Исследование конформации и перераспределения гемоглобина в эритроцитах при старении эритроцита на основе метода Раман-спектроскопииНИР

The study of the conformation and redistribution of hemoglobin at the aging of red blood cells using the Raman spectroscopy

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 октября 2020 г.-1 октября 2021 г. Первый этап реализации проекта
Результаты этапа: В первом этапе проекта при помощи методов Раман-спектроскопии (комбинационное рассеяние, КР), установлено, что что конформация гема и глобина гемоглобина человека (Гб) при изменении рО2 меняется и различна в клетке и в растворе. В работе впервые было получена информация об изменении валентных колебаний аминокислот глобина в эритроците методом КР. Так же, были установлены отличия между характером изменения конформации гемоглобина в клетке и буфере, имитирующим по составу цитоплазму эритроцита. Для анализа изменения конформации использовали соотношения интенсивностей полос спектра КР, которые характеризуют вклад различных связей молекулы в изменение конформации Гб. Таким образом, представление изменения конформации Гб не зависят от концентрации Гб и времени регистрации сигнала. Анализ изменения конформации гема ранее был изучен, однако, в литературе отсутствуют данные об изменениях конформации глобиновой части белка в высокочастотной области КР-спектра – 2800-3000 см-1. Так же, в литературе отсутствуют данные об изменении конформации гема Гб методом КР при постепенном насыщении Гб кислородом. Из сравнения зависимости сатурации Гб О2 от рО2 в крови, с изменениями соотношения интенсивностей полос КР-спектра, характеризующие конформацию гема (I1375/(I1355+I1375)), вклад боковых СН3- групп колебаний полуколец пиррола гема (I1375/I1127) и связей полуколец пиррола в геме (I1375/I1172), а также вклад валентных колебаний винильных групп гемопорфирина (I1550/I1580)), следует что конформация гема различна в области от 0-15 мм рт.ст. («лаг-период»), в области от 15-60 мм рт.ст. («линейная зависимость») и в области от 70-120 мм рт.ст. («насыщение»). Установлено, что при увеличении рО2 сродство Гб к лигандам ((I1355/I1550)/(I1375/I1580)) и к NO (I1618/I1580) меняется различно. Конформация гема, характеризующая сродство к лигандам снижается и меняется аналогично как для гема Гб в эритроците, так и Гб в растворе. При этом, сродство к NO, меняется различно: при увеличении рО2, выявлено снижение вклада колебаний (C1C2) винильных групп по сравнению с CaCmH колебаниями метиновых мостиков (I1618/I1580) у Гб в клетке и увеличение у Гб в растворе. Этот результат свидетельствует о том, что различия в конформация гема при изменении рО2 меняют его способность образовывать и комплексы с NO. В области «линейной зависимости», конформация гема (I1375/(I1355+I1375) в эритроцитах и растворе Гб различны: связывание О2 гемом Гб в растворе происходит медленнее, чем связывание О2 Гб в эритроците. Установлено, что в аналогичных условиях (в области 25-120 мм рт.ст.) вклад боковых –СН3 групп колебаний полуколец пиррола гема и групповые колебания связей полуколец пиррола в геме в изменении конформации гема Гб более выражен для Гб в эритроците, чем для Гб в растворе. При увеличении рО2 до 60 мм.рт.ст., вклад валентных колебаний винильных групп (I1550/I1580) в изменении конформации гема более выражен для Гб в клетке. Согласно изменениям величины соотношений I1640/I1375 и I1172/I1375, при увеличении рО2 переход от «плоской» конформации гема к «скрученной» конформации более выражено для Гб в растворе, чем для Гб в клетке. Нами установлено, что при связывании О2 (область «линейной зависимости»), конформация гема (I1375/(I1355+I1375) в эритроцитах и растворе Гб различны: связывание О2 гемом Гб в растворе происходит менее выражено, чем связывание О2 Гб в эритроците. Установлено, что вклад боковых –СН3 групп колебаний полуколец пиррола гема и групповые колебания связей полуколец пиррола в геме в изменении конформации гема Гб более выражены для Гб в эритроците, чем