Создание микроструктурированных плёнок природного поли-3-оксибутирата и исследование их биологической активности на клеточных культурахНИР

The development of microstructured films of natural poly(3-hydroxybutyrate) and the study of their biological activity in cell cultures

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 24 апреля 2020 г.-15 апреля 2021 г. Создание микроструктурированных плёнок природного поли-3-оксибутирата
Результаты этапа: В ходе выполнения 1-ого этапа Проекта методом контролируемого биосинтеза с использованием штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б были получены поли-3-оксибутират различной молекулярной массы (от 308 до 1320 кДа) и его сополимер с 3-оксивалератом (ПОБВ) с содержанием 3-оксивалерата от 3,5 моль% до 17,6 моль% и молекулярной массой от 110 до 1490 кДа, всего 16 партий. Кроме того, были закуплены химически синтезируемые полимеры высокой чистоты для биомедицинского применения марки PURASORB: поли-L-лактиды различной молекулярной массы, поли-D,L-лактид и поли-ε-капролактон, всего 4 партии. Анализ термофизических свойств синтезированных полимеров с использованием методов анализа термофизических свойств: дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрического анализа и оценки гидрофильности полимерной поверхности показал, что температура плавления полученных полимеров сильно различается и составляет от 168,5 до 184,8 °С, у химически синтезированных поли-L-лактидов значения температуры плавления укладываются в этот диапозон, а у поликапролактона и поли-D,L-лактида значительно меньше (57,5 и 59,6 °С, соответственно). Степени кристалличности ПОБ и его сополимеров ПОБВ составляют от 30 до 75%; степень кристалличности химически синтезированных ПОА значительно ниже и составляет от 6,5% у поли-D,L-лактида до 38% у поли-ε-капролактона. Исследование краевого контактного угла смачивания водой полимеров показало, что все полимеры имеют примерно одинаковую степень гидрофобности: от от 60° до 70°, т.е. по этому параметру полимеры большим разнообразием не отличались. Таким образом, полученные путем биосинтеза и закупленные химически синтезированные ПОА значительно различаются, как по своей химической структуре и молекулярной массе, так и по своим термофизическим свойствам, прежде всего, по своей кристалличности, но не по своей гидрофильности. Наиболее различающиеся по своему химическому составу, молекулярной массе и кристалличности полимеры (9 партий) были отправлены коллегам по Проекту в Институт Новых Материалов НАН Белорусии по почте и с коммандируемым сотрудником для пулучения ими микроструктурированных пленок из этих полимеров. Была организована стажировка сотрудницы кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова в Институт Новых Материалов НАН Белорусии на 1 неделю. В ходе этой стажировки сотрудница освоила методы получения микроструктурированных пленок как методом спинкоатинга на шаблонах двух типов топографии поверхности, так и методом самоорганизации капель воды. Были получены пленки из синтезированных ПОА различного состава широкого спектра по размеру и строению пор. Часть полученных образцов микроструктурированных пленок были переправлены в Москву для культивирования на них клеток. Были отработаны методы культивирования и исследования пролиферации клеток млекопитающих различных типов на пленках из ПОБ. В работе использовались мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга крыс (не позднее 4-го пассажа), фибробласты мыши линии 3Т3, фибробласты зеленой мартышки Сos-1, а также опухолевые клетки рака гортани человека HEp-2. Для исследования пролиферации клеток использовали биохимические методы оценки жизнеспособности и роста клеток ХТТ, а также световую, флуоресцентную и сканирующую электронную микроскопию. На первом этапе были отработаны методы выращивания фибробластов на полимерных пленках из ПОБ, полилактида и их композита, которые подверглись различной степени неэндиматической и энзиматической (с помощью панкреатической липазы) деградации в течение 2-х и 6-ти недель. В ходе деградации произошли изменения как физико-химических свойств, так и морфологии полимерных пленок, поэтому это явилось хорошей моделью для анализа роста фибробластов на полимерных пленок с различной гидрофильностью и морфологией поверхности. Результаты этого исследования опубликованы в журнале Polymers (Q1). Были получены также предварительные результаты роста МСК на пленках из ПОБ с различной топографией поверхности, полученных методом спинкоатинга на полосатых и столбчатых шаблонах, и методом самоорганизации. Рост клеток на полученных пленках был исследован методом флуоресцентной микроскопии с использованием красителей (Calcein CA, Hoechst). Было показано, что МСК растут на пленках, полученных методом самоорганизиции и методом спинкоатинга на столбчатом шаблоне неорганизованно, а на пленках, полученных методом спинкоатинга на полосчатом шаблоне, они вытягиваются вдоль балок. Эти данные были подтверждены данными сканирующей электронной микроскопии. Были отработаны методики оценки изменения фенотипа МСК при их культивировании на пленках из ПОБ при помощи проточной цитометрии с использованием маркеров фенотипа МСК, в результате чего были отобраны специфические маркеры изменения фенотипа клеток - CD90 и CD45. Для исследования способности МСК к дифференцировки были отработаны методы направленной дифференцировки МСК в остеогенном и адипогенном направлении и биохимический метод исследования дифференцировки - измерение активности щелочной фосфотазы. В дальнейшем использование этих методик позволит исследовать зависимость динамики пролиферации и изменения основных фенотипических характеристик клеток млекопитающих различных типов (мезенхимальных стволовых клеток, фибробластов, опухолевых клеток) от различных типов топографии полученных микроструктурированных пленок ПОБ и его сополимеров при культивировании клеток на поверхности этих пленок.
