ИСТИНА

Спектроскопия ЯМР – один из важнейших биофизических методов, предоставляющих уникальную информацию о структуре и динамических свойствах биомакромолекул, а также о межмолекулярных взаимодействиях, в которых они участвуют. Традиционные методы ЯМР позволяют изучать сравнительно небольшие белки, большинство из которых на данный момент хорошо изучены. Увеличение массы исследуемых объектов требует применения новых подходов и методик ЯМР. Так, важным источником структурной информации служат остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия, эффекты парамагнитного усиления релаксации и псевдоконтактные сдвиги, индуцируемые парамагнитными ионами лантанидов. Научная идея, лежащая в основе настоящего проекта, состоит в использовании парамагнитных меток для изучения метилтрансфераз (МТаз), прочно связывающих кофактор S-аденозил-L-метионин (SAM). МТазы играют важную роль в функционировании живых систем, катализируя протекание реакций метилирования ДНК, РНК, белков и малых молекул, включая эндогенные соединения и лекарственные препараты. Большое количество заболеваний человека связано с нарушениями в работе этих ферментов. Селективное управление активностью МТаз с помощью низкомолекулярных ингибиторов представляется весьма перспективным подходом в терапии этих заболеваний. Для рационального дизайна таких потенциальных лекарственных препаратов необходима информация о структурах ферментов и их взаимодействии с низкомолекулярными лигандами. В проекте планируется синтезировать ряд новых производных SAM для введения спиновой метки или магнитно-активного ядра (19F, 13C) в каталитический центр МТаз для получения информации об их структуре методами спектроскопии ЯМР. Планируемое исследование является продолжением и развитием начатого в 2017 году проекта РФФИ 17-04-00852, посвященного изучению метилтрансферазы WBSCR27, ассоциированной с синдромом Вильямса-Бойрена. В рамках настоящего проекта планируется синтезировать серию аналогов SAM и исследовать их взаимодействие с белком WBSCR27. На этой основе будет проведено уточнение структуры высокого разрешения WBSCR27 в растворе. Планируется отобрать аналоги SAM, обладающие наилучшими свойствами для их использования в качестве инструмента структурных исследований новых МТаз. В числе новых объектов исследования с использованием этого инструмента выбраны метилтрансферазы Thumpd2 и Mettl8, информация о которых в настоящее время крайне ограничена. Генно-инженерными методами планируется получить полноразмерные белки и/или их функционально значимые домены, обогащенные стабильными изотопами 13С, 15N и, при необходимости, 2D. Для полученных белков будет определено отнесение сигналов в спектрах ЯМР. Дальнейшее изучение комплексов новых МТаз с созданными аналогами SAM позволит получить информацию о строении ферментов и их центров связывания кофактора. Основными научными задачами, которые предполагается решить в рамках настоящего проекта, являются: 1. Получение синтетических производных SAM, содержащих спиновую метку. 2. Изучение взаимодействия каждого нового соединения с белком WBSCR27, выбранным в качестве модельного объекта, с целью установления их пригодности для структурно-функциональных исследований метилтрансфераз методами спектроскопии ЯМР. 3. Уточнение структуры метилтрансферазы WBSCR27 в растворе с помощью выбранных молекул. 4. Получение новых фармакологически-значимых метилтрансфераз, пригодных для изучения их методами ЯМР. 5. Апробация разработанных подходов. Применение новых синтетических аналогов SAM, содержащих спиновую метку, для изучения структуры новых метилтрансфераз.