Гб в растворе. По-видимому, конформация гема Гб, локализованного в цитоплазме (в отличие от Гб в растворе) различна, что и способствует более эффективному перераспределению О2 в «высококонцентрированном гемоглобиновом окружении» в цитоплазме. Вероятно, изменение конформация гема является важным фактором эффективного переноса О2 как между молекулами оГб и дГб при связывании Гб с БПЗ в плазматической мембране, так и при формирование олигомерных структур («кластеров») Гб в цитоплазме клетки, способствующих изменению конформации гема дГб и последовательной передаче О2 от оГб. В клетке, при увеличении рО2 изменения конформации глобина Гб сопровождаются увеличением вклада колебаний Н- метиновых групп аминокислот (I2880/I2930) (при 40-50 мм.рт.ст.) и симметричных концевых метиленовых групп (I2930/I2850) (области 40-60 мм.рт.ст.). В растворе, при увеличении рО2 изменения конформации глобина Гб обусловлено обратимым снижением вклада симметричных колебаний СН- метиленовых групп аминокислот (I2850/I2880) и колебаний Н-метиновых групп аминокислот Гб. Вероятно, в области «линейной зависимости», у глобина эритроцитарного Гб происходит конформационный переход за счет изменения упорядоченности и полярного окружения аминокислот белка. Изучение влияния Са2+ на изменение морфологии эритроцитов и конформации внутриклеточного Гб показали, что при варьировании экстраклеточного Ca2+ ([Са2+]out.) с 10–3 до 10–6 М морфология эритроцита практически не меняется, но уменьшается величина оптической разности хода (ОРХ, характеризует плотность распределения Гб в клетке) цитоплазмы эритроцита. Все эритроциты имеют форму дискоцитов. При инкубации эритроцитов в среде с 1мкМ [ Ca2+]out установлено, что интенсивности КР гемоглобина эритроцитов в 2.6 раза ниже, чем у эритроцитов, инкубированных в среде с 1 мМ [Са2+]out, а максимальная величина интенсивности сигнала выявлена в области ближе к краю клетки при 1 мМ [Са2+]out и в центре клетки при с 1мк М [Са2+]out. Изменение локализации сигнала КР гемоглобина в клетке, вероятно, свидетельствует о перераспределении Гб в цитоплазме и десорбции мембраносвязанного Гб. Изменения величины ζ-потенциала мембраны и конформации гема и глобина эритроцита при варьировании [Са2+]out. Установлено, что при уменьшении [Са2+]out с 1 мМ до 1 мкМ, ζ-потенциал возрастает с –15.4 ± 0.2 до –14.5 ± 0.3 мВ и при более низких концентрациях не меняется. Отметим, что из литературных источников известно, что при старении эритроцита также выявлено перераспределение Гб в цитоплазме: увеличение доли примембранного Гб и снижение поверхностного заряда мембраны. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что увеличение концентрации экстраклеточного Са2+ оказывает существенное влияние на внутриклеточный Гб. С помощью КР-спектроскопии в поляризованном свете исследовали наличие упорядоченности в распределении Гб (гомогенное или негомогенное распределение Гб различных областях клетки). Установлено, что амплитуда характерных полос КР-спектра при перпендикулярной (I⊥) и параллельной поляризации (I||) различна. При снижении [Ca2+]out с 1мМ до 1 мкМ изменения в спектре КР Гб в эритроците в поляризованном свете выявлены в области 1355–3000 см–1. При [Ca2+]out 1 мкМ в плоско поляризованном свете вклад симметричных колебаний боковых СН-групп пиррольных полуколец (I1375/I1127) и способность Гб выделять лиганды (отношение симметричных валентных колебаний пирролов к валентным колебаниям винильных групп) (I1375/I1580) увеличивается, а вклад валентных колебаний винильных групп гемопорфирина (I1580/I1550) и полярность окружения глобина (I2930/2850) по сравнению с [Ca2+]out с 10–3 снижается. В перпендикулярно поляризованном свете уменьшение [Ca2+]out с 10–3 до 10–6 оказывало влияние только на вклад валентных колебаний винильных групп гемопорфирина (I1580/I1550). Таким образом, с помощью КР-спектроскопии в поляризованном свете выявлены изменения структуры молекулы (что отражается в ориентации/вкладе определенных групп) или ее олигомеризации