успешного завершения вирусной интеграции. Помимо этого в коллективе исследуется влияние Ku на транскрипцию с промотора ВИЧ-1. В работе используются модельные системы для изучения транскрипции с разных промоторов, в том числе и с LTR промотора ВИЧ. С использованием такой модельной системы, в которой под промотором LTR находится репортерный ген люциферазы, было показано, что при суперэкспрессии SFPQ наблюдается зависимое от концентрации снижение сигнала люциферазы. Причем это влияние специфично для промотора LTR и не наблюдается при использовании других контрольных промоторов. В коллективе также имеется большой опыт в проведении генно-инженерных манипуляций и получения векторов про- и эукариотической экспрессии. Проводятся работы с рекомбинантными белками и с модифицированными ДНК и РНК. В частности, у коллектива есть большой набор мутантных вариантов интегразы ВИЧ-1, в том числе из разных штаммов этого вируса. На настоящий момент получены плазмидные конструкции, кодирующие белки SFPQ и NONO для прокариотической экспрессии, необходимые для работы по проекту. В коллективе имеются все необходимые вектора и налажена методика сборки репликативно-некомпетентных вирусных частиц на основе ВИЧ-1, несущих в своем составе репортерный ген. Эта система позволяет изучать ранние этапы репликативного цикла ВИЧ – обратную транскрипцию, интеграцию и репарацию. Отработаны условия ПЦР для определения форм вирусной ДНК и разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определить уровень репарированной после интеграции ДНК.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Основная работа 1-го этапа проекта была направлена на определение стадии экспрессии репортерного белка в модельной системе, на которую влияет белок SFPQ, и изучении механизма этого влияния. Для этого был определен уровень мРНК люциферазы светлячка, экспрессирующейся с вектора pGL3-LTR-HIV, в условиях повышенной внутриклеточной концентрации белка SFPQ. Также был сконструирован вектор на базе вектора pGL3-LTR-HIV с делецией лидерного региона ВИЧ-1, закодированного в LTR, но с интактным вирусным промотором, и проверено влияние SFPQ на стабильность мРНК люциферазы, содержащей и не содержащей лидерный регион мРНК ВИЧ-1. Кроме того, исследовалось изменение экспорта мРНК при суперэкспрессии SFPQ, для этого с помощью ПЦР в реальном времени определялось количество мРНК люциферазы светлячка в ядерном и цитоплазматическом лизатах при нормальном и измененном уровне SFPQ. Еще одним направлением работы был подбор условий экспрессии в Е.coli рекомбинантных белков SFPQ и NONO с тагами для аффинной очистки. В результате были получены индивидуальные гомодимеры и гетеродимер SFPQ/NONO и изучено in vitro их взаимодействие с РНК и ДНК. | ||
2 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: Были проведены исследования по изучению влияния клеточных белков SFPQ и NONO на ранние стадии репликативного цикла ВИЧ-1. Для решения поставленной задачи мы трансдуцировали клеточную культуру HEK 293T (клетки эмбриональной почки человека) с нормальным и пониженным уровнем SFPQ или NONO псевдовирусными частицами. Далее, с использованием количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), измеряли уровень различных форм вирусной ДНК в клетке. Снижение уровня SFPQ или NONO в клетках HEK 293Т достигалось с помощью коротких интерферирующих РНК (siРНК). Эффективность изменения уровня белка была подтверждена с помощью Вестерн-блота. Через 48 часов, когда уровень белков в клетках падал, мы трансдуцировали клетки с помощью псевдовирусных частиц. Через 24 часа клетки лизировали, выделяли ДНК и с помощью кПЦР измеряли общий уровень вирусной ДНК и уровень интегрированной формы для оценки эффективности процессов обратной транскрипции и интеграции соответственно. Показано, что нокдаун как SFPQ, так и NONO приводит к снижению количества общей вирусной ДНК на 55% и 40% соответственно. Таким образом, снижение уровня SFPQ и NONO в клетке влияет на обратную транскрипцию ВИЧ-1. При этом, уровень интегрированной ДНК вируса при нокдауне этих белков также снижался, и уровень снижения коррелировал с уровнем снижения общей вирусной ДНК. Другими словами, нокдаун SFPQ или NONO не влияет на стадию интеграции вирусной ДНК. Полученный результат говорит о том, что SFPQ является положительным фактором обратной транскрипции ВИЧ-1. Далее методом со-осаждения с использованием рекомбинантных белков с аффинными тагами показано, что SFPQ не взаимодействует с обратной транскриптазой, но взаимодействует с интегразой ВИЧ-1. | ||
3 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Роль белков SFPQ и NONO в репликации ВИЧ-1 |
Результаты этапа: С использованием метода пептидного фишинга, а также делеционных и точечных мутантных форм интегразы и SFPQ был охарактеризован комплекс интегразы с SFPQ. Определены аминокислоты в составе SFPQ, участвующие во взаимодействии с ИН. Показано, что влияние SFPQ на интеграцию и обратную транскрипцию действительно обусловлено его взаимодействием с ИН. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".