ИСТИНА

Глобальной целью данного исследование является изучение механизмов взаимодействия эритроцитов крови при их обратимой агрегации. Более конкретно данный проект направлен на подробное изучение сущности и механизмов еще мало исследованного явления синергизма влияния различных компонентов плазмы крови на агрегацию эритроцитов (АЭ) в норме и при различных патологиях. Синергетический эффект наблюдается и для этих нейтральных макромолекул, но как и для случая белков плазмы крови объяснения этому явлению пока не дано. Более углубленное и детальное изучение явления синергизма важно для понимания фундаментальных механизмов агрегации эритроцитов и может найти широкое применение в клинической практике для прогноза развития гемореологических и микроциркуляторных расстройств по составу компонентов плазмы крови. Имеющиеся предварительные результаты по исследованию эффекта синергизма и оценка фундаментальной и практической важности их уточнения и обоснования и послужили причиной написания данного проекта. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи путём измерения параметров АЭ в условиях in vitro: - изучить влияние разных доступных для экспериментирования компонентов плазмы крови на АЭ по отдельности в зависимости от их концентрации в растворе, в пределах физиологических значений компонентов; - изучить влияние этих компонентов плазмы крови на АЭ при их нахождении в растворе в различных сочетаниях; - изучить изменения параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов; - изучить изменения параметров АЭ в плазме крови больных людей с аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы; - изучить характер взаимодействия компонентов плазмы крови в отдельности и в различных сочетаниях с мембраной эритроцитов - изучить влияние условий получения и хранения образцов цельной крови, плазмы крови, эритроцитарной массы и исследуемых компонентов плазмы крови на измеряемые параметры АЭ; - провести корреляционный анализ полученных зависимостей и предложить модель исследуемого явления и, по возможности, новую более продвинутую модель взаимодействия эритроцитов крови при их обратимой агрегации.

The project is aimed at a detailed study of the nature and mechanisms of a little-studied phenomenon of synergism of the influence of various components of blood plasma on the aggregation of red blood cells in normal and with various pathologies. A detailed study of this phenomenon, on the one hand, is important for understanding the fundamental mechanisms of red blood cell aggregation, and on the other hand, it can be widely used in clinical practice to predict the development of hemorheological and microcirculatory disorders in the composition of blood plasma components.

- Будет проведено сравнение различных “сценариев” агрегации и дезагрегации клеток при изменении состава суспендирующих растворов и плазмы. - Будет проведено исследование АЭ разными методами в условиях ингибирования вероятных рецепторов. Исследование вклада ионов кальция в процесс объединения клеток путем стимулирования и блокирования входа Са2+ в эритроциты. - Будет проведено комплексное изучение влияния разных компонентов плазмы крови по отдельности на АЭ в зависимости от их концентрации в растворе в пределах её физиологических значений, а также при их нахождении в растворе в различных сочетаниях. - Будет проведено изучение изменений параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов, а также изучение характера взаимодействия компонентов плазмы крови с мембраной эритроцитов в отдельности и в различных сочетаниях. - Будет проведено сравнительное изучение различий в параметрах АЭ в плазме крови здоровых доноров и больных людей с аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы. - Будут выполнены и сопоставлены, а также проведен сравнительныи? анализ многопараметрических образов - распределении? значении? параметров АЭ и других характеристик образцов крови для различных групп испытуемых. Будут выявлены “узкие места” и наиболее критических параметры. - Будет проведен комплексныи? анализ получаемых результатов и выделение параметров АЭ, наиболее явно характеризующих явление синергизма влияния на АЭ различных компонентов плазмы крови. - Будет проведен корреляционный анализ полученных зависимостей параметров АЭ от состава суспендирующей среды и выявление эффектов синергизма. Будут разработаны модели участия различных компонентов плазмы крови в процессе взаимодействия эритроцитов с проявлением эффекта синергизма, а также новая более продвинутая модель взаимодействия эритроцитов крови при их обратимой агрегации в нативной плазме и в средах с другим составом молекул.