2 25 августа 2021 г.-25 мая 2022 г. Исследование биологической активности микроструктурированных плёнок природного поли-3-оксибутирата на клеточных культурах
Результаты этапа: Были получены изображения СЭМ всех изготовленных пленок. В ходе проведенной работы было проанализировано 46 различных видов индивидуальных топографией полученных пленок. Полученные микроструктурированные пленки по зрительной качественной оценке довольно сильно отличались друг от друга по форме, размеру и взаимному расположению пор. Можно было выделить 6 основных типов топографии: 1) в виде равномерной сотовой структуры с круглыми или многоугольными порами с загругленными углами малого (диаметром <5 мкм) или большого (диаметром >5 мкм) диаметра; 2) в виде сот из мелких пор (диаметром <5 мкм), организованных в доменную структуру более высокого уровня (линейные размеры >20 мкм); 3) в виде относительно равномерно расположенных не в виде сот пор с неправильной формы порами малого (диаметром <5 мкм) диаметра; 4) в виде мелких и крупных пор неравномерной формы и на различным расстоянии друг от друга; 5) в виде анизотропной структуры вытянутых крупных пор (линейные размеры >10 мкм); 6) в виде крупной сетчатой структуры с многоугольными крупными порами с тонкими стенками (линейные размеры >10 мкм). Чтобы провести научный анализ изображений была проведена математическая обработка геометрических параметров формы пор по параметрам средняя площадь, циркулярность и аспект-рацио. Однако экспериментальным образом было установлено, что параметры циркулярность и аспект-рацио жестко коррелируют друг с другом, поэтому было решено остановиться только на 2-х: средняя площадь и циркулярность (степень приближения к кругу). Кроме того, для всех пленок был измерен контактный угол смачивания водой. По полученному массиву численных данных были построены графики зависимости: 1) циркулярности от средней площади; 2) контактного угла от средней площади. Полученные результаты показали, что параметры методов влияют на микроструктуру и гидрофильность поверхности получаемых пленок, но большой разброс индивидуальных образцов не позволяет это доказать статистически. При этом полученные с использованием разных параметров пленки по своим геометрическим параметрам топографии (средняя площадь пор, средняя циркулярность) различаются в большей части случаев статистически значимо, что позволяет отобрать пленки с различной топографией поверхности для выращивания на них клеток. Было показано также, что получение микроструктурированных пленок значительно изменяет физико-химические свойства полимера, измерение которых проводят на толстых гладких пленках: значительно падает степень кристалличности полимера (на 10% и более) и сильно возрастает гидрофобность поверхности пленок, оцененная с помощью измерения контактного угла смачивания водой (с 60-70° до 90-120°), что объясняется изменением надмолекулярной структуры полимера в ходе получения тонких микроструктурированных пленок. Более ттго, было показано также, что культивирование клеток на пленках в течение 1 недели приводит к изменению их физико-химических свойств: повышению степени кристалличности и температуры плавления. Таким образом, математическая обработка изображений пленок дает лишь первое приближение для анализа их микроструктуры, и нам пришлось опираться и на качественный зрительный анализ тоже. Лучше всего различие топографии было видно по характерным узнаваемым рисункам. Вероятно, детальное исследование топографии возможно только с привлечением иного уровня математического аппарата анализа изображений, например, нейронных сетей. В итоге для биологических исследований были выбраны пленки со значительно математически различающимися геометрическими параметрами топографии (средняя площадь пор, средняя циркулярность) и качественно различным зрительно рисунком топографии. Были отобраны пленки, полученные с использованием следующих параметров: 1) ПОБ-350, 1 см, 20 мг/мл, 150 мкл; 2) ПОБ-350, 1 см, 40 мг/мл, 150 мкл; 3) ПОБ-350, 1 см, 40 мг/мл, 300 мкл; 4) ПОБ-1800, 1 см, 20 мг/мл, 150 мкл; 5) ПОБ-1800, 1 см, 20 мг/мл, 450 мкл; 6) ПОБ-1800, 3 см, 20 мг/мл, 300 мкл; 7) ПОБВ-17%, 3 см, 5 мг/мл, 300 мкл, 8) ПОБВ-17%, 3 см, 40 мг/мл, 300 мкл, где цифры означают характеристики полимера и главные параметры метода. В качестве сравнения использовали также пленки с искусственной топографией поверхности, полученные на шаблонах с заданной топографией: в виде столбиков, расположенных в шахматном порядке и параллельных полосок с расстоянием между геометрическими элементами в 3 мкм. На первом этапе были отработаны методы культивирования и исследования пролиферации клеток млекопитающих различных типов на пленках из ПОБ. В работе использовались мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из костного мозга крыс (не позднее 4-го пассажа), фибробласты мыши линии 3Т3, клетки нейробластомы человека линии SHSY5Y, клетки карциномы прямой кишки линии CT-26 (фибробластоподобные клетки). Для исследования пролиферации клеток