при изменении [Ca2+]out, чего ранее не было показано в литературе. Снижение [Ca2+]out с 1мМ до 1 мкМ приводит к изменению конформации гема и глобина: снижение симметричных колебаний боковых СН-групп пиррольных полуколец (I1375/I1127) и увеличение вклада валентных колебаний винильных групп гемопорфирина (I1580/I1550) и сродства к лигандам (I1375/I1580). Отметим, что при этом не меняется вероятность нахождения гема в плоской конформации (I1640/I1127), но снижается жесткость его белкового окружения (I1170/I1127). При снижении [Са2+]out с 1 мМ до 0.1 М происходит увеличение плотности упаковки глобина (I2850/I2880) и полярности окружения глобина (I2930/I2850), а также снижение упорядоченности СН-групп аминокислот глобина, что может быть связано с изменением поверхностного заряда мембраны и присоединением молекул Гб к мембране (I2880/I2930). Установлено, что при снижении [Ca2+]out изменения конформации глобиновой части Гб в эритроците начинаются при [Ca2+]out 10–5 М, а изменения конформации гема – при [Ca2+]out 10–6 М. Таким образом, показано, что изменения конформации как гемовой, так и глобиновой части внутриклеточного Гб при снижении [Ca2+]out до 10–4 М связаны частично с изменением поверхностного заряда (ζ-потенциал) мембраны (на 6%), но в большей степени с увеличением мембранного потенциала (на 25%). В работе установлено, что снижение [Ca2+]out увеличивает поверхностный заряд, и это сопровождается изменением конформации гема и глобина, а также его олигомеризацией (за счет снижения упорядоченности цитоплазмы и десорбции примембранного Гб). Обратимое связывание Гб с мембранами может быть адаптивной реакцией, направленной на стабилизацию липидного бислоя мембран и/или регуляцию его упруго-механических свойств, и осуществляется за счет электростатических взаимодействий Гб с БП3. Вероятно, снижение [Ca2+]out меняет конформацию гема и расположения близлежащих к гему аминокислот дезоксигемоглобина (например, лизина) и локализацию анионного сегмента БП3 за счет увеличения мембранного потенциала и поверхностного заряда. Этот процесс сопровождается десорбцией мембраносвязанного дезоксигемоглобина и последующей олигомеризацией цитоплазматического, оксигемоглобина что меняет кислородтранспортные свойства эритроцита. Используемые методы: Методика выделения эритроцитов и гемоглобина из цельной крови: Суспензию эритроцитов (СЭ) получали с помощью центрифугирования при 1500g в течении 10 минут при 4°С цельной крови с физиологическим буфером (145мМ NaCl, 5мМ KCl, 4мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, 1мМ СаСl2, 1мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы (Sigma, США), рН 7.4). Отмывку эритроцитов от компонентов плазмы проводили трижды. Суспензию эритроцитов хранили при 4°С и использовали в течение трех часов после выделения. Гемоглобин выделяли из эритроцитов при инкубации клеток в буфере (4мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, рН 7.4 в соотношении 1:10, гемолиз осмотическим шоком) с последующим удалением клеточных мембран центрифугированием в течении 10 минут при 6000g и 4°С. Концентрацию гемоглобина (далее, раствор Гб) определяли спектрофотометрическим методом (длина волны 415 нм). Инкубация эритроцитов и Гб в растворе с содержанием Са2+ 1мкМ-1мМ: СЭ получали согласно описанной выше методике. Физиологический буфер, при помощи которого проводили отмывку эритроцитов содержал в себе различное количество СаСl2 в зависимости от исследуемой концентрации Са2+. После отмывки эритроцитов, гемолиз проводили в соответствующем фосфатном буфере с добавлением СаCl2 (1мкМ, 10-5 М, 10-4 М, 5х10-4 М, 1 мМ). Измерения проводили через 10 минут после начала инкубации. Изменение содержания кислорода в пробах: Проводили с помощью продувки газовой фазы над средой инкубации с объектом исследования (объем пробы 2 мл (Ht = 40%) в течение 20 мин) газовой смесью (смесь А: азот и 0.04% СО2 (ООО «ПГС-сервис», РФ)) в течение 20 мин при постоянном перемешивании (при 18-21°С, скорость потока газовой смеси 0.1 