ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Главная цель этого проекта - использовать жизненные культуры для исследования изменений в развитии кольчатых червей Siboglnidae при становлении симбиоза с внутриклеточными симбионтами.
Pogonophorans are an iconic peculiar group of deep-sea tubeworms, which according to the current phylogeny, belongs to the aberrant annelids Siboglinidae, including bone-eating worms, vestimentiferans and wood-boring worms. All siboglinids in the adult state lack a mouth and intestine and exist solely due to prokaryotic symbionts - chemoautotrophic bacteria that inhabit the cells of a special organ of symbiotrophic nutrition - trophosome. Most of the fundamental work on the structure and development of frenulate pogonophorans was made in the middle of the last century and was based on the ideas on the affinity of the pogonophorans to the deuterostomic animals. This significantly affected the scientific results: for example the radial cleavage and enterocoelic formation of the mesoderm, and division of the body (regionalization) into three parts have been described in pogonophorans, as deuterostomic animals. All these data contradict the modern interpretation of pogonophorans as representatives of annelids and require revision of the structure and development of the main ontogenetic stages from zygote to adult organisms by modern methods, including electron microscopy, laser confocal microscopy, and 3D modeling.The formation of symbiosis for pogonophorans and all other siboglinids is a crucial event for the further metamorphosis and development into an adult worm. Siboglinid larvae have a gut; they settle on a substrate with sulfide-oxidizing bacteria that penetrate the larva's body and initiate metamorphosis. It has been shown that in larvae of other siboglinids (vestimentiferans), dramatic changes occur in the body during the metamorphosis: the larval guts degrade, the mesodermal trophosome forms de novo, and all tissues and organs through which bacteria pass undergo apoptosis. In spite of the fact that pogonophorans are a sister clade to all other siboglinids what makes them a key group to research all gutless tubeworms, the developmental processes in the group remain less studied. Our knowledge of pogonophoran metamorphosis is still based on the assumptions made in late 1980s that bacteria are infected alimentary and that the trophosome develops from the intestinal wall, i.e. it has the endodermal origin. However, this contradicts the fact that the larvae of many pognophoran species do not have mouth opening, therefore, the question of the way of the bacterial infection remains open, and the organogenesis remains understudied. To study the biology and evolution of unusual frenulate pogonophorans, a key group of gutless siboglinid tubeworms, is essential to trace the processes of organogenesis in the pogonophoran larvae before and after metamorphosis, which likely is initiated by infection with prokaryotic symbionts. These studies require a preliminary analysis of the habitats and rearing the adult worms and their larvae in the laboratory. To understand the processes that occur before and after bacterial infection and that determine the organogenesis of the future adult worm, the use of modern molecular genetic technologies and electron microscopy are necessary. This knowledge will make it possible to use frenulate in the future to study specific mechanisms that control the effect of symbiotic microbiota on the ontogenesis, physiology, and immunity of their host animals.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 29 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. | Строение и развитие френулятных погонофор при становлении уникального симбиоза с бактериями |
