Сравнительное исследование регенерации у губок (Porifera)НИР

Comparative investigation of regeneration in sponges (Porifera)

Соисполнители НИР

СПбГУ Координатор

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Сравнительное исследование регенерации у губок (Porifera)
Результаты этапа: В соответствии с планами на 2016 г., поставленные задачи как научного, так и организационного характера в основном выполнены. В ходе выполнения задания за этап 2016 года, нами внесено одно изменение: вместо известковой губки вида Clathrina clathrus, нами проведены эксперименты на другой известковой губке Leucosolenia complicata. Работы с Clathrina clathrus будут перенесены на 2017 год. Отработаны оптимальные температурные, гидрологические и гидрохимические условия культивирования в аквариумах на период проведения экспериментов на морских биостанциях (Беломорская биологическая станция МГУ, Белое море и Морская станция Эндум, Марсель, Средиземное море) новых для коллектива модельных объектов: Suberites domuncula, Aplysina cavernicola, Sycon ciliatum и Leucosolenia complicata. Подобранные условия адекватны естественным и, как показали наши эксперименты, не влияют на ход восстановительных морфогенезов у всех видов. Получены новые для науки данные по прижизненным наблюдением над репаративной регенерацией небольших фрагментов тела у Suberites domuncula, Sycon ciliatum и Leucosolenia complicata. Также впервые описаны на светооптическом, а у двух видов известковых губок (Sycon ciliatum и Leucosolenia complicata), на электронно-микроскопическом уровнях, основные стадии и процессы, проходящие при репаративной регенерации указанных видов. Описаны тонкие механизмы морфогенеза и трансдифференциации клеток при регенерации Sycon ciliatum. Предварительные результаты свидетельствуют о доминировании эпителиальных морфогенезов при регенерации у известковых губок Sycon ciliatum и Leucosolenia complicata. У Oscarella lobularis впервые для губок класса Homoscleromorpha методом гибридизации in situ проанализирована экспрессия 11 germline multipotency program (GMP) генов (piwiA, piwiB, ago, vasa, pl10, boule, nanos, bruno, brunoB, pumilio and tudor1) на протяжении всего жизненного цикла. Для этого вида предложен кандидат на роль стволовых половых клеток. Показано, что что паттерны экспрессии Wnt у Halisarca dujardini приурочены к одному из доменов – оскулярной трубке, границе между базо- и экзопинакодермой, либо транскрипт равномерно распределен среди экзопинакоцитов. Предполагается, что WntK участвует в репарации повреждения, путем влияния на миграцию клеток в ходе заживления. Изучение регенерации оскулярной трубки Halisarca dujardini и выявление роли генов WNT сигнального пути в этом процессе не проведено по техническим причинам. Эта часть проекта будет реализована в 2017 и 2018 годах. Научные результаты проекта и отработанные методики были использованы при проведении двух международных воркшопов (Roscoff, Франция и ББС МГУ), а также на международной конференции Society for Molecular Biology and Evolution Conference. 3-7 July 2016. Gold Coast, Queensland Australia
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Сравнительное исследование регенерации у губок (Porifera)
Результаты этапа: В соответствии с планами на 2017 г., поставленные задачи как научного, так и организационного характера в основном выполнены. Изучены миграции клеток in vivo методом цейтраферной съемки регенерирующих губок Leucosolenia complicata (подкласс Calcaronea) и Clathrina arnesenae (подкласс Calcinea). Получены новые для науки данные по прижизненным и светооптическим наблюдениям над репаративной регенерацией фрагментов тела у C. arnesenae. Впервые проведены гистологические и ультраструктурные (ТЭМ, СЭМ) исследования морфогенезов, а также изменения формы клеток и их трансдифференцировок в ходе регенерации участка стенки тела асконоидных известковых губок L. complicata и C. arnesenae, а также лейконоидной демоспонгии Suberites domuncula. Нами показано, что регенерация L. complicata и C. arnesenae проходит по типу морфаллаксиса, когда утраченные части тела замещаются за счет ремоделлинга оставшихся тканей, сопровождающегося трансдифференциацией клеток. При этом пролиферация клеток не играет важной роли в регенерации. На примере L. complicata нами также не отмечено участия никаких «стволовых» клеток, типа археоцитов в этом процессе. Основными морфогенетическими механизмами в ходе регенерации являются растягивание, уплощение и слияние