использовали биохимические методы оценки жизнеспособности и роста клеток ХТТ и Аламар-Блю, а также световую, флуоресцентную и сканирующую электронную микроскопию. На первом этапе были отработаны методы выращивания фибробластов на полимерных пленках из ПОБ, полилактида и их композита, которые подверглись различной степени неэндиматической и энзиматической (с помощью панкреатической липазы) деградации в течение 2-х и 6-ти недель. В ходе деградации произошли изменения как физико-химических свойств, так и морфологии полимерных пленок, поэтому это явилось хорошей моделью для анализа роста фибробластов на полимерных пленок с различной гидрофильностью и морфологией поверхности. Результаты этого исследования опубликованы в журнале Polymers (Q1). Рост клеток на полученных пленках был исследован методом флуоресцентной микроскопии с использованием красителей (Calcein CA, Hoechst), а также с помощью сканирующей электронной микроскопии. На втором этапе клетки различных типов: МСК, клетки линии SHSY5Y и клетки линии CT-26 культивировали на полученных микроструктурированных пленках с различным типом топографии и исследовали пролиферацию и морфологию клеток, по которой оценивали изменение фенотипа клеток. Было показано, что при прикреплении и росте на поверхности с более мелкими порами округлой формы, МСК становятся более плоскими и распластываются на большей поверхности, а при росте на поверхности полимерных пленок с более крупными и неправильной формы порами клетки становятся более плотными, и они распластывают и протягивают псевдоподии во все стороны, чтобы прикрепиться с их помощью к неровностям поверхности, что также сопряжено с активным функционированием клеточного цитоскелета (как было показано с помощью конфокальной микроскопии). Такая «напряженная» морфология МСК, а также других типов клеток, возникающая из-за прикрепления и роста на поверхностях с «неудобной» для клеток структурой поверхности, может приводить к изменению их фенотипа и инициировать дифференцировку, например, в остеогенном направлении или изменить функциональное состояние клеток. При этом скорость пролиферации, измеренная методом ХТТ, не различалась значимо для МСК, растущих на пленках с разной топографией, тогда как для фибробластоподобных клеток линии CT-26 скорость пролиферации была в 2 раза выше при росте на пленках с мелкими круглыми порами, т.е. на тех, где наблюдалось распластывание клеток. В случае культивирования клеток на пленках с искусственной топографией (столбчатой, полосчатой), а также на контрольных гладких пленках было показано, что на гладких пленках МСК не приобретают распластанную морфологию. Клетки на пленках со столбчатой топографией имеют склонность к незначительному вытяжению, их псевдоподии максимально уплощены для большего сцепления с выступами поверхности пленки. Средняя часть клетки организована более компактно и больше выступает над поверхностью, по сравнению с ростом клетки на плоской пленке. На пленках с анизотропной топографией в виде параллельных бороздок клетки вытягиваются вдоль бороздок, прикрепляясь псевдоподиями к выступам поверхности. Клетки линии СТ-26 рака толстой кишки образуют тонкие длинные псевдоподии для прикрепления к поверхности. Столбчатые штампы не оказывают значительного влияния на изменение морфологии СТ-26. А на полосатых штампах отчетливо видно вытяжение псевдоподий вдоль бороздок поверхности. Таким образом, впервые было проведено комплексное исследование по получению микроструктурированных пленок с «естественными» типами топографии поверхности, т.е. такой топографии, которая не жестко задана искусственно изготовленным шаблоном/мастером, а может в определенных пределах, заданных параметрами используемого нами оригинального метода самоорганизации микрокапель воды, проявляться в виде индивидуальных сложноорганизованных рисунков. Результаты, полученные при культивировании клеток на пленках с различными типами топографии, позволяют сделать вывод, что имеются «естественные» типы топографии пленок из ПОБ и ПОБВ (например, пленки с крупными неправильной формы узорчатыми порами), которые побуждают клетки (прежде всего, МСК) изменять свою морфологию в том или ином направлении: широко распластываться по поверхности пленки, либо, напротив, упрощать тело клетки и максимально далеко вытягивать свои псевдоподии для прикрепления к краям пор, что может приводить к изменению их фенотипа и функционального состояния. Были выявлены и промежуточные формы морфологии и поведения клеток. Такие потенциально «биоактивные» типы топографии поверхности были впервые выявлены для пленок из полиоксиалканоатов и могут быть использованы в дальнейшем для разработки медицинских изделий с биологически активной полимерной поверхностью для повышения эффективности их терапевтического действия, так и для экспериментального моделирования различных процессов в организме: регенерации тканей, развития фиброза или роста опухоли для испытания лекарств и диагностических средств.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".