Роль трансмембранного потенциала в процессах слияния и деления митохондрийНИР

The roles of transmembrane potential in mitochondria fusion and fission

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Роль трансмембранного потенциала в процессах слияния и деления митохондрий
Результаты этапа: 1. Наладка системы для исследования механизмов слияния митохондрий in vitro, основанной на splitGFP Для получения набора плазмид, в которых под PGAL промотором экспрессируется митохондриально адресованный splitGFP, был взят вектор pAqMHalvesZip (cм. Рисунок 1), любезно предоставленный нам лабораторией C. Лукьянова. Мы амплифицировали участки, содержащие гены AqMI-NZ и CZ-AqMII. С помощью ПЦР с праймерами, несущими на своих концах сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI, были получены продукты, размер, которых совпадали с расчетными и составили 629 п.н. и 410 п.н. соответственно. Амплифицированные фрагменты ДНК переосаждали и лигировали в вектор pYX223-mtGFP (Westermann & Newport, 2000; PMID: 11054823). Для создания данного вектора из плазмиды pYX223-mtGFP предварительно удалили экспрессионную кассету с помощью рестриктаз BamHI и XhoI. Отбор выращенных на чашках с ампициллином клонов E. сoli проводили с помощью рестрикционного анализа по сайтам BamHI и XhoI, находящимся по обеим сторонам от встройки в полилинкер вектора. Конечные конструкции получили название pCZ_mtGFP_YX223 и pNZ_mtGFP_YX223. Эти плазмиды были трансформированы в дрожжи дикого типа противоположных типов спаривания. В результате мы получили штамм PGAL-CZ- mitoGFP(MATalpha), содержащий pCZ_mtGFP_YX223, и штамм PGAL-NZ- mitoGFP (MATa) с плазмидой pNZ_mtGFP_YX223. Чтобы убедиться, что при слиянии белков, экспрессирующихся с этих двух плазмид, происходит образование функционального mtGFP, мы поставили опыт in vivo. Полученные штаммы в течение суток скрещивали на твердой среде YNB-HisRafGal, давая им возможность наработать белки, кодируемые генами, которые находятся в вышеописанных плазмидах под галактозным промотором. На следующий день клетки с твердой среды ресуспендировали в 100 мкл жидкой среды YNB-HisRafGal и наблюдали под микроскопом. В результате нами были обнаружены зиготы, образовавшиеся в процессе скрещивания дрожжей, которые демонстрировали флуоресценцию mitoGFP в области митохондриального ретикулума (Рисунок 2). Из полученных штаммов мы выделили митохондрии и показали, что дыхательный контроль (VFCCP/V0) для обоих препаратов превышает 2.1. Мы поставили предварительные эксперименты по in vitro слиянию митохондрий, изолированных из этих штаммов. Для этого был использован протокол, опубликованный Meeusen et al. 2004; PMID: 15297626. Однако, как оказалось в нашем случае с системой splitGFP, даже в контрольных условиях — оптимальных для слияния митохондрий — процент митохондрий, в которых наблюдался сигнал от гетеродимера pCZ и pNZ не превышал 1% от общего числа митохондрий. Общее число митохондрий визуализировали по флуоресценции ДНК- интеркалирующего агента DAPI или потенциал-зависимого зонда тетраметилродамина. Такой низкий процент слившихся митохондрий крайне затруднял количественный анализ полученных результатов. В дальнейших экспериментах мы планируем увеличить эффективность нашей тест-системы слияния митохондрий in vitro. 2. Исследование роли митохондриальной ДНК в процессах слияния митохондрий дрожжей в системах in vivo Клетки, экспрессирующие флуоресцентный белок GFP с сигналом митохондриальной локализации, освежали ночь в жидкой среде YNB- HisRafGal и инкубировали с различными ингибиторами, затем фотографировали препараты и считали процент клеток с различной морфологией для каждого штамма. Воздействия ингибитора гликолиза дезоксиглюкозы и разобщителя дыхательной цепи FCCP вызывали значительную фрагментацию митохондриального ретикулума, в то время как добавление ингибитора АТР-синтазы олигомицина и ингибитора III комплекса дыхательной цепи не оказывало какого-либо значимого эффекта (Рисунок 3). Так как метаболизм клеток, полностью лишенных митохондриальной ДНК (Rho0), не отличается от метаболизма клеток, содержащих нефункциональную мтДНК, сохранившую лишь небольшие участки кодирующей последовательности (Rho-), мы ожидали увидеть различие в структуре митохондриального ретикулума Rho- и Rho0 клеток в норме или в присутствии разобщителя. Мы исследовали влияние разобщителя FCCP на динамику митохондрий штаммов дрожжей, содержащих нормальную (Rho+), мутантную форму мтДНК (Rho-) и штамма без мтДНК (Rho0). Клетки инкубировали в присутствии 5 мкМ FCCP в течение 10-15 мин. Увеличение доли клеток с раздробленными митохондриями под воздействием разобщителя происходило во всех исследуемых штаммах. При этом, штаммы Rho- и Rho0 не отличались друг от друга по степени дробления митохондрий ни в контроле, ни под действием FCCP (Рисунок 4). Для нарушения баланса NTP/NDP в клетках мы планировали использовать бонгкрековую кислоту, ингибирующую ATP/ADP антипортер со стороны митохондриального матрикса. Прежде всего, было необходимо определить концентрацию, снижающую скорость роста дрожжей на среде с несбраживаемым субстратом (глицерином). Подсчет колониеобразующих