Результаты этапа: Siboglinidae - культовая группа червей, по современным представлениям принадлежащая к кольчатым червям, которые во взрослом состоянии лишены рта и кишечника и существуют исключительно за счет бактериальных симбионтов. Становление симбиоза с бактериями для бородоносцев является решающим событием во время развития животного из личинки во взрослого червя. Личинки бородоносцев оседают на илистый субстрат с бактериями, которые проникают в тело личинки и инициируют рост нового симбиотрофного органа, содержащего бактерии во взрослом черве. Считается, что заражение бактериями происходит алиментарно и что бактерии внедряются в эпителий стенки кишки, и та "переквалифицируется" в симбиотрофную ткань, содержащую бактерии. Однако, у личинок некоторых бородоносцев рта нет, кишка заполнена желтком и практически не имеет просвета, что свидетельствует о том, что пища не поступает через рот и не переваривается в кишке. Поэтому вопрос о способе заражения бородоносцев бактериями остаётся открытым, и пока неизвестно, что собой представляет симбиотрофная ткань, содержащая у взрослых червей бактерии. Все основополагающие работы по строению и развитию червей-бородоносцев (френулятных погонофор) были предприняты в середине прошлого века и проводились, исходя из представлений о близости бородоносцев ко вторичноротым животным (которые включают морских ежей и звезд, позвоночных животных и др), что существенным образом отразилось на превалирующих в литературе научных обобщениях. Так, в развитии и строении бородоносцев описаны признаки строения и развития вторичноротых животных, а не первичноротых, включающих кольчатых червей и моллюсков. Итак, в первый год проекта мы исследовали план строения личинок и взрослых особей бородоносцев Северного моря (Siboglinum fiordicum) и моря Лаптевых (Oligobrachia haakonmosbiensis) с тем, чтобы решить пробелы в понимании их «аннелидного» происхождения и с тем, чтобы создать фундаментальную базу о строении червей бородоносцев, необходимую для последующих этапов проекта, посвященных исследованиям процессов эмбрионального развития, а также поздних этапов развития таких, как заражение бактериями, развитие органа де ново симбиотрофного питания и становления взрослого организма. Кроме того, в первый год проекта мы исследовали особенности местообитаний и культивирования взрослых червей бородоносцев и их личинок, что необходимо для содержания личинок и инициацию процесов заражения личинок бактериями. Результаты нашего проекта показали формирование тело и органов бородоносцев S. fiordicum и O. haakonmosbiensis на анатомическом, гистологическом и клеточном уровнях. Мы изучили развитие нервной системы, целомических полостей, мускулатуры, а также миграцию зон пролиферации клеток. Вместе это позволило установить последовательность закладки сегментов тела и сегментарный план строения тела личинок и взрослых червей бородоносцев, который сопоставим с другими кольчатыми червями. План строения взрослого бородача включает головную лопасть, в основании которой располагается сегмент, несущий щупальца (у личинки - это соответстует самой передней лопасти, и околоротовому сегменту), передний сегмент (соответствует второму сегменту личинки несущему вентральное ресничное поле), сильно удлиненный туловищный сегмент (у личинки это третий сегмент) и короткие задние сегменты, вместе формирующие так зазываемую опистосому, которой взрослый бородоносец закапывается в илистых осадок. Интересно, что все перечисленные сегменты появляются в теле личинки не в строго передне-задней последовательности, как это известно из классических работ по исследованию модельного объекта кольчатого червей Платинереиса. Но на ранних личиночных стадиях первая септа отсекает заднюю часть тела, опистосому. Далее в опистосоме закладываются сегменты, разделяющие опистосому. На поздних личиночных стадиях впереди формируются третья септы между вторым (передний) и третьим (туловищным) сегментами. Остальные септы образуются один за другим на самом заднем конце опистосомы. Мы считаем личинок бородоносцев гетерохронными, в том смысле, что сегменты в каждой из частей тела развиваются в разное время и с разной скоростью, а не более типичный гомохронный паттерн, обнаруживаемый у других кольчатых червей, где формирование септ во время личиночного развития является последовательным. Гетерохрония, вероятно, эволюционировала вместе со специацией участков тела, обнаруженной у бородоносцев. Предложена модель установки по содержанию погонофор в лабораторных условиях. Бородатые черви живут в поверхностных слоях осадка, однако имея длинные трубки погружают задний конец в более глубокие бескислородные слои грунта. И хотя местообитания и субстрат исследуемых бородоносцев Siboglinum fiordicum и Oligobrachia haakonmosbiensis различается, но симбионты у тех и других