ИСТИНА

Данный проект направлен на получение новых знаний относительно механизмов взаимодействия и изменения параметров системы крови и микроциркуляции и их связи с патологическимипроцессамиприсердечно-сосудистых заболеваниях,включая сердечную недостаточность, артериальную гипертензию и ишемическую болезнь сердца,на молекулярном,клеточном и ткане-органевом уровнях, для чего будут разработаны новые и использованы известные современные оптические методы.

Identification of molecular and microrheological mechanisms of interaction and changes in blood components in the microcirculation system is an urgent task of modern medicine. These mechanisms are the basis of most human diseases and, in particular, are inextricably related to metabolic disorders in cardiovascular diseases (CVD). Without identifying these mechanisms, which are fundamental, it is impossible to adequately track the dynamics and prognosis of the development of the disease in order to optimize the treatment process. The key point is the fact that pathogenesis affects the organization of the flow of biochemical and physiological processes at different levels: molecular, cellular and tissue-organ. At the same time, the observed changes are often interrelated, and in order to compile an adequate picture of the course of the disease, a representation of the totality of manifestations of pathogenesis at various levels is required. All this fully applies to the CVD, which rank first in terms of mortality in the developed world. The emphasis on blood components in the microcirculation system is evident due to their involvement in the functioning of the whole organism and its separate parts in the norm and at all stages of the disease development. The project is aimed at stadying and developing new mechanisms for interaction of various components of the blood and microvascular bed and changes in this interaction in process of pathogenesis. In this case, a comprehensive study of the role of hemodynamic, rheological and molecular-cellular factors and their relationship will be carried out. The main attention will be paid to the solution of a complex of new problems related to the development of fundamental (general) mechanisms and regularities, as well as to the investigation of individual features of the hemorheological profile that promote or inhibit the development of the disease, a comparative study of microrheological properties of erythrocytes, leukocytes and platelets in the development of metabolic disorders with the purpose of correcting negative changes. The novelty of the scientific task of the project consists in a comprehensive study of the basic relationships between the properties of the molecular-cellular components of the blood and various microvessel structures and adjacent tissues with the development of metabolic disturbances leading to CVD. This task is an interdisciplinary study and it is associated with the pathogenesis of fundamental processes and their manifestation in measured parameters and with the development of new methods for measuring these parameters.