л/мин). При формировании смеси с требуемым парциальным давлением кислорода (смесь Б) внутри герметичного бокса проводилось смешивание определенных долей смеси А и кислорода (рО2 контролировали при помощи электрода КЕ-25 (Figaro Engineering Inc., Япония). В герметичном боксе эритроциты (или гемоглобин) помещали в предварительно продутые в течении 2 минут смесью Б стеклянные капилляры (диаметр поперечного сечения 1 мм, ООО «Агат-Мед», РФ). Для нормализации давления газовой смеси в боксе применяли воздушный клапан с порогом срабатывания около 1 атм. В качестве контроля использовали СЭ и раствор Гб, приготовленные в тех же условиях, но без использования смеси Б. После заполнения капилляры герметично запаивали и хранили при температуре 4°С не более 3 ч. Исследование конформации гема и глобина гемоглобина: Осуществляли при помощи конфокального микроскоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT, РФ) в диапазоне 1000 - 3000 см-1, с шагом измерения 0.8 см-1, регистратор - ССD детектор с Пельтье охлаждением -50 ℃ (объектив 5х с апертурой 0.15, решетка 600 штр/мм), мощность лазера на образце составляла не более 3мВт, длина волны возбуждения 532 нм. Зарегистрированные спектры обрабатывали в программе Origin2017 (OriginLab Corporation, США). Распределение амплитуды КР в клетке (построение Рамановских карт): Проводили с одиночных эритроцитов, нанесенных на покровное стекло. Регистрацию сигнала осуществляли при помощи конфокального микроскоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT, РФ) в диапазоне 1000–3000 см–1, с шагом измерения 0.8 см–1 (объектив 20× с апертурой 0.45, решетка 600 штр/мм), длина волны возбуждения 532 нм, время получения одного изображения – 10 мин. Зарегистрированные спектры обрабатывали в программе Origin2017 (OriginLab Corporation, США). КР-спектроскопия в поляризованном свете: Для выявления изменений упорядоченности молекулярных колебаний связей гема и глобина КР регистрировали в условиях с различными положениями плоскости поляризации лазера относительно образца. Для этого СЭ наносили на покровное стекло и регистрировали сигнал от одиночных клеток или от раствора Гб. Регистрацию спектров КР в поляризованном свете проводили на КР-спектрометре WITec alpha 300 (Zeiss, Германия) в диапазоне 200–3100 см–1 с шагом измерения 0.3 см–1 (объектив 20× с апертурой 0.45, решетка 1800 штр/мм), мощность лазера на образце – 7мВт, длина волны возбуждения 532 нм, время регистрации сигнала – 5 с. Поляризацию осуществляли с помощью установки поляризатора (ThorLabs, США) под углом поляризации 0 и 90 градусов в специальное отверстие. Изменения морфологии эритроцита и оптической разности хода (ОРХ) луча света цитоплазмы: Проводили на СЭ методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ). Для этого, СЭ разводили в 1000 раз в буфере с тестируемой концентрацией Са2+, инкубировали в течении 10 минут и фиксировали в 25 % глутаровом альдегиде. Суспензию фиксированных эритроцитов наносили на предметное стекло с зеркальным покрытием и регистрировали топографию распределения величины ОРХ цитоплазмы клетки с помощью лазерного интерференционного микроскопа (ЛИМ, ВНИИОФИ, РФ) на базе микроинтерферометра Линника МИИ-4 (ЛОМО, РФ) с объективом 30× (NA = 0.65), с мощностью лазера на объекте менее 2 мВт (λ = 650 нм). Размер регистрируемого кадра составлял 195 × 145 мкм. Для восстановления фазового изображения использовали программу WinPhast (ВНИИОФИ, РФ), а для реконструкции изображений – программы FIJI (ImageJ, США) и Origin2017 (Microcal Inc., OriginLab Corporation, США). Реконструкция позволяла анализировать изменения величины ОРХ цитоплазмы эритроцита (средняя фазовая высота эритроцита) и площади клетки. Регистрация изменений ζ-потенциала: Изменение ζ-потенциала плазматической мембраны проводили в термостатируемой кювете при 25°С, время адаптации образца к температуре – 100 с при помощи Zetasizer ZS (Malvern). Для этого, СЭ (Нt = 40%) разводили в 1000 раз в буфере с соответствующей концентрацией Са2+.