единиц не выявил эффекта от применения бонгкрековой кислоты не только в штамме дикого типа, но и в штамме AD12345678-tax с нефункциональными ABC-транспортерами. В совокупности с литературными данным это говорит о том, что бонгрековая кислота не проникает в клетки дрожжей лабораторных штаммов, даже в условиях репрессии множественной лекарственной устойчивости, опосредованной ABC-переносчиками. Для дальнейшего исследования было решено использовать штаммы, в которых ген ATP/ADP антипортера поставлен под контролируемый галактозный промотор. Ранее в нашей лаборатории уже был получен штамм, содержащий под галактозным промотором другой ген ATP/ADP антипортера – PET9 (AAC2) и демонстрирующий крайне низкую скорость роста на среде без галактозы. С помощью скрещивания данного штамма со штаммом IDH1- mitoGFP, полученным благодаря гомологичной рекомбинации, и растаскивания тетрад мы создали новый штамм - IDH1-mitoGFP PGAL- PET9, конститутивно экспрессирующий митохондриальный GFP. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PET9 в гаплоидном штамме IDH1- GFP PGAL-PET9 приводит к тому, что большая часть клеток содержит «слитый» или «гиперслитый» митохондриальный ретикулум (см. методы и подходы для описания классификации клеток по структуре их митохондрий). Перенос клеток на глюкозу, репрессирующую галактозный промотор и полностью блокирующую экспрессию PET9, частично компенсировал этот фенотип, а инкубация на глюкозе в течение суток приводила к значительной фрагментации митохондриального ретикулума (Рисунок 5). 3. Генетический скринингу, направленный на поиск факторов компенсирующих репрессию гена FZO1 Мы получили штамм S. cerevisiae, в котором ген FZO1 поставлен под репрессируемый промотор PGAL. Мы проверили способность клекток этого штамма образовывать колонии на несбраживаемом субстрате (среда YPGly) и оценили наличие митохондриальной ДНК при индукции экспрессии (рост на среде YPGal) и в ее отсутствие (рост на среде YPD) с помощью окрашивания флуоресцентным красителем DAPI. Было показано, что в условиях репрессии FZO1 клетки быстро теряют мтДНК. Для того, чтобы подтвердить это наблюдение другим методом мы скрестили PGAL-FZO1 клетки с Rho0 штаммом, лишенным мтДНК, но содержащим функциональную копию гена FZO1. Оказалось, что образовавшиеся в результате скрещивания диплоидные клетки не могут расти на среде без сбраживаемых субстратов, что доказывает быструю потерю мтДНК при репрессии FZO1. По количеству делений, совершенных микроколониями штамма PGAL-FZO1/ura3 на среде с несбраживаемым субстратом — глицерином, мы определили динамику эрозии мтДНК в штамме с репрессированным FZO1. Было показано, что 97% клеток теряли функциональную мтДНК в течение 26 часов. В среднем, клетки за это время совершали 18 делений. Интересно, что это значение оказалось выше, чем количество делений, достаточное для «разбавления» мтДНК в условиях полного отсутствия репликации. В клетках дрожжей содержится по разным оценкам от 25 до 100 копий мтДНК (см. обзор литературы). Поэтому, в условиях полной остановки репликации мтДНК, такие клетки могут совершить максимум десять делений. Таким образом, косвенно, наши данные свидетельствуют о том, что в условиях репрессии FZO1 репликация мтДНК все-таки идет (пусть и с низкой эффективностью). На основе штамма PGAL-FZO1 путем скрещивания со штаммом URA3 мы получили диплоидный штамм PGAL-FZO1/FZO1 URA3/ura3, гетерозиготный по FZO1 (с копией гена дикого типа и мутантной копией, поставленной под индуцируемый галактозо-регулируемый промотор GAL) и по URA3. Образовавшийся диплоид выращивали на двойной селективной среде YNB-Ura-Trp, и пересаживали на среду для индукции спорообразования (ацетат калия, 2%). Полученные споры инкубировали с зимолиазой 25 и 50 минут для разрушения клеточной стенки, после чего наносили на YPD и YPD 5’-FOA. На YPD 5’-FOA должна была прорастать только половина всех спор (не имеющая функционального гена URA3) и не должны давать колоний диплоиды, содержащие функциональную копию URA3. После подсчета отношения выросших на двух средах колоний и сравнения его с теоретически ожидаемым мы выбрали интервал инкубации 25 минут как наиболее оптимальный. На основе штамма PGAL-FZO1/FZO1 URA3/ura3 путем трансформации интергационной делеционной библиотекой дрожжевых генов lib23 мы получили коллекцию из 5000 делеционных мутантов, необходимых для скрининга по поиску генов, делеция которых супрессирует репрессию гена FZO1. Из этих мутантов мы получили споры, которым разрушали клеточную стенку зимолиазой и переносили на среду YPGly 5’-FOA, получив колонии нормального размера, имеющие в геноме делецию, супрессирующую репрессию гена FZO1. Отобранные клоны мы проверили на предмет возможности скрещиваться с тестерным штаммом противоположного типа спаривания, чтобы убедиться в том, что мы получили гаплоидный клон, содержащий PGAL-FZO1, а не диплоидный, потерявший функциональную копию URA3. На следующем этапе проекта мы планируем проанализировать ДНК из этих штаммов, чтобы определить положение транспозонной вставки. Таким образом будут идентифицированы гены, инактивация которых приводит к компенсации фенотипа репрессии FZO1.