1-й год 1. Будут исследованы используемые оптические методы на чувствительность и специфичность к измерению микрореологических параметров крови людей при сердечно-сосудистых заболеваниях, для чего будут проведены серийныеэкспериментыдляinvitroизмерений микрореологическихпараметровкрови людей в норме и приналичии ССЗ, а именно: a. Будут установлены и проанализированы параметры агрегационной кинетики клеток крови (эритроцитов) b. Будут получены параметры гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов в терминах сдвиговых напряжений c. Будет выполнена оценка изменения деформационных параметров эритроцитов, измерить механические свойства мембраны и вязкость внутриклеточного содержимого d. Будут определены параметры агрегационной и активационной кинетики тромбообразованиятромбоцитов. В результате статистическими методами будет исследована взаимосвязь полученных параметров с характеристиками ССЗ у пациента, на основе чего будет предложена оптимальная методика (набор параметров), характеризующая тяжесть и стадию ССЗ. 2. Будут иследованы оптические свойства клеток и образцов плазмы крови invivo и invitro, в том числе, при гиперлипидемии, методами флуоресцентной спектроскопии (стационарной, время-разрешенной и двухфотонной). Будет изучена возможность селекции вклада лейкоцитов с помощью автофлуоресцентного (как при однофотонно, так и при двухфотонном возбуждении) сигнала в потоке и селективного выделения вклада отдельных компонентов крови с использованием флуоресцентных маркеров (прежде всего, пищевых красителей), оценка соотношения сигнал-шум при детектировании липопротеинов и хиломикронов в крови методом флуоресцентной спектроскопии, что в случае положительного ответа позволит создать новую экспрессную методику оценки параметров метаболизма липидов. 3. Будет исследована микроциркуляция в капиллярах ногтевого ложа методом видеомикроскопии в режиме флуоресцентного детектирования с целью выявления спектральных особенностей крови, капилляров и периваскулярной ткани. Будет проведена оценка чувствительности и специфичности метода к детектированию липопротеинов в крови invivo. 4. Будет разработан и протестирован метод для определения толщины эпидермиса и концентрации воды в эпидермисе с использованием спектроскопии отражения в видимом и ближнем ИК диапазоне и мультиспектрального имиджинга. 5. Будут разработаны новыетеоретическая модели рассеяния лазерного пучка на ансамбле клеток крови и алгоритмы обработки дифракционных картин, пригодных для измерения новых реологических параметров клеток крови – коэффициентов асимметрии и эксцесса для распределения эритроцитов по размерам. Ожидаемые результаты за 2 год выполнения проекта: 1. Будут получены опытные образцы микро-биочипа с реализованным микроканалом для обеспечения усиловий потока. Материал, из которого будет изготовлен сип, будет удовлетворять всем требованиям проведения комплексных оптических исследований параметров межклеточного взаимодейтсвия, в том числе будет учтена возможность лазерной манипуляции клетками в канале чипа и реализации флуоресцентного сигнала от макромолекул клеточной адгезии, меченных флуоресцентной меткой 2. Будут разработаны протоколы подготовки клеточных образцов к проведению флуорометрических измерений в канале биочипа, а именно: будут вычислены адекватные концентрационные диапазоны и определены инкубационные условия, в которых не происходит необратимых изменений структур клеток. 3. Будут получены данные о кинетике сорбциибелковибелковыхструктур клеточной адгезиинаповерхностиэритроцитов,атакжефункциональныеиструктурныеизменения,происходящиесклеткойврезультате данногопроцесса. 4. Будут получены оптическиехарактеристикиявленийсорбцииидесорбции, определены релаксационные характеристики флуоресцентного сигнала. 5. Будут определены физиологические факторы регуляции толщины эпидермиса и распределение меланина по данным мультиспектрального имиджинга пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваними. Будут проведены и статистически проанализированы биофизические аспекты отклонения от нормальных значений, полученных на здоровых добровольцах с помощью мультифотонной томографии. 6. Будут получены данные о связи морфологической структуры эпидермиса с содержанием воды. Будут сделаны однозначные выводы о гипотезе связи размера эпидермиса со степенью локальной отечности. 7. Будут получены рабочие образцы цифрового капилляроскопа с флуоресцентным каналом детектирования, готовым для проведения испытаний и верификации в клинике в соответствии с предварительной договоренностью. Результаты работы экспериментальных образцов будут оценены в сравнении с набором диагностических данных, полученных стандартными в гемореологической практике методами. Ожидаемые результаты за 3 год выполнения проекта: 1. Будут установлены механизмы специфической адсорбции макромолекул клеточной адгезии на мембране клеток крови с использованием ингибиторов специфических участков связывания веществ внеклеточного матрикса (ингибиторы гликопротеиновых рецепторов, ингибиторы тирозинкиназных рецепторов); 2. Будет реализована система на биочипе с каналом микрофлюидики, комбинированную с оптическим пинцетом, с моделированием клеточного микроокружения путем культивирования эндотелиоцитов внутри микроканала с обеспечением доступа факторов культурального роста и внеклеточного матриксапри исследовании динамических параметров взаимодействия клеточных компонентов крови с эндотелием кровеносных сосудов в условиях потока 3. Будут получены данные по адсорбции макромолекул клеточной адгезии на мембране клеток компонентов крови: характерных времен сорбции\десорбции макромолекул клеточной адгезии, а также релаксационных параметры флуоресцентного сигнала и его локализации; 4. Будет создана и протестирована установка для реализации метода пространственно-разрешенной мультиспектральной диагностики с использованием матриц свето- и фотодиодов 5. Будет исследован процесс транскапиллярной диффузии в верхнем слое дермы с применением метода МФТ-FLIM – визуализации процессов микрогеморрагии (выхода эритроцитов в ткань через стенки капилляра), метаболизма клеток эпидермиса, проницаемости стенки капилляра и др. 6. Будет разработан метод определения плотности капиллярной сети в коже с использованием мультиспектрального имиджинга и его верификация путем сравнения с данными оптической микроскопии и мультифотонной томографии. 7. На основе серии экспериментальных измерений на крови пациентов с ССЗ будут получены новые данные о распределении красных клеток крови по размерам и деформируемостям. 8. Будет проведена статистическая обработка полученных результатов и выявлены корреляции микрореологических параметров крови

У коллектива лаборатории биомедицинской фотоники МЛЦ МГУ имеется более, чем 25-ти летний опыт проведения междисциплинарных исследований на стыке физики (главным образом оптики), биологии и медицины при тесном сотрудничестве физиков, биологов и медиков. Участники проекта обладают опытом совместной работы по определению реологических параметров крови человека и животных. Часть этих совместных исследований выполнялась в рамках 2-х летнего межфакультетского научного проекта «Оптика крови в норме и патологии», также в рамках ряда проектов, поддержанных РФФИ и РНФ.