У коллектива имеется более, чем 25-ти летний опыт проведения междисциплинарных исследований на стыке физики (главным образом оптики), биологии и медицины при тесном сотрудничестве физиков, биологов и медиков. Участники проекта обладают опытом совместной работы по определению реологических параметров крови человека и животных. Часть этих совместных исследований выполнялась в рамках 2-х летнего межфакультетского научного проекта «Оптика крови в норме и патологии», также в рамках ряда проектов, поддержанных РФФИ и РНФ. 1) выполнен цикл работ по численному моделированию взаимодействия лазерного излучения с компонентами крови и моделирующими их частицами; 2) разработаны новые оптические методики, основанные главным образом на диффузном рассеянии и дифракции света, и позволяющие выделять и измерять набор информативных параметров, характеризующих микрореологические (агрегационные и дкформационные свойства эритроцитов в пробах цельной крови и в разбавленных суспензиях (in vitro); 3) проведены циклы работ c использованием разработанных методов по анализу микрореологических свойств эритроцитов человека и малых лабораторных животных (крыс) в норме и при различных патологиях. 4) впервые проведены комплексные исследования в опытах in vitro и in vivo по влиянию углеродных наночастиц на микрореологические свойства крови у лабораторных животных и человека. 5) создана оригинальная компьютерная программа, позволяющая моделировать движение крупной прозрачной диэлектрической частицы (например, эритроцита) в поле оптической ловушки. 6) Получены новые фундаментальные результаты по изучению параметров и механизмов взаимодействия эритроцитов в процессе образования и разрушения парных агрегатов на уровне одиночных клеток в различных суспендирующих растворах.

