ИСТИНА

целью исследования является оценка субпопуляции CAF в первичной опухоли и метастазах в лимфатических узлах и их роли в канцерогенезе колоректального рака

Carcinogenesis and tumor progression is not caused directly by malignant cells but by a tumor stroma around cancer stem cells which performs regulatory, nutritional and "framework" functions and is represented by mesenchymal cells of various types, the main of which are cancer-associated fibroblasts (CAF). αSMA, FAP-1, desmin, podoplanin, neuron-glial antigen 2 (NG2), PDGFR-α and -β are used for identification of CAF, however, due to the plasticity of the cell population, none of them is universal, which forms a subset of CAF. CAF subpopulations are not described for colorectal cancer which makes it relevant and current for this study. It is supposed to assess the ratio of the CAF population in colorectal cancer, their relationship with the presence of metastases in regional lymph nodes, invasion into the blood and lymph vessels, stage, and other clinical and morphological data. The results will reveal a correlation between the CAF markers and the prognosis of colorectal cancer which is valuable for the diagnosis and subsequent development of targeted therapy.

Ожидается выявить различные субпопуляции CAF в первичной опухоли колоректального рака и сравнить их с субпопуляциями в метастазах. Выявленная корреляция между конкретной субпопуляцией и клинико-морфологическими данными позволит обозначить конкретный маркер, имеющий предикторное значение для пациентов с колоректальным раком. Данный маркер (антитело) может быть впоследствии использован в качестве диагностического для оценки метастатического потенциала колоректального рака у конкретного пациента, а также данный маркер может впоследствии явиться целью для создания терапевтических препаратов, таргетно направленных на выявленную субпопуляцию CAF с целью снижения рисков метастазирования.

Харлова О.А. с 2014 года занимается проблемами колоректального рака и предопухолевых поражений толстой кишки. Имеется достаточный накопленный опыт исследования опухолевых стволовых клеток и оценки злокачественного потенциала новообразований толстой кишки. Разработана и апробирована собственная панель иммуногистохимических маркеров опухолевых стволовых клеток, панель маркеров плотных контактов. По результатам трехлетней работы (2014-2017 гг.) по данной теме опубликован целый ряд публикаций и в 2018 году защищена кандидатская диссертация, по итогам защиты которой предложен новый подход к классификации эпителиальных новообразований толстой кишки. "Морфологические и иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики предопухолевых образований толстой кишки" Кандидатская диссертация по специальности 14.03.02 - Патологическая анатомия (мед. науки) Автор: Харлова О.А., к.м.н., МГУ имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: Мальков П.Г., д.м.н., доц., МГУ имени М.В. Ломоносова Защищена в совете Д 208.072.04 при ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Кафедра физиологии и общей патологии Организация, в которой выполнялась работа: ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», факультет фундаментальной медицины Ведущая организация: ФГБОУ ВО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава России Оппоненты: Михалева Л.М., Гаганов Л.Е.