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Роль трансмембранного потенциала в процессах слияния и деления митохондрий
Результаты этапа: В отчетный период выявлена роль митохондриальной динамики в поддержании гетероплазмии зигот дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученных путем слияния гаплоидных клеток, содержащих мтДНК дикого типа [Rho+] и мутантную мтДНК [Rho-]. Мы показали, что добавление разобщителей препятствует потере мтДНК дикого типа в линиях клеток, полученных из таких зигот с гетероплазмией. Было показано, что для данного эффекта необходимо наличие в клетках функциональной копии гена DNM1, кодирующего динамин-подобный белок. Это указывает на то, что для проявления эффекта разобщителя необходимо деление митохондрий. В то же время, мы показали, что использованная нами концентрация разобщителя не влияет на эффективность слияние митохондрий в зиготах. В продолжение исследований переносчиков адениновых нуклеоитидов, начатых на прошлом этапе проекта, мы показали, что репрессия “минорных” паралогов PET9 не оказывают значительного влияния на структуру митохондриального ретикулума в клетках дрожжей. В результате анализа штаммов, полученных в ходе генетического скрининга, идентифицированы гены, сверхэкспрессия (DIA2, PRP9, MAC1, UBC7 или OXA1) или нарушение (ERO1, UTP22) которых компенсирует делецию гена митофузина FZO1. На следующем этапе мы планируем проверить обнаруженные генетические взаимодействия на независимых трансформантах. Обнаружено, что с увеличением репликативного возраста клетки происходит изменение структуры митохондрий, связанное с большей раздробленностью митохондриальной сети.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Роль трансмембранного потенциала в процессах слияния и деления митохондрий
Результаты этапа: Мы исследовали особенности митохондриальной динамики в клетках дрожжей с подавленным обменом адениновых нуклеотидов между цитоплазмой и матриксом митохондрий. Для этого был получен и охарактеризован штамм с репрессированным геном АТФ/АДФ переносчика — PET9. Скорость поглощения кислорода митохондриями, изолированными из клеток этого штамма, не увеличивалась в ответ на добавление АДФ, но значительно возрастала в ответ на добавление разобщителей. В этом штамме мы исследовали изменение структуры митохондриальной сети при воздействии разобщителей, а также ингибиторов дыхательной цепи, АТФ-синтазы и гликолиза. Мы показали, что разобщители дыхания и фосфорилирования вызывают фрагментацию митохондрий в клетках дикого типа, но не в клетках pet9. В то же время, митохондрии без ключевого АТФ\АДФ антипортера Pet9p сохраняли способность к слиянию с низкоэнергизованными митохондриями из респираторно-некомпетентных клеток. Кроме того мы обнаружили, что ингибирование АТФ-синтазы олигомицином вызывает дробление митохондрий как в клетках дикого типа, так и в pet9 штамме. В совокупности наши данные свидетельствуют в пользу того, что трансмембранный потенциал играет лишь опосредованную роль в процессе слиянии митохондрий. В процессе выполнения проекта мы обнаружили, что репликативное старение во многом обуславливает различия в структуре митохондрий генетически однородной культуры клеток дрожжей: c увеличением репликативного возраста увеличивается степень фрагментации митохондриальной сети. В рамках проекта мы также провели генетический скрининг, направленный на поиск супрессоров делеции митофузина FZO1. В результате мы обнаружили гены OXA1 (инсертаза внешней мембраны митохондрий) и MAC1 (Сu2+-чувствительный транскрипционный фактор). Мы показали, что эти гены принимают участие в работе или регуляции митохондриальной динамики, а их делеция вызывает смещение равновесия процессов слияния и деления митохондрий в сторону слияния.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".