Для достижения поставленных целей были решены следующие задачи путём измерения параметров агрегации эритроцитов (АЭ) в условиях in vitro: - разработаны оригинальные методики и протоколы проведения экспериментов с использованием лазерного агрегометра и лазерного пинцета; - изучено влияние разных доступных для экспериментирования компонентов плазмы крови, а именно фибриногена, альбумина и гаммаглобулина, на АЭ по отдельности в зависимости от их концентрации в растворе, в пределах физиологических значений этих компонентов; - изучено влияние этих компонентов плазмы крови на АЭ при их нахождении в растворе в различных сочетаниях; - изучено изменение параметров АЭ в плазме при искусственном изменении в ней концентрации различных компонентов; - изучен характер взаимодействия (адсорбции) фибриногена с мембраной эритроцитов; - проведено сравнение различных “сценариев” агрегации и дезагрегации клеток при изменении состава суспендирующих растворов и плазмы. Исследованы особенности АЭ в условиях ингибирования вероятных рецепторов; - начато исследование вклада ионов кальция в изменение свойств мембраны клеток (ее деформируемости) путем стимулирования и блокирования входа Са2+ в эритроциты; - изучено изменение параметров АЭ в крови людей, больных СД и АГ, характеризующихся аномальными значениями концентрации различных компонентов плазмы. Были проведены многосерийные комплексные эксперименты по измерению параметров агрегации и дезагрегации эритроцитов в пробах цельной крови с использованием оптических методов. Для достижения поставленных на данном этапе целей были решены ряд задач путём измерения параметров АЭ в условиях in vitro при различных концентрациях и комбинациях проагрегантных макромолекул различной молекулярной массы. Исследовано влияние низкомолекулярного (40 кДа) декстрана (Д40) на параметры АЭ, индуцированной фибриногеном в аутологичной плазме. Показано, что наличие Д40 в среде приводит к замедлению темпов агрегации, пропорциональному росту концентрации Д40. Сделан вывод о том, что механизм угнетения АЭ низкомолекулярными декстранами и им подобными макромолекулами заключается в основном в замедлении процессов образования линейных агрегатов. Исследованы взаимные синергетические эффекты альбумина и декстрана 150 кДа (Д150), как индуктора АЭ, в аутологичной плазме и сыворотке. При этом значительных и статистически достоверных эффектов синергизма альбумина и Д150 в сыворотке обнаружено не было. В то же время показано, что существует синергетический эффект Д150 и фибриногена, при котором происходит значительный рост скорости спонтанной агрегации, причем этот эффект больше проявляется в условиях спонтанной агрегации и не проявляется при исследовании параметров вынужденной дезагрегации эритроцитов в условиях потока. Исследование возможных синергетических эффектов при использовании декстрана еще большей молекулярной массы, а именно 500 кДа, также показало наличие эффекта усиления проагрегантного действия Д500 при повышенном альбумине. Был выявлен эффект синергии альбумина и фибриногена в АЭ, индуцированной иммуноглобулинами (ИГ), на параметры спонтанной агрегации и вынужденной дезагрегации эритроцитов. Выявлены особенности полимер-индуцируемой на основе Kolliphor Poloxamer – 188 (P188) в концентрации 10 мг/мл агрегации эритроцитов. Обнаружено статистически достоверное уменьшение индекса агрегации при наличии полоксамера и увеличение характерного времени агрегации за счет уменьшения скорости процесса образовния как линейных агрегатов, так и сложных разветвленных трехмерных агрегатов. Полученные результаты в явном виде указывают на ингибирующую агрегацию роль полоксамера – 188, что подтверждает его возможное применение в медицинских целях для коррекции гемореологических нарушений. Проведены исследования механизмов адсорбции макромолекул фибриногена на поверхность мембраны эритроцита, а также роли этого процесса в регулировании темпов АЭ. Измерено время десорбции фибриногена на мембране клетки (около 100 секунд). Исследование механизмов специфической сорбции фибриногена в условиях ингибирования потенциальных участков связывания фибриногена – гликопротеиновых рецепторов класса IIb/IIIa тирофибана и эптифибатида показало дозозависимое уменьшение прочности эритроцитарных агрегатов с минимумом прочности при концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ соответственно. Оценено количество специфических рецепторов фибриногена, имеющих гликопротеиновую природу, на уровне порядка 100 000 штук на эритроцит. Эти сведения получены нами впервые и имеют важное фундаментальное значения, поскольку блокаторы гликопротеинов входят в состав многих антикоагулянтов, которые широко применяются в медицине. Исследовано влияние низкомолекулярного (40 кДа) декстрана (Д40) на параметры АЭ, индуцированной фибриногеном в аутологичной плазме. Показано, что наличие Д40 в среде приводит к замедлению темпов агрегации, пропорциональному росту концентрации Д40. Сделан вывод о том, что механизм угнетения АЭ низкомолекулярными декстранами и им подобными макромолекулами заключается в основном в замедлении процессов образования линейных агрегатов. Исследованы взаимные синергетические эффекты альбумина и декстрана 150 кДа (Д150), как индуктора АЭ в аутологичной плазме и сыворотке. При этом значительных и статистически достоверных эффектов синергизма альбумина и Д150 в сыворотке обнаружено не было. В то же время показано, что существует синергетический эффект Д150 и фибриногена, при котором происходит значительный рост скорости спонтанной агрегации, причем этот эффект больше проявляется в условиях спонтанной агрегации и не проявляется при исследовании параметров вынужденной дезагрегации эритроцитов в условиях потока. Исследование возможных синергетических эффектов при использовании декстрана еще большей молекулярной массы, а именно 500 кДа, также показало наличие эффекта усиления проагрегантного действия Д500 при повышенном альбумине. Был выявлен эффект синергии альбумина и фибриногена в АЭ, индуцированной иммуноглобулинами (ИГ), на параметры спонтанной агрегации и вынужденной дезагрегации эритроцитов. Выявлены особенности полимер-индуцируемой на основе Kolliphor Poloxamer – 188 (P188) в концентрации 10 мг/мл агрегации эритроцитов. Обнаружено статистически достоверное уменьшение индекса агрегации при наличии полоксамера и увеличение характерного времени агрегации за счет уменьшения скорости процесса образования как линейных агрегатов, так и сложных разветвленных трехмерных агрегатов. Полученные результаты в явном виде указывают на ингибирующую агрегацию роль полоксамера – 188, что подтверждает его возможное применение в медицинских целях для коррекции гемореологических нарушений. Проведены исследования механизмов адсорбции макромолекул фибриногена на поверхность мембраны эритроцита, а также роли этого процесса в регулировании темпов АЭ. Измерено время десорбции фибриногена на мембране клетки (около 100 секунд). Исследование механизмов специфической сорбции фибриногена в условиях ингибирования потенциальных участков связывания фибриногена – гликопротеиновых рецепторов класса IIb/IIIa тирофибана и эптифибатида показало дозозависимое уменьшение прочности эритроцитарных агрегатов с минимумом прочности при концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ соответственно. Оценено количество специфических рецепторов фибриногена, имеющих гликопротеиновую природу, на уровне порядка 100 000 штук на эритроцит. Эти сведения получены нами впервые и имеют важное фундаментальное значения, поскольку блокаторы гликопротеинов входят в состав многих антикоагулянтов, которые широко применяются в медицине. Исследованы изменения параметров АЭ в средах с различной комбинацией макромолекул клеточной адгезии (декстранов различной молекулярной массы и концентрации). Исследована АЭ в различных средах (плазма и буферный раствор) в условиях индуцирования её иммуноглобулином, при различных концентрациях декстрановых полимерных макромолекул. Проведён анализ возможности коррекции гемореологических нарушений, наблюдаемых при некоторых социально-значимых заболеваниях, с помощью ингибиторов гликопротеинов класса IIb/IIIa. Влияние температуры, параметров сдвигового напряжения и гематокрита на агрегационные и вязкостные параметры крови исследовалось в присутствии макромолекул декстрана различной молекулярной массы и растворов белков альбумина и фибриногена. Также были получены результаты по влиянию альбумина, фибриногена и гамма глобулина в различных концентрациях на агрегационные свойства эритроцитов. Агрегационные свойства эритроцитов исследовались в зависимости от их деформируемости. Параметры агрегации и деформируемости эритроцитов сравнивались для здоровых людей и пациентов с артериальной гипертензией и сахарным диабетом.