окисляют восстановленные соединения серы. S. fiordicum обитает в прибрежных районах фьордов, где осадок насыщен разлагающимся органическим веществом и, соответственно, сероводородом. O haakonmosbiensis населяет метановые высачивания на арктическом шельфе, где метан взаимодействует с сульфатами, образуя все тот же сероводород. Таким образом, для лабораторного содержания погонофор наиболее логичным представляется создать градиент условий в осадке, так чтобы нижний конец трубки погонофоры находился в бескислородном слое с достаточным содержанием сероводорода. В ходе проекта все участники осваивают новые методы и приобретают новые знания по биологии бородоносцев, а также по биологии развития животных и культивации. Студенты в рамках работ по проекты выполняют кваллификационные работы и представляют результаты на международных школах. | ||
2 | 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. | Строение и развитие френулятных погонофор при становлении уникального симбиоза с бактериями |
Результаты этапа: В ходе второго года проекта нам удалось провести собственный химический анализ осадка и придонной воды мелководного участка фьордов Северного моря, где обитают френулятные погонофоры Siboglinum fiordicum. На основании этих данных, а также на основании опубликованных данных о местообитаниях погонофор и метаболизме их симбионтов и опыта содержания вестиментифер в лабораторных условиях, нами была спроектирована и введена в эксплуатацию аквариумная система для содержания погонофор. Эта экспериментальная установка испытана на представителях френулятных погонофор S. fiordicum и является первым опытом по долговременному содержанию погонофор в полностью искусственных условиях вне морского стационара. Выживаемость червей составила 7%. Опираясь на отличное состояние оставшихся особей и отсутствие у них признаков деградации тканей по прошествии 64 дней, мы считаем подобранные в нашей аквариумной установке условия по содержанию френулятных погонофор достаточными для поддержания жизнеспособности симбионтов и их хозяев. Высокий процент смертности, по нашему мнению, связан не с условиями содержания, а скорее со стрессом при транспортировке животных, а также с неизбежно травмирующим способом добывания червей из естественной среды обитания. Проведено успешное осаждение в осадок личиночных стадий погонофор S. fiordicum. Впервые мы провели детальное изучение анатомии и ультраструктуры ювенильных особей спустя первый и второй месяцы после осаждения. У ювенилей имеется хорошо развитая кишка. Она начинается ротовым отверстием, проходит вдоль всего тела, занимая его больший объем и доходит до анальной ямки, но не соединяется с нею. В переднем отделе тела в кишке хорошо заметен просвет, заполненный микровосинками и ресничками. Апикальная мембрана клеток кишки на всем своем протяжении формирует многочисленные окаймленные ямки, а апикальная цитоплазма содержит окаймленные пузырьки. В клетках имеется хорошо развитый синтетический аппарат: крупный комплекс Гольджи и каналы шероховатого ЭПР. Цитоплазма клеток заполнена гранулами гликогена, а так же крупными желточными гранулами и липидными каплями. Наличие в клетках кишки окаймленных ямок и окаймленных пузырьков позволяет предполагать, что в клетках кишки происходит активной эндоцитоз. Из полученных извне нутриентов формируются желточные гранулы. Вероятно, на этой стадии кишка функционирует обычным образом, она не обнаруживает признаков дегенерации и не заселена бактериями. Эксперименты по осаждению и заражению ювенилей погонофор бактериями продолжаются. Успешно проведены исследования раннего развития. По нашим данным симметрия дробления полностью соответствует спиральному типу. Однако внушительные запасы желтка, крупный размер и удлиненная форма ооцитов, лежащих вдоль оси материнской трубки, обуславливают соответствующие модификации спирального паттерна дробления. Однако эти модификации специфичны именно для зибоглинид и не сходны с теми, что встречаются у крупных зародышей олигохет и пиявок. У S. fiordicum отсутствует характерная для клителлят чрезвычайная аллометрия анимальных и вегетативных бластомеров, что согласуется с не плоскостной, а трехмерной формой зародыша. Впервые мы наблюдали выделение полярных телец. Первые раунды дробления идут в меридиональных плоскостях с врезающимися бороздами, которые закладываются на боковых сторонах клеток (т.