ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
В фоторецепторных клетках сетчатки млекопитающих зрительный рецептор родопсин при поглощении кванта света инициирует сложный сигнальный каскад, приводящий к снижению концентрации вторичного мессенджера цГМФ и изменению мембранного потенциала нейрона. Ключевую роль в этом механизме играет родопсинкиназа или GRK1 (G-protein-coupled receptor kinase-1), которая фосфорилирует световозбужденный родопсин и способствует его десенситизации. До недавнего времени считалось, что родопсин является единственным субстратом родопсинкиназы. Однако, в соответствии с результатами последних исследований на трансгенных животных, предполагается наличие у GRK1 ранее неизвестных нерецепторных субстратов. Таким образом, GRK1 может быть вовлечена в целый ряд сигнальных путей в рамках зрительного каскада. Литературные данные и наши собственные предварительные результаты указывают на то, что с наибольшей вероятностью фосфорилированию под действием GRK1 подвергаются гамма-субъединица фоторецепторной цГМФ-фосфодиэстеразы PDE6 и белок-активатор гуанилатциклазы-2 (GCAP2). В настоящей работе мы задались целью выявить новые субстраты GRK1 с использованием разработанного нами протеомного подхода и охарактеризовать активность фермента в отношении гамма-PDE6 и GCAP2 в реконструированной фоторецепторной системе. Эффективность фосфорилирования будет исследована в присутствии и в отсутствие основного субстрата/активатора GRK1 родопсина и кальций-зависимых регуляторов фермента – рековерина и нейронального кальциевого сенсора-1 (NCS1). Участки фосфорилирования в молекулах гамма-PDE6 и GCAP2 будут определены с использованием мутантных форм этих белков. Изучение альтернативных субстратов GRK1 необходимо для понимания молекулярных механизмов зрения в норме и в патологических условиях, связанными с врожденными мутациями в гене GRK1 и другими нарушениями ее активности.
1) Разработка и оптимизация протеомного подхода для выявления новых нерецепторных субстратов GRK1 в физиологических условиях, а также в условиях in vitro в реконструированной фоторецепторной системе. 2) Идентификация белков, подвергающихся фосфорилированию экзогенной или эндогенной GRK1 в условиях отсутствия/подавления активности других фоторецепторных протеинкиназ, методом масс-спектрометрического анализа. 3) Получение генетической конструкции, содержащей полноразмерную кДНК гамма-субъединицы PDE6. 4) Исследование влияния на эффективность фосфорилирования PDE6 и GCAP2 различных факторов системы, а именно: ионов кальция и магния, основного субстрата/активатора GRK1 родопсина в составе фоторецепторных мембран; рековерина и NCS1; а также высокоспецифичных ингибиторов других фоторецепторных протеинкиназ. 5) Предсказание с помощью биоинформатических инструментов из базы данных OMICtools участков фосфорилирования в структуре гамма-PDE6 и GCAP2. 6) Проектирование и получение мутантных белков с точечными заменами по указанным сайтам, препятствующими включению фосфата. 7) Определение по результатам фосфорилирования мутантных белков в условиях in vitro сайтов фосфорилирования для GRK1 в аминокислотных последовательностях новых субстратов.
Лаборатория зрительной рецепции отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ имеет значительный опыт исследований молекулярных механизмов зрения. Сотрудниками нашей лаборатории был впервые описан фоторецепторный Ca2+-связывающий белок рековерин и экспериментально доказана его роль в регуляции фосфорилирования родопсина под действием GRK1. Открытый нами механизм лег в основу многолетнего исследования фундаментальных принципов функционирования всего зрительного каскада. Так, в рамках этой работы нами были подробно изучены механизм реакции фосфорилирования световозбужденного родопсина и участие рековерина в этом процессе. Впоследствии нами было показано, что рековерин и универсальный кальциевый сенсор кальмодулин осуществляют регуляцию GRK1 совместно. Также нами впервые были получены данные о влиянии рафт-структур фоторецепторных мембран и их интегрального компонента кавеолина-1 на способность рековерина модулировать активность GRK1 и исследовано влияние аутофосфорилирования GRK1 на ее взаимодействие с родопсином. Используя протеомный подход, мы выполнили поиск новых регуляторных мишеней родственного рековерину кальциевого сенсора NCS1 в фоторецепторной клетке, и среди потенциальных сигнальных партнеров этого белка была идентифицирована GRK1. Затем на разработанной нами реконструированной системе было показано, что NCS1 действительно способен высокоспецифично регулировать активность GRK1. Сформированный научный коллектив владеет широким спектром современных экспериментальных и биоинформатических методов и подходов, включая молекулярное клонирование, мутагенез, работу с клеточными культурами и образцами животных тканей, хроматографию, спектрофотометрию, спектроскопию поверхностно-плазмонного резонанса. Коллектив обладает знаниями и навыками, необходимыми для проведения этой работы, что позволяет ожидать ее успешных результатов.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 18 февраля 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Поиск и характеристика новых субстратов родопсинкиназы (GRK1) в фоторецепторной клетке. |
Результаты этапа: 1. Была оптимизирована методика для получения очищенного препарата рекомбинантной гамма-субъединицы PDE6 из культуры E.coli путем ионобменной и гидрофобной хроматографии. 2. Было проведено фосфорилирование GCAP2 и PDE6-гамма в присутствии очищенной родопсинкиназы в реконструированной системе, содержащей родопсин в составе фоторецепторных мембран, радиоактивно меченный АТФ и ингибиторы протеинкиназ A, G и C, а также низкомолекулярный ингибитор родопсинкиназы сангивамицин и кальций-зависимый регулятор ее активности - нейрональный кальциевый сенсор-1 (NCS1). Было показано, что и PDE6-гамма, и GCAP2 подвергаются фосфорилированию в этой системе. В частности: (1) Фосфорилирование GCAP2 является кальций-зависимым и более выражено в случае бескальциевой формы белка. (2) Ингибиторы протеинкиназ А, G и С не оказывают значительного влияния на фосфорилирование GCAP2 в отсутствие кальция, однако в присутствии кальция ингибитор протеинкиназ A и G снижает эффективность фосфорилирования GCAP2. (3) NCS1 не оказывает влияния на фосфорилирование кальций-связанной формы GCAP2, однако фосфорилирование бескальциевой формы GCAP2 происходит с значительно большей эффективностью в присутствие NCS1. (4) Все низкомолекулярные ингибиторы протеинкиназ снижают эффективность фосфорилирования PDE6-гамма, однако эффект сангивамицина наиболее выражен. (5) В присутствие бескальциевой формы NCS1 фосфорилирование PDE6G проходит наиболее эффективно. Таким образом, по-видимому, фосфорилирование PDE6-гамма и GCAP2 происходит при участии нескольких протеинкиназ, включая родопсинкиназу. Для обоих субстратов эффективность фосфорилирования значительно повышается в присутствие бескальциевой формы NCS1. 3. Результаты были представлены на международной конференции "2nd European meeting on phototransduction" в городе Аскона, Швейцария с 4 по 7 сентября 2016 г. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".