эпителиальных пластов. Основным источником новой экзопинакодермы является интактная экзопинакодерма, а новой хоанодермы – интактная хоанодерма, окружающие рану. Клетки мезохила не принимают участия в регенерационных процессах. У демоспонгии S. domuncula регенерация идет по типу эпиморфоза. У этого вида преобладают эпителио-мезенхимные переходы, активное участие полипотентных клеток – археоцитов. Также как у Halisarca dujardini в ходе регенерации формируется бластема. Были выполнены эксперименты по изучению регенерационных способностей изолированной оскулярной трубки у H. dujardini. В течение первых 6-12 часов после операции, раневая поверхность у оскулярной трубки смыкается и в месте контакта с телом губки формируется расширенный округлый пузырек, стенки которого образованы экзопинакодермой. Показано, что хоаноциты камер водоносной системы, попавшие в регенерат с мезохилом в основании оскулярной трубки, активно делятся уже через 6 ч после операции, тогда как клетки в самой оскулярной трубке остаются интактными по крайней мере в течение четырех суток. Вероятно, пролиферирующие хоаноциты являются источником клеточного материала для вновь формируемого тела губки. Отработаны методы мечения клеток, находящихся в состоянии апоптоза, на интактных тканях и в ходе регенерации губок L. complicata и H. dujardini с помощью DiI и Hoechst 33342. В интактных тканях H. dujardini были выявлены апоптотирующие клетки которые всегда находились в мезохиле губки. Их цитоплазма была заполнена мелкими гранулами, которые и получали специфическую окраску. В тканях после индукций апоптоза ультрафиолетом или перекисью водорода количество клеток, получавших специфическую окраску, увеличивалось. В основном эти клетки были сосредоточены в поверхностной зоне губок, которая подвергалась наиболее сильному воздействию индуцирующих факторов. В тканях L. complicata ни одним из примененных методов не были выявлены клетки в состоянии апоптоза. Вероятно, требуется дальнейшая модификация примененных методик для получения специфической окраски апоптотирующих клеток у этого вида. Научные результаты проекта и отработанные методики были опубликованы в одной статье, использованы при проведении международного воркшопа (Roscoff, Франция), а также на двух международных научных конгрессах (10th International Sponge Conference, Galway, Ireland ; 4th International Congress on Invertebrate Morphology, Москва), одной всероссийской конференции с международным участием (Изучение, рациональное использование и охрана природных ресурсов Белого моря". Санкт-Петербург) и одной всероссийской конференции (Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: онтогенез и формирование биологического разнообразия», 22-24 ноября 2017, Москва) с пятью устными и четырьмя стендовыми докладами.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Сравнительное исследование регенерации у губок (Porifera)
Результаты этапа: Важнейшие результаты, полученные при реализации всего Проекта Основной задачей настоящего проекта было детальное сравнительное исследование клеточных и морфогенетических механизмов, сопровождающих формообразовательные процессы в ходе репаративной регенерации губок из филогенетически удаленных таксонов и отличающихся анатомической и тканевой организацией. Подробное описание полученных результатов было представлено в промежуточных отчетах и первой части настоящего отчета. В результате реализации данного проекта нами были получены новые фундаментальные и приоритетные знания о морфогенезах, клеточных источниках и механизмах регуляции новообразований при регенерации у губок, а также о степени эволюционного консерватизма этих процессов (основные результаты сведены в Таблицы 1 и 2). 1) Впервые с использованием однотипных методов и подходов проведено обширное сравнительное исследование регенерации шести видов губок из различных филогенетических групп типа Porifera (классы Homoscleromorpha, Calcarea, Demospongiae) и отличающихся анатомической (тип водоносной системы: лейкон, сикон, аскон) и тканевой (уровень развития эпителиев – хоанодермы и пинакодермы) организации и проведено сравнение с ранее полученными нами данными. 