Выявление молекулярных и микрореологических механизмов взаимодействия и изменений компонентов крови в системе микроциркуляции является актуальной задачей современной медицины т.к. эти механизмы лежат в основе большинства заболеваний человека и, в частности, неразрывно связаны с нарушениями метаболизма при сердечно- сосудистых заболеваниях (ССЗ). Без выявления этих механизмов, имеющих фундаментальный характер, невозможно адекватное экспрессное отслеживание динамики и прогноз развития заболевания с целью оптимизации процесса лечения. В данном проекте акцент сделан на компоненты крови в системе микроциркуляции вследствие их вовлеченности в процесс функционирования целостного организма и отдельных его частей в норме и на всех этапах развития заболевания. Проект направлен на исследование и разработку новых механизмов взаимодействия различных компонентов крови и микрососудистого русла и изменений этого взаимодействия в процесе патогенеза. Новизна научной задачи проекта заключается в комплексном изучении основных взаимосвязей между свойствами молекулярно-клеточных компонентов крови и различных структур микрососудов и прилегающих к ним тканей с развитием метаболических нарушений, приводящих к ССЗ. Данная задача является междисциплинарной и связана как с исследованием сопутствующих патогенезу фундаментальных процессов и их проявления в измеряемых параметрах, так и с разработкой новых методов исследований, позволяющих измерять эти параметры. Для достижения поставленной цели использованы современные методы лазерно-оптической диагностики, над разработкой, совершенствованием и применением которых коллектив авторов проекта успешно работает в течение долгого времени. За первый год выполнения проекта решены следующие задачи и развиты следующие направления: Проведены серийные эксперименты с измерениием микрореологических параметров крови людей в норме и при наличии ССЗ оптическими методами in vitro, а именно: параметров агрегационной кинетики клеток крови (эритроцитов) и параметры гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов в терминах сдвиговых напряжений; деформационных параметров эритроцитов, включая механические свойства мембраны и вязкость внутриклеточного содержимого; параметры агрегационной и активационной кинетики тромбообразования. Разработан алгоритм экспресс-диагностики параметров распределений эритроцитов по размерам методом лазерной дифрактометрии. Предполагается, что, будучи практически реализованным в процессе дальнейшей работы по проекту, этот метод окажется более простым и информативным, чем проточная цитометрия или компьютерная обработка изображений. Проведено исследование параметров кровотока, а также структурных и динамических компонентов внутри и снаружи микрокапилляров с использованием метода компьютерной капилляроскопии и флуоресцентной лазерной микроскопии. Подробно исследован вопрос возможности in vivo мониторинга лейкоцитов в микрососудах и возможности разделения лейкоцитов на различные подтипы (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты и лимфоциты) по их автофлуоресцентным свойствам, а также вопрос о возможности выделения флуоресцентного сигнала плазмы крови и, как следующее приближение, ее компонентов. Разработаны методы определения толщины эпидермиса и концентрации воды в эпидермисе с использованием спектроскопии отражения света в видимом и ближнем ИК диапазоне и мультиспектрального имиджинга. Исследованы корреляции линейного размера периваскулярной зоны, содержания воды в межклеточном пространстве и толщины эпидермиса на здоровых добровольцах и пациентах с ССЗ. Показаны аналитические возможности диагностики тяжести отечного симптома для больных с ССЗ с использованием мультиспектрального имиджинга. С точки зрения исследования гиперлипидемии, важным результатом, полученным на отчетном этапе, явилось обнаружение возможности неинвазивного детектирования содержания липидов в коже человека и их распределения по глубине с использованием спектроскопии диффузного отражения. На базе серийных исследований пациентов, госпитализированных в Медицинский научно-образовательный центр МГУ (МНОЦ МГУ), для работы с получаемыми медицинскими, лабораторными и инструментальными данными была разработана и заполнена таблица с оцифровкой данных (база данных) для последующей математической обработки. Таблица включает в себя медицинские данные всех обследованных пациентов с ССЗ (за 2018 год их было более 120 человек), медикаментозные препараты, которые они получают, результаты рутинных лабораторных и инструментальных исследований, а также результаты микрореологических исследований, проводившихся in vitro, и неинвазивных исследований микроциркуляции крови методом цифровой капилляроскопии ногтевого ложа, проводившихся in vivo. В отчетном периоде начата и будет в дальнейшем продолжена статистическая и корреляционнаяи обработка данных, включённых в эту таблицу. Резюмируя, за отчетный период в данном проекте успешно решалась задача совмещения исследований на различных уровнях организации живой материи, для чего применены новые методические подходы, ранее для решения указанных задач не применявшиеся. В рамках проекта выполнены фундаментальные исследования, направленные на выявление наиболее чувствительных параметров системы крови и микроциркуляции, характеризующих патологические процессы. Проведена большая серия исследований на пациентах с сердечно-сосудистыми заболеваниями с целью демонстрации новых возможностей использования новых механизмов и выявленных возможностей оптической диагностики.