ИСТИНА

Целью настоящего проекта является исследование роли внеклеточных мембранных везикул (ВМВ) во взаимодействии вирусов и растений-хозяев. С использованием в качестве модельной системы растений N. benthamiana, инфицированных Х-вирусом картофеля (ХВК), в ходе выполнения проекта будут решаться следующие задачи:
1) флуоресцентное мечение репликативных комплексов ХВК;
2) анализ ВМВ, выделенных из листьев растений N. benthamiana, инфицированных ХВК;
3) идентификация ХВК-специфических ВМВ в ксилеме и флоэме;
4) анализ биогенеза и свойств ВМВ.

Recent studies have shown that plant cells may form extracellular membrane vesicles (EMV). The origin, composition and function of these vesicles is poorly known. In particular, the role of the EMV in viral infection is not entirely clear. This project is aimed at solving the problem of comprehensive structural and functional characterization of EMV in plant infection with potexviruses. This study on the model of potato virus X will be the first for Sindbis-like RNA viruses. We will perform pilot detection of EMV in vivo, characterize their intracellular formation and delivery into the extracellular compartments. Possible molecular interactions of EMV with viral nucleic acids and replication complexes will be studied. The results obtained in the course of the project will obviously contribute to the knowledge in the field of plant molecular virology.

На модели Х-вируса картофеля будет впервые для Синдбис-подобных рибовирусов осуществлена экспериментальная детекция ВМВ in vivo, охарактеризованы стадии их внутриклеточного формирования и доставки во внеклеточные компартменты. Будут изучены возможные молекулярные взаимодействия ВМВ с вирусными нуклеиновыми кислотами. Будут идентифицированы состав ВМВ и сигналы, определяющие их способность к направленному внетриклеточному транспорту по растению. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, внесут очевидный вклад в знания в области молекулярной вирусологии растений. Таким образом, данный проект имеет преимущественно фундаментальную значимость.

В нашем научном коллективе были впервые идентифицированы и охарактеризованы целый ряд вирусов растений и их белков, включая транспортные белки потексвирусов и вируса гибискуса, репликазные белки клостеровирусов, цистеин-богатые белки карлавирусов и помовирусов, ОРС6 микропротеины тобамовирусов, белки растений 4/1 и ВАР-подобные белки. Изучена внутриклеточная локализация ряда мембранных транспортных белков, ОРС6-микропротеина тобамовирусов, а также белков растений 4/1 и мембранного белка BAPL. Описан внутриклеточный и межклеточный транспорт этих белков. Выявлена роль эндоплазматического ретикулума и актинового цитоскелета в транспорте ряда перечисленных белков. Изучены биохимические свойства транспортного белка потексвирусов ТБГ1, особенности его взаимодействия с вирусной РНК, функциональные активности. Изучена субклеточная локализация коротких гидрофобных транспортных белков ТБГ2 и ТБГ3, описано явление ТБГ3-зависимого внутриклеточного транспорта белка ТБГ2. Выявлено, что внутриклеточный мембрано-зависимый транспорт к периферии клетки белка ТБГ3 использует неканонический механизм, не связанный с аппаратом Гольджи, картированы сигналы транспорта белка ТБГ3. Показано, что клеточный белок 4/1 имеет двойственную локализацию в клетке. Сигнальные последовательности в этого белка обеспечивают, с одной стороны доставку его в ядро клетки, а с другой выход из ядра и компартментализацию в мембранных структурах. Результаты этих исследований были опубликованы в международных научных журналах.

К концу 2021 года будут решены следующие задачи:
1) Анализ роли ВМВ в распространении вирусной инфекции в зараженном растении.
Будет проведено исследование инфекционности препаратов ВМВ. С помощью конфокальной микроскопии будет определены типы клеток, в которых возможно инициирование инфекции.
 2) Изучение роли нерепликативных белков ХВК, включая трнаспортные белки, в биогенезе ВМВ.
Возможность формирования вирус-специфических ВМВ в отсутствие нерепликативных белков ХВК будет изучено в экспериментах по выделению ВМВ из листьев N. benthamiana, агроинфильтрированных конструкцией PVX-REP-mRFP, которая представляет собой модифицированный геном ХВК, кодирующий только вирусную репликазу и белок mRFP, и MET-HEL-GFP. Для детекции вирус-специфических ВМВ полученные препараты будут анализироваться на предмет присутствия белка MET-HEL-GFP с помощью иммуноблота в сравнении с аналогичными препаратами из листьев, агроинфильтрированных комбинацией конструкций PVX-mRFP и MET-HEL-GFP. Для того, чтобы оценить вклад нерепликативных белков ХВК в образование вирус-специфических МВМ или эффективность их образования, будут проведены аналогичные эксперименты, в которых конструкция MET-HEL-GFP будет ко-агроинфильтрирована с векторами, несущими гены индивидуальных белков ХВК, или с комбинациями таких векторов. Сравнительный выход вирус-специфических ВМВ будет анализироваться иммуноблотом с антителами к GFP.
 3) Изучение природы ХВК-специфических ВМВ.
Будет проведена детекция маркеров различных субклеточных компартментов в препаратах ВМВ из здоровых растений и растений, зараженных ХВК в условиях флуоресцентного мечения вирусных репликативных компартментов. В этой работе будут использованы маркеры ЭПР и АГ, слитые с mRFP, имеющиеся в нашем распоряжении, а также слитые с mRFP маркеры ранних и поздних эндомсом, а также плазматической мембраны (ПМ), которые будут сконструированы в ходе выполнения данного проекта. Для ранних эндосом маркером будет служить SYP61, для поздних эндосом – RABF1/ARA6, для ПМ – PIP2A. Кодирующие последовательности этих белков будут амплифицированы и клонированы в составе плазмидных векторов. На их основе будут получены бинарные векторы, несущие последовательности данных генов, слитые с mRFP, под контролем 35S-промотера. Полученные конструкции будут ко-агроинфильтрированы либо с конструкцией PVX-GFP; препараты из инфильтрированных и контрольных, не-инфильтрированных листьев будут анализироваться с помощью иммуноблота с антителами к mRFP. Помимо этого маркерные конструкции будут экспрессироваться в листьях, инфицированных вариантами ХВК, продуцирующими флуоресцентно-меченые репликативные комплексы. Ко-локализация репликативных комплексов и маркерных белков будет изучена с помощью конфокальной микроскопии.