2) Впервые показано, что типы морфогенезов при регенерации губок зависят от их филогенетического или таксономического положения и не связаны с их анатомической организацией. Ранее в сравнительном аспекте регенерация губок исследовалась с точки зрения их организации, в первую очередь, типа водоносной системы и наличия одного или многих оскулюмов (см: Короткова 1997). Нами показано, что у известковых губок (Sycon ciliatum, Leucosolenia variabilis, Clathrina arnesenae) вне зависимости от типа их водоносной системы и количества оскулюмов, морфогенезы, сопровождающие регенерацию имеют исключительно эпителиальный характер. Все известные Демоспонгии (кроме хищных губок, у которых отсутствует водоносная система) являются лейконоидными. В данной группе вне зависимости от того имеется один оскулюм (Suberites domuncula - Suberitida), несколько оскулумов на удаленных оскулярных трубках (Aplysina cavernicola - Verongida) или просто многооскулюмные губки (Halisarca dujardinii – Chondrosiida) (Borisenko et al. 2015) и (Halichondria panicea - Suberitida) (Короткова, Никитин 1969а,б) основными морфогенезами являются мезенхимо-эпителиальные переходы. С другой стороны, представители класса Homoscleromorpha (Oscarella lobularis) (Ereskovsky et al. 2015) также как Демоспонгии имеют лейконоидную организацию. Однако, как нами показано, их регенерация сопровождается эпителиальными морфогенезами. Как разрешить это противоречие? Эти результаты коррелируют с филогенетическим положением исследованных губок. В современной филогении данной группы животных Homoscleromorpha и Calcarea образуют единую кладу, а два других класса (Hexactinellida и Demospongiae) – вторую кладу, сестринскую к кладе Homoscleromorpha + Calcarea. Для клады Homoscleromorpha + Calcarea характерно наличие выраженной эпителиальной структуры, а для клады Demospongiae + Hexactinellida – ее отсутствие. Можно предложить две эволюционные гипотезы, объясняющие эту ситуацию: 1 - у общего предка губок имелись и специализированные межклеточные контакты и эпителиальные морфогенезы, но во кладе Demospongiae + Hexactinellida в ходе эволюции эти признаки были утеряны; 2 - у общего предка не было этих признаков (что логично: были гены и их продукты, но не было структур и морфогенезов). В этом случае, в ходе эволюции клада Homoscleromorpha + Calcarea приобрела эти признаки, а клада Demospongiae + Hexactinellida – нет. Для проверки наших гипотез необходимы глубокие молекулярно-биологические исследования с использованием наиболее древних предковых видов как общих для всех губок, так и для каждой клады. 3) Нами показано, что у губок обладающих специализированными межклеточными контактами (развитым эпителием) вне зависимости от уровня организации тела (лейконоидный - Oscarella, сиконоидный – Sycon или асконоидный – Leucosolenia, Clathrina) основными морфогенезами при регенерации являются эпителиальные. У них отсутствует формирование бластемы. В настоящее время губок разделяют на 4 класса. Все они отличаются по своей тканевой организации и особенностями строения эпителиев (Ereskovsky, 2010): Hexactinellida – имеют синцитиальную структуру и нами не изучались; Demospongiae - нет никаких специализированных контактов в эпителиях и нет базальной мембраны. Во всяком случае, они не выявлены, разве что контакты в базопинакодерме пресноводных губок; Calcarea – нами впервые обнаружены септированные контакты в хоанодерме Calcaronea (Lavrov et al. 2018) и ранее были найдены такие же контакты в хоанодерме Calcinea (Green, Bergquist 1979); Homoscleromorpha – пинакодерма и хоанодерма имеет типичную эуметазойную эпителиальную структуру со специализированными межклеточными контактами и базальной мембраной, включающей коллаген IV (Boute et al., 1996 ; Ereskovsky, Tokina, 2007). 4) Впервые описана тонкая структура и механизм образования уникальной структуры – регенеративной мембраны у известковых губок с асконоидной и сиконоидной водоносной системой. Регенеративная мембрана представляет собой необычную структуру в регенерации животных, характерную только для губок с асконоидной и сиконоидной организацией тела. Нами она обнаружена у Leucosolenia (Lavrov et al. 2018), Clathrina arnesenae, C. сlathrus и Sycon ciliatum (наши неопубликованные данные). Регенеративная мембрана также отличается от раневого эпителия других животных (Borisenko et al., 2015, Ereskovsky et al., 2015, Han et al., 2005, Короткова, 1997, Mladenov et al., 1989; Reddien & Alvarado, 2004), так как у известковых губок нет базального субстрата из внеклеточного матрикса для роста этой структуры. Регенеративная мембрана является предшественником стенок тела у изученных губок, она возникает в результате эпителиального морфогенеза без какого-либо участия клеток мезохила. Прилегающие к ране экзопинакоциты и хоаноциты служат источниками клеток для образования мембраны. Мембрана растет благодаря трансформации формы экзопинакоцитов и одновременной трансдифференцировке хоаноцитов в эндопинакоциты. 