Основной целью Проекта было изучение опухоль-ассоциированных фибробластов (CAF) в колоректальном раке. CAF – неэпителиальные неиммунные клетки с мезенхимными свойствами, расположенные в строме опухоли или по ее краю. Изучение CAF является перспективным направлением в исследовании колоректального рака, так как для ряда злокачественных новообразований доказана роль CAF в опухолевой прогрессии. Одна из основных сложностей в изучении CAF заключается в отсутствии единого маркера для их выявления, а также перекрестной реактивности маркеров CAF и элементов опухолевой и неопухолевой стромы, что усложняет как выявление CAF, так и препятствует достоверной оценке уровня экспрессии. На основании анализа данных мировой литературы, посвященных исследованию CAF в колоректальном раке, сформирована панель антител, использование которых позволяет наиболее достоверно выявить CAF в опухолевой строме колоректальных аденокарцином, - αSMA, FAP, PDGFRα, PDGFRβ и POD. В рамках реализации Проекта для выявления CAF было использовано два варианта иммуногистохимического исследования – исследование с дуплексной меткой и флюоресцентное мультиплексное окрашивание. Для проведения ИГХ с дуплексной меткой был использован набор для двойного окрашивания Double Stain IHC Kit: M&R on human tissue. Постановка одновременно двух иммуногистохимических реакций на одном срезе опухоли позволила не только оценить экспрессию каждого из указанных маркеров CAF, но и оценить их ко-локализацию. Также использование системы для двойного окрашивания позволило более наглядно продемонстрировать и объективно оценить тропность CAF к опухолевым почкованиям («tumor budding»), которые представляют собой единичные опухолевые клетки или кластеров не более чем из 4 клеток в инвазивном крае. Всего в исследование включены образцы 49 аденокарцином толстой кишки, в 12,2% случаев – с наличием очагов муцинозной дифференцировки. Большинство случаев (61,2%) составляли опухоли Т3. В 30 случаях были выявлены метастазы в регионарных лимфатических узлах, в 3 случаях - отдаленные метастазы. Во всех случаях была произведена оценка экспрессии CAF в трех зонах опухоли – апикальной, центральной и инвазивном крае. Методом цветоделения выделяли и подсчитывали площадь каждой метки. Проведен сравнительный анализ уровней экспрессии маркеров CAF и основных клинико-морфологических характеристик опухолей: выявлена значимая корреляция между высоким уровнем экспрессии PDGFRα и PDGFRβ в апикальной зоне и более глубокой инвазией опухоли (Т3-Т4) (р=0,0281 и р=0,0137). Также обнаружено, что высокий уровень экспрессии αSMA в апикальной (р=0,0001) и центральной зоне (р=0,019), POD в апикальной (р=0,0222) и центральной зоне (р=0,0206), PDGFRβ в апикальной зоне (р=0,014) достоверно коррелируют с наличием метастазов в лимфатических узлах. При сравнении значений маркеров между собой обращают внимание более высокие показатели экспрессии PDGFRβ и αSMA, при низких показателях PDGFRα в центральной и инвазивной зонах. Отмечен высокий уровень экспрессии PDGFRβ во всех зонах большинства наблюдений. Выявлен более высокий уровень экспрессии и αSMA в инвазивном крае и центральной части по сравнению с апикальной (р=0,0081), а также более высокий уровень экспрессии POD в апикальной части (р=0,0138). Установленные различия свидетельствуют о выраженной гетерогенности популяции CAF. Корреляционный анализ определил сильную обратную связь между уровнем αSMA и FAP в центральной зоне (r=0,79, p=0,034), что свидетельствует о разном биологическом значении FAP и αSMA. В ходе анализа изображений было отмечено и описано расположение маркеров в каждой паре относительно опухолевых комплексов. Обнаружено, что в разных случаях внутренний слой отличался. В части случаев ближайшим оказался αSMA, в других - POD или PDGFRβ. При этом в рамках каждого из описанных случаев обнаружены зоны смешанной экспрессии FAP/αSMA и POD/αSMA. При анализе клинико-морфологических корреляций было выявлено, что случаи, в которых внутренний слой CAF представлен αSMA, значительно чаще характеризовались наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы по сравнению со случаями, в которых во внутреннем слое была выявлена смешанная экспрессия маркеров CAF (р=0,007) или экспрессия POD (р=0,024). Применение технологии дуплексной метки в исследованиях CAF делает возможным выделение и детальное изучение клеточного состава наиболее близкого к опухоли слоя стромы, который вероятно вносит основной вклад в эпителиально-мезенхимное взаимодействие, обуславливая биологическое поведение опухоли. На материале 43 случаев аденокарциномы толстой кишки (с наличием фокусов муцинозной дифференцировки в 11 случаях) также было проведено синхронное иммуногистохимическое исследование с антителами к POD и PCK для достоверного контрастирования опухолевых почкований, включенных ВОЗ в число прогностически значимых морфологических критериев. Экспрессию POD оценивали в «горячих точках» («hot spot») непосредственно вокруг опухолевых почкований и в инвазивном крае, использовали полуколичественный и количественный метод с подсчетом площади метки. Опухолевые почкования были обнаружены в 53,5% случаев. Экспрессия POD разной степени выраженности была выявлена в 54,6% аденокарцином с муцинозным компонентом и в 59,4% аденокарцином без муцинозного компонента (p=0,678). Установлено, что выраженность экспрессии POD вокруг опухолевых