NMR spectroscopy is one of the most important biophysical techniques providing unique information on the structure and dynamics of biomacromolecules, as well as on the intermolecular interactions in which they participate. However, traditional NMR methods allow the study of relatively small proteins, which to date almost all have already been studied. An increase in the size of the studied objects requires the use of new approaches and NMR methods. Thus, the residual dipolar constants, the effects of paramagnetic relaxation enhancement, and pseudo-contact shifts induced by paramagnetic lanthanide ions are an important source of structural information. The scientific idea underlying this project is the use of paramagnetic labels to study methyltransferases (MTases), which strongly bind the co-factor S-adenosyl-L-methionine (SAM). MTases play an important role in the functioning of living systems, catalyzing the methylation of DNA, RNA, proteins, and small molecules, including endogenous compounds and drugs. A large number of human diseases are associated with impaired functioning of these enzymes. Selective control of MTase activity using low molecular weight inhibitors seems to be a very promising approach in the treatment of these diseases. For the rational design of such potential drugs, some information is required on the structure of the enzyme and its interaction with low molecular weight ligands. The project plans to synthesize a number of new SAM derivatives for introducing a spin label or magnetically active nucleus (19F, 13C) into the MTase catalytic center to obtain information on its structure by NMR spectroscopy. The planned study is a continuation and elaboration of the RFBR project launched in 2017, 17-04-00852, dedicated to the study of methyltransferase WBSCR27 associated with Williams- Beuren syndrome. Within the framework of this project, it is planned to synthesize a series of new SAM analogues and study their interaction with the WBSCR27 protein. On the basis of obtained results, the high-resolution structure of WBSCR27 in solution will be refined. It is planned to select SAM analogues that have the best properties for their use as a tool for structural studies of new MTases. Among the new research objects using the designed tool are Thumpd2 and Mettl8 methyltransferases, information on which is currently limited. It is planned using the genetic engineering techiques to obtain full-sized proteins and/or their functionally significant domains enriched in stable 13C, 15N and 2D isotopes. For the obtained proteins, the assignment of the signals in NMR spectra will be determined. Further study of the complexes of new MTases with the designed SAM analogues will provide information on the structure of the enzymes and the co-factor binding centers.

В результате выполнения проекта планируется получение новой информации, которая имеет как фундаментальную, так и потенциальную прикладную значимость. В ходе реализации проекта будут получены и охарактеризованы новые синтетические аналоги кофактора SAM. Будут разработаны наиболее эффективные методики синтеза этих соединений. Будет исследовано взаимодействие новых аналогов SAM с МТазой WBSCR27, как моделью МТаз класса I. Полученные данные будут использованы, как для картирования центра связывания синтезированных аналогов SAM, так и для уточнения структуры белка WBSCR27. Результаты синтетических исследований и изучения взаимодействия полученных соединений с модельной МТазой будут предметом 1-2 публикаций в рецензируемых журналах. Результаты уточнения структуры МТазы WBSCR27 с использованием структурных ограничений дальних порядков, полученных с помощью синтезированных парамагнитных меток, будут предметом публикации в высокорейтинговом журнале. Разработанные подходы, основанные на использовании новых синтетических аналогов SAM будут использованы и для изучения строения и свойств метилтрансфераз, значимых для медицины. В ходе исследования будут изучены структуры 1-2 ранее не исследованных МТаз. Исследование в этом направлении будет начато для белка Thumpd2, для которого известен субстрат реакции метилирования. Будет получен образец Thumpd2, обогащенный изотопами 13C и/или 15N. Методами ЯМР с ним будет изучено взаимодействие новых аналогов SAM, содержащих парамагнитные метки. Перспективы развития этого направления и уровень публикаций по результатам этих исследований будут зависеть от свойств новых белков и качества полученной информации об их строении.

Группа руководителя проекта имеет большой опыт определения структур белков в растворе и изучения их динамических свойств методами спектроскопии ЯМР. Руководитель проекта является автором 20-ти структур белков или их комплексов, депонированных в базу данных Protein Data Bank (PDB 1AO8, 1BZF, 1DIS, 1PS2, 1DIU, 1LUD, 1YHO, 2LI9, 2MGT, 2KTU, 2L28, 2LF1, 2LLX, 2HI7, 2HM9, 2HQP, 2HST, 2KTV, 5LGF, 6Q44). У руководителя проекта имеется также большой задел в виде созданных или создаваемых им компьютерных программ, предназначенных для выполнения задач настоящего проекта. Среди них программа NMRTABLE, предназначенная для работы с базами данных, полученных из спектров ЯМР сложных биосистем, NMRest, предназначенная для ускорения расчета структуры биомолекул, RelaxFit, предназначенная для расчета динамических характеристик молекул по данным релаксационных измерений, программа AngleSearch, используемая для расчета ограничений на торсионные углы и выполнения стереоспецифического отнесения сигналов и другие. В группе руководителя проекта имеется опыт изучения белок-лигандных взаимодействий и выполнения молекулярно-динамических и квантово-химических расчетов, требуемых для достижения задач проекта.