5) У исследованных нами Демоспонгий (Halisarca dujardinii, Suberites domuncula, Aplysina cavernicola), у которых отсутствуют специализированные межклеточные контакты, эпителиальные морфогенезы в регенерации не принимают участия - ведущая роль принадлежит эпителио-мезенхимным переходам. 6) Нами впервые показано, что для регенерации Демоспонгий характерно формирование бластемы. В регенеративной биологии бластема определяется как временная специализированная структура, которая образуется при ампутации или повреждении и состоит из массы недифференцированных клеток и которая способна образовывать недостающие структуры путем последующей дифференцировки клеток (Carlson, 2007). При регенерации позвоночных бластема образуется путем дедифференцировки клеток оставшихся тканей, которые впоследствии пролиферируют и, в конечном итоге, редифференцируются в исходные типы клеток или трансдифференцируются в различные типы клеток (Vervoort, 2011). При регенерации Демоспонгий археоциты и дедифференцированные хоаноциты, которые являются тоти- или плюрипотентными клетками этих губок (Funayama, 2018) и другие дедифференцированные клетки накапливаются под поверхностью раны. Это скопление клеток представляет собой бластему, характерную при регенерации многих других животных. Нами впервые показано, что в клетках бластемы Демоспонгий увеличивается пролиферативная активность по сравнению с окружающими участками губки. Далее, из клеток бластемы образуются новые структуры : экзопинакодерма (эктосома) и водоносная система (хоаносома). В предыдущих работах по регенерации губок отмечалось, что формируется бластема, однако это было описано лишь на морфологическом уровне (Короткова, Никитин, 1969a; Boury-Esnault, 1976). 7) Показано, что у известковых губок с асконоидной организацией регенерация проходит по редкому в животном мире типу «чистого» морфалаксиса. Обширные исследования явлений регенерации у разных животных установили, что «истинный» эпиморфоз или морфаллаксис почти никогда не происходят, но вместо этого в процессе восстановления используются различные механизмы, традиционно относящиеся либо к морфаллаксису, либо к эпиморфозу (Agata et al., 2007; Dolmatov & Ginanova, 2009). Нами показано, что регенерация L. complicata и C. arnesenae проходит по крайне редкому в животном мире типу «чистого» морфаллаксиса, когда утраченные части тела замещаются за счет ремоделлинга оставшихся тканей, сопровождающегося трансдифференциацией клеток. При этом пролиферация клеток не играет роли в регенерации. Подобное явление описано только при регенерации Hydra (Bosch, 2007). 8) Показана ведущая роль трансдифференцировок при регенерации губок. Ранее было известно, что у многих губок регенерация и образование примморф из диссоциированных клеток сопровождаются трансдифференцировкой клеток (см обзоры: Borisenko et al. 2015 ; Lavrov & Kosevich 2016). Трансдифференцировка - это преобразование одного типа уже дифференцированной клетки в другой тип нормальной дифференцированной клетки. В некоторых случаях трансдифференцировка сопровождается делением клеток, тогда как в других случаях этого нет (Shen et al., 2004). Мы показали, что независимо от филогенетического положения, типа водоносной системы и структуры эпителиев, для всех исследованных нами губок характерна трансдифференцировка клеток (Borisenko et al. 2015, Ereskovsky et al. 2015, 2017, Lavrov et al. 2018). В то время как археоциты непосредственно дифференцируются в новые клетки, хоаноциты и пинакоциты подвергаются трансдифференцировке во время регенерации. Это подчеркивает крайнюю важность трансдифференцировки при регенерации губок. 9) Получены новые данные о пластичности клеточной дифференцировки: нами показано, что у представителей класса Demospongiae полипотентными клетками являются археоциты и хоаноциты, а у Calcarea и Homoscleromorpha эту роль выполняют хоаноциты и пинакоциты. Причем, следует подчеркнуть, что именно нами в ходе выполнения проекта впервые показано, что хоаноциты и пинакоциты являются основными полипотентными клетками при регенерации Calcarea и Homoscleromorpha. Результаты нашего исследования являются базой для последующего определения молекулярного профиля и ниши стволовых клеток, а также поиска фундаментальных механизмов активации регенерационных способностей у губок. 