е. не на анимальном или вегетативном полюсе, как у других обогащенных желтком яиц). Степень синхронности при этом невысока: встречаются 2, 3 и 4-х клеточные стадии. На третьем клеточном цикле у живых зародышей можно явственно наблюдать лопастевидные выпячивания на анимальном полюсе, заворачивающиеся по часовой стрелке, как при дексиотропном гетероквадрантном дроблении. Дальнейшая ориентация борозд не вполне соответствует строгим законам деления микромеров с чередованием дексио- и леотропных поворотов, однако общая симметрия зародыша имеет именно вращательный характер. Уже с 16-ти клеточной стадии темпы делений более мелких бластомеров будущего переднего полюса личинки, слагаемого микромерами квадрантов А и В, начинают ускоряться. Этот домен клеток смещается в сторону острого (переднего) конца яйца. Эпиболическое распространение все еще крупных анимальных клеток идет параллельно с их делениями и уплощением. Так формируется плотная стерробластула/стеррогаструла с утолщенной вегетативной стенкой. В ходе проекта члены научной группы получили опыт полевой работы и приняли участие в двух экспедициях для сбора материала в Карское (вместо моря Лаптевых) и Северное моря (http://invert.bio.msu.ru/ru/science-ru/conferences/285-kara-sea-expedition и https://t.me/+6EoSkMDH_2Y5MWNi). Студентами коллектива подготовлены две магистерские диссертации (Тимофей Пименов по анатомии и трехмерной организации головных концов сабеллид, Мадина Канафина по ультструктуре трофосомы френулят), защиты которых состоятся 18го мая 2022. Кроме того, студенты приняли участие и получили опыт работе в экспедициях: Варвара Кроленко, рейс в Карское море на НИС “Академик Мстислав Келдыш”, а Тимофей Пименов и Мадина Канафина экспедиция на Северное море. Студенты приняли участие и показали результаты своих работ на конференции в феврале 2022 года, Беломорская научная сессия, 2022. Результаты проекта также обнародованы на конференции Актуальные проекты в биологии развития, 2021 и в сети интернет http://invert.bio.msu.ru/ru/science-ru/conferences/288-paper-siboglinid-larval-myogenesis. | ||
3 | 1 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. | Строение и развитие френулятных погонофор при становлении уникального симбиоза с бактериями |
Результаты этапа: Культивирование животных в лабораторных условий необходимо для обеспечения базы для проведения физиологических экспериментов, исследования биологии поведения и развития. В ходе работ 2022-2023 были продолжены эксперименты по культивированию взрослых погонофор и их личинок Siboglinum fiordicum. Показано, что культивирование взрослых червей и их личинок в долгосрочной перспективе имеет шансы при соблюдении режимов постоянного обновления воды в аквариуме и обновления осадка в культуре. Благодаря наличию в лаборатории культур взрослы погонофор и их личинок мы смогли провести исследования по развитию и строению внутренних органов, со специальными вниманием на строение кишки и трофосомы. Трофосома представляем собой цилиндрический орган, занимающий центральное положение в теле. Его стенки представлены двумя слоями эпителия, наружного и внутреннего. Последний включает бактерий симбионтов. Жизненный цикл симбионтов похож на тот, что известно у склеролинумов, то есть в ходе развития бактериоциты мигрируют в задние части трофосомы, где наблюдаются признаки деградации внутри бактериоцитов. Применение молекулярно-генетического метода FISH подтвердило распределение бактерий внутри трофосомы, но также показало множество эпибионтов, расположенных на поверхности покровного эпителия тела червей. Показано, что у исследованных погонофор трофосома развивается из энтодермальной ткани ювенилей, таким образом не является гомологичным органом мезодермальной трофосомы у вестиментифер, костоедов и склеролинумов. Таким образом, в эволюции зибоглинид от общего внешнего предка появились две линии, зибоглиниды с эндодермальной трофосомой (френулятные погонофоры) и зибоглиниды с мезодермальной трофосомой (костоеды, склеролинумы, вестиментиферы). Гипотетически такое разное формирование трофосом зависит от способа заражения бактерий-симбионтов (через рот или через кожу), что требует продолжения исследований. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".