ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Данная работа включает в себя исследование механизмов и факторов, обеспечивающих пространственную мобильность протоонкогенов, и их роли в возникновении хромосомных транслокаций, ассоциированных с онкологическими заболеваниями человека, создание клеточных моделей заболеваний, а также изучение белков клеточной адгезии и создание адресующих молекул к клеткам опухолей для медицинского применения.
This work includes research into the mechanisms and factors that provide spatial mobility of protooncogens and their role in the emergence of chromosomal translocations associated with human cancer, the creation of cellular models of disease, as well as the study of cell adhesion proteins and the creation of cellular targeting molecules for medical use.
В результате выполнения работ будут получены новые фундаментальные знания о биологических механизмах механизмов и факторах, обеспечивающих пространственную мобильность протоонкогенов, и о их роли в возникновении хромосомных транслокаций, ассоциированных с онкологическими заболеваниями человека. Будут созданы новые клеточные модели различных неоплазий. Также будут расширены представления о функциях белков клеточной адгезии, их роли в процессах метастазирования злокачественных опухолей, разработаны новые подходы к разработке адресующих молекул к клеткам опухолей для медицинского применения.
Тема является продолжением темы АААА-А16-116021660086-5 "Изучение молекулярных основ онкогенеза" (2016-2020гг). Реализуемость обеспечивается существенным теоретическим и экспериментальным заделом коллектива исполнителей. Исполнители имеют опыт создания различных модельных клеточных линий для изучения разных аспектов онкогенеза, владеют техниками редактирования генома (в том числе с использованием CRISPR/Cas и TALEN). Авторы владеют современными биохимическими, цитологическими, молекулярно-биологическими, а также биоинформатическими методами. В работе группы используется специальное программное обеспечение, в том числе являющееся собственной разработкой коллектива. Недавно нами был разработан метод ENIT для проверки гидовых РНК, а также метод скрининга клонов на предмет наличия транслокаций, которые будут использоваться при выполнении заявляемого плана исследований.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: Основным результатом, полученным за отчетный период стало получение всех плазмидных конструкций, предназначенных для индукции целевых транслокаций с участием гена MLL и последующей детекции клеток с транслокацией, трансфекция этими конструкциями клеток, отбор клеток по селектирующему маркеру и проверка на наличие транслокаций. Были собраны плазмиды, содержащие плечи гомологии к генам-партнерам по моделируемым перестройкам и контрольной перестройки с GCG: MLL_i9–AF6, MLL_i9–GCG, MLL_i10–BTBD18, MLL_i10–GCG, MLL_i11–AF4, MLL_i11–ARHGAP26, MLL_i11–GCG, MLL_i23–AF6, MLL_i23–GCG. Между плечами гомологии находилась кассета с селектирующими маркерами — геном GFP и геном устойчивости к пуромицину; кассета должна интегрироваться в место транслокации с возможностью быть вырезанной Cre-рекомбиназой после отбора клеток. Были трансфицированы клетки моноклональной линии, которая предварительно была охарактеризована на предмет экспрессии целевых генов (HOXA9, HOXA10, MEIS1, PROM1, PBX3), для которых показана роль в развитии MLL-ассоциированных лейкозов. Также был изучен иммунофенотип этой исходной культуры клеток и ее пролиферативные свойства для последующего сравнения с соответствующими характеристиками клеток с транслокациями. Трансфицированные клетки были отобраны с помощью серии сортировок на предмет экспрессии гена GFP, который встраивается в участок на месте транслокации. Затем проведен ПЦР-анализ на наличие транслокации и приготовлены препараты для кариотипирования. Однако данная стратегия получения клеток с транслокациями показала себя недостаточно надежной, поэтому, перед тем как проводить трансфекцию клеток первичной культуры, были разработаны альтерантивные стратегии и начата сборка соответсвующих плазмидных векторов. Также на данном этапе были опробованы и оптимизированы методы, которые будут использоваться в дальнейшей работе и применяться для определения скорости роста клеток, оценки экспрессии генов, для которых показана роль в развитии MLL-ассоциированных лейкозов, для детекции и определения количества транслокаций в клеточных популяциях. | ||
2 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: Сравнивая результаты, полученные при применении различных стратегий, мы сделали вывод о большем потенциале стратегии с использованием сплайс-акцептора и постоянной селекции клеток на антибиотике. Выработка оптимальной стратегии индукции транслокаций необходима для проведения дальнейших экспериментов на первичных клетках. Полученные клетки с транслокациями будут использованы для анализа влияния транслокации на экспрессию различных генов, ассоциированных с лейкозами, на скорость роста и т.д. согласно плану исследования. В рамках работы по проекту мы изучили различные подходы для выявления хромосомных транслокаций и провели оптимизацию методов, важных как для выполнения задач проекта, так и для применения в клинике. Результаты использования данных методов в экспериментальной работе и их оптимизации были описаны в опубликованных статьях. | ||
3 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: В ходе выполнения работ текущего года нами были получены моноклоны клеток, содержащие систему AID-деплеции субъединицы когезина RAD21 в обоих аллелях этого гена. Проверено наличие в клетке слитого с дегроном белка RAD21. С помощью вестерн-блота исследована эффективность и кинетика деградации RAD21 в ответ на ауксин, а также кинетика и эффективность восстановления концентрации RAD21 после отмывки клеток от ауксина. Выбраны локусы в составе ТАДов, петель и страйпов для визуализации. Собраны плазмидные конструкции для интеграции элементов системы CRISРR-Sirius в геном целевых клеток. Получены векторы, кодирующие гидовые РНК с Sirius-аптамерами, узнающие теломеры и выбранные локусы в составе ТАДов, петель и страйпов. Произведен подбор условий микроскопии: подбор мощности лазеров, частоты и длительности съемки. На основании проведенных экспериментов выбраны локусы-мишени, которые на следующих этапах выполнения проекта будут визуализироваться в опытах по деплеции RAD21. | ||
4 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: | ||
5 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: | ||
6 | 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: | ||
7 | 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. | Изучение молекулярных основ онкогенеза |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".