почкований достоверно соответствует реакции в инвазивном крае (p=0,0016), что исключает необходимость оценивать ее именно вокруг опухолевых почкований. Отмечено, что в большинстве аденокарцином с муцинозным компонентом наблюдалась выраженная экспрессия POD непосредственно вокруг муцинозных комплексов и «озер слизи». Выявленные взаимосвязи между наличием опухолевых почкований и глубиной инвазии Т3-Т4 (p=0,023), наличием опухолевых почкований и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы (p=0,068), а также тенденция к наличию связи между уровнем POD вокруг почкований и глубиной инвазии (p=0,088) свидетельствуют о решающей прогностической роли опухолевых почкований и об отсутствии тропности POD-положительных CAF к опухолевым комплексам. Для оценки субпопуляций MAF (ассоциированные с метастазами фибробласты, metastasis-associated fibroblasts) с помощью технологии дуплексной метки были исследованы образцы 26 аденокарцином и их метастазов в регионарные лимфатические узлы. Во всех метастатически пораженных лимфоузлах отмечена экспрессия SMA в веретеновидных клетках стромы вокруг опухолевых комплексов. Реакция была выраженная, селективная, не очаговая. Реакция POD в большинстве метастазов отсутствовала (65,4%). В 9 случаях наблюдалась очаговая реакция POD в зонах, идентичных SMA-положительным зонам. Корреляций между уровнем реакции POD в инвазивном крае опухоли и метастазе, а также между количеством метастатически пораженных лимфоузлов и наличием реакции POD в метастазе не выявлено (p>0,05). Реакция PDGFRb выявлена в 88,5% случаев: окрашивались волокнистые структуры в строме метастаза. В 12 случаях выраженность реакции PDGFRb в инвазивном крае первичной опухоли и метастазе совпала. Корреляции между количеством метастатически пораженных лимфоузлов и выраженностью реакции PDGFRb в метастазе не выявлено. В данном исследовании впервые показано, что субпопуляции СAF в регионарных лимфоузлах колоректального рака и в первичной опухоли статистически отличаются, что согласуется с общемировой концепцией об отсутствии прямой связи этих двух популяций. Также в единственном выявленном эмболе в кровеносном сосуде отсутствовала экспрессия POD и PDGFRb, несмотря на положительную реакцию этих маркеров в первичной опухоли и в метастазе, что косвенно подтверждает теорию возникновения СAF в метастазах «de novo», а не переноса из первичной опухоли. Помимо исследования аденокарцином было проведено исследование распределения CAF в строме предопухолевых образований толстой кишки – на препаратах 22 тубулярных и тубуло-ворсинчатых аденом. По результатам исследования не было выявлено достоверных отличий между выраженностью экспрессии и характером распределения маркеров CAF в строме аденом и собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки. Флюоресцентное мультиплексное окрашивание выполнено с использованием набора для семицветного ручного иммуногистохимического окрашивания OPAL 7-COLOR MANUAL IHC KIT для антител FAP, PDGFRβ, POD, CD31 и PCK после разработки оригинального протокола окрашивания на препаратах 10 аденокарцином. Анализ результатов окрашивания проводился с использованием системы для мультиплексной визуализации Mantra 2 Quantitative Pathology Imaging System. При анализе результатов флюоресцентного окрашивания статистически значимой разницы по уровню каждого из маркеров (PDGFRβ, POD, FAP, CD31) между разными зонами опухоли выявлено не было. Средние значения составили для POD– 38,65%, FAP– 41,64%, PDGFRβ –33,36%, CD31 – 5,68%. Были исследованы шесть пар маркеров: CD31+FAP, CD31+PDGFRβ, CD31+POD, FAP+PDGFRβ, FAP+POD, PDGFRβ+POD. Результат анализа площади совместного и различного окрашивания свидетельствует о том, что маркеры CD31 и маркеры CAF экспрессируются в принципиально в разных структурах. В парах FAP+PDGFRβ и FAP+POD (p<0,0001) значимо выше оказалась площадь их совместного окрашивания, следовательно они выявляют одну субпопуляцияю CAF. При анализе распределения меток отдельно в разных зонах выявлено, что статистически значимая ко-локализация в паре FAP+POD присутствует только в апикальной зоне опухоли. Это позволяет предположить, что зафиксированная ко-экспрессия FAP и POD выявила незрелые фибробласты грануляционной ткани, окружающей участки изъязвления слизистой оболочки. Также оценивалось распределение маркеров FAP, PDGFRβ, POD вокруг опухолевых почкований и вблизи окрашенных CD31 сосудами. Во всех шести случаях с опухолевыми почкованиями наблюдается выраженная видимая реакция FAP вблизи них. Так же в образцах с опухолевыми почкованиями наблюдается более высокий уровень POD в инвазивном крае (среднее значение в случаях без почкований – 40,3%; в случаях с почкованиями – 78,2%). В случаях с опухолевыми почкованиями и без них средний уровень FAP не отличался (80,9% и 87,17% соответственно), однако при наличии опухолевых почкований большая часть FAP-положительных клеток концентрировалась вокруг опухолевых почкований. Разработанная оригинальная методика окрашивания CAF с использованием системы для мультиплексного флюоресцентного иммуногистохимического окрашивания, несмотря на трудоемкость процесса, представляется весьма перспективным направлением в исследовании опухолевой стромы, так как позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров на одном срезе, что позволяет наиболее достоверно выявлять особенности их распределения и взаимного влияния.