10) Впервые исследованы клеточные механизмы регенерации губок с точным методом с использованием меченного нуклеотида 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU), маркирующего клетки, в которых происходит синтез ДНК. В предыдущих работах по регенерации губок был использован BrdU (Alexander et al. 2015). Исследования ряда видов губок позволил нам впервые провести сравнительный анализ участия пролиферации в регенерации. 11) Впервые исследовался апоптоз при регенерации губок. Нами освоен и успешно отработан метод изучения апоптоза у регенерирующих губок. Ранее этот вопрос оставался совершенно не затронутым в подобных исследованиях. 12) На основании точных исследований не только клеточных и морфогенетических механизмов репаративной регенерации, но и развития примморф из диссоциированных клеток беломорской губки Leucosolenia variabilis, нами предложена новая перспективная модель для биологии развития – известковая губка с асконоидной организацией. 13) Несмотря на различия в клеточных источниках, клеточных и морфогенетических механизмах регенерации исследованных видов губок из различных филогенетических групп, все они проходят сходные стадии регенерации: 1) выравнивание краев раны и изоляция раневой поверхности от внешней среды, 2) эпителизация, 3) восстановление гистологической структуры под раневой поверхностью, 4) восстановление исходного строения стенки тела. Эти стадии характерны для регенерации и других животных. Таким образом, сравнительное исследование тонких механизмов репаративной регенерации у нескольких видов губок способствует не только более глубокому пониманию механизмов регенерации Porifera, но, учитывая их базовое в филогенетическом отношении положение, приближает нас к пониманию ранних этапов эволюции этих механизмов у Metazoa. 14) За три года участники проекта доложили результаты своих исследований на 7-ми международных и 2-х Российских научных конгрессах в двух приглашенных, 10 устных и 5 стендовых докладах: В 2016 году: V Съезд физиологов СНГ, V Съезд Биохимиков России, Сочи, Россия, 4-8 октября 2016, устный – 1. В 2017 году: 4th International Congress on Invertebrate Morphology (ICIM4), 18 – 23 August 2017, Москва, Россия: устный – 1, стендовый – 3; 10th World Sponge Conference NUI Galway. June 25-30 2017 Голуэй, Ирландия: устный – 2; XIII Всероссийская конференция с международным участием "Изучение, рациональное использование и охрана природных ресурсов Белого моря". 17-20 октября 2017, Санкт-Петербург, Россия : устный – 1, стендовый – 1; «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: онтогенез и формирование биологического разнообразия», 22-24 ноября 2017, Москва: устный – 1. В 2018 году: Euro-Evo-Devo June 26-30, 2018, Galway, Ireland: приглашенный доклад – 1, стендовый доклад – 1; 79 Congress of Unione Zoologica Italiana 25 al 28 settembre 2018 a Lecce, Italy : приглашенный доклад – 1, VII Международная научно-практическая конференция «Морские исследования и образование: MARESEDU - 2018», 30 октября - 2 ноября, 2018, Москва, Россия: устный доклад – 3; COST (European Cooperation in Science and Technology) - MARISTEM Meeting, Observatoire Océanologique Banyuls-sur-Mer, FRANCE, November 28-30, 2018 : устный доклад – 1. 15) Научные результаты проекта и отработанные методики были использованы Ересковским А.В. в качестве приглашенного профессора при проведении 5-ти международных летних школ: 1 -International Schmid Training Course «Organisms for Marine Science». Roscoff, France, 7-19.03.2016; 2- Second International Summer Course in Embryology of Marine Invertebrates, «The White Sea Invertebrates Development». 13 June-3 July 2016, Беломорская биологическая станция, Россия; 3 - «Established and Emerging Model. Organisms for Marine Science ». International Schmid Training Course, Roscoff, France, 6-17.03.2017; 4 - International training School « An integrated approach to marine invertebrate biodiversity: evolutionary and functional adaptations », Avamposto MARE - Port of Tricase (LECCE), 2018-10-01 to 2018-10-06 Tricase (Lecce), Italy; 5 - Schmid Training Course-4V113. Established and Emerging Model Organisms for Marine Science. 10– 14 March, 2018, Pierre et Marie Curry University, Paris, France. 16) Всего за три года было опубликовано три статьи в высокорейтинговых международных журналах, индексируемых в системах WoS, Scopus и РИНЦ, одна статья в сборнике, три статьи в открытом он-лайн журнале и 11 тезисов докладов на научных конференциях.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".