2 1 октября 2021 г.-1 октября 2022 г. Второй этап реализации проекта
Результаты этапа: В проекте на этапе 2021 года методами Раман спектроскопии и SERS установлено, что при снижении величины ζ-потенциала происходит перераспределение конформации Гб внутри клетки: наблюдается изменение локализованного в центральной катионной полости примембранного дГб. Изменение положения анионного сегмента белка полосы, что приводит к модификации связанного с ним дезоксиГб (мембрановязанного), выражаемой в более плотной упаковке глобина с более выраженными симметричными колебаниями пирролов гема. Вероятность нахождения гема в плоской конформации при нормальных условиях ([Ca2+] out = 3мМ) выше на краях клетки, чем в центральной области клетки. Увеличение плотности белковой глобулы приводит к увеличению вероятности нахождения гема в плоской форме. Снижение величины [Са2+]out до 1 мкМ приводит к состоянию, в котором наблюдается перераспределение молекул цитоплазматического Гб в клетке при отсутствии изменения её формы и объема (показано при помощи метода ЛИМ). Так же, метод ЛИМ показал, что при изменении [Са2+]out в среде инкубации эритроцитов помимо отсутствия изменения морфологии (все эритроциты сохраняют форму дискоцитов, отсутствует статистически значимое изменение площади клетки и её средней величины ОРХ (оптической разности хода, параметр характеризует изменение плотности вещества), однако, выявлено изменение параметра ОРХцентр/ОРХкрай клетки. При этом, наиболее эффективно демонстрируют изменение распределения Гб в клетке соотношения полос Рамановского спектра: I1580/I1375, I1640/I1375, I2880/I2850, вероятно, это может быть связано с их наибольшим вкладом (другими словами, высокой интенсивностью и высоким соотношением сигнал/шум) в общий вид спектра. При снижении [Са2+]out способность связывать Гб с О2 выравнивается по площади клетки и приводит к более локализованному распределению Гб у поверхности клетки. Данный процесс может быть связан с проблемой выделения О2 в тканях. Дополнительный анализ Рмановских спектров в поляризованном свете В условиях низкой концентрации катионов [Са2+]out, у цитоплазматического Гб различна конформация валентных колебаний винильных групп в поляризованном и неполяризованном свете. Конформация глобина различна только для перпендикулярно поляризованного света. При [Са2+]out = 10-3 М, достоверно отличается колебания винильных групп и пиррольных колец, а также, плотность упаковки глобина. Отметим, что в Рамановских спектрах Гб эритроцитов, конформация глобина при поляризованном свете различна. Таким образом, при помощи поляризации, удалось выявить существование механизмов, регулируемых кальцием. Наблюдаемый эффект связан с возможностью [Са2+]in активировать ряд АТФаз и, взаимодействуя с кальмодулином, изменять поверхностный заряд мембраны и конформацию Гб, связываясь с отрицательно заряженными аминокислотными остатками белков и сиаловых кислот на поверхности мембраны. Главным образом, изменения выявлены в глобиновой части, что может указывать на взаимодействие глобина со структурами мембраны клетки, например, БП3. Таким образом, при помощи поляризации, можно выявить изменения структуры молекулы или ее олигомеризацию при изменении [Са2+]out. Вход воды в клетку (вызванный инкубацией эритроцитов с уабаином и накоплением Na+ внутри клетки), снижает абсолютную величину ζ-потенциала мембраны с -15,2 ± 0,2 до -13,2 ± 0,2 мВ, а так же приводит к увеличению нахождения Гб в куполообразной форме, что снижает способность Гб связывать О2 и плотность упаковки глобина. Вероятно, данный механизм способствует большей эффективности кислородного обмена, при входе эритроцитов в капилляры сосудов. Методами КР показано, что блокирование Na+/K+-АТФазы оказывает влияние на конформацию гема главным образом в области валентных колебаний пирролов. Снижение времени жизни триптофанвоой флуоресценции указывает на изменение физико-химического окружения молекул Гб и может характеризовать снижение плотности упаковки глобиновой глобулы Гб. Методом ЛИМ было установлено, что после часовой инкубации СЭ в растворе с 3 мМ уабаином наблюдается изменение объема клеток, при этом, существенно снижается амплитуда оптической разности хода, за счет перераспределения Гб при входе воды при накоплении [Na+]in что так же может указывать на вход воды в клетку. При этом, отсутствуют изменения в форме эритроцита, но, в центе тора дискоцита выявлено увеличение плотности распределения молекул Гб, а именно, их локальное увеличение в самой плоской части клетки. Мы объясняем отсутствие существенных изменений в объеме эритроцита с процессами на поверхности мембраны, а именно, фосфолирированием спектрина Са2+ и АТФ, которые находятся в динамическом равновесии и оказывают существенное влияние на жесткость мембраны, трансмембранный потенциал и поверхностный заряд плазматической мембраны эритроцита. существенные изменения в конформации гема СЭ отмечены для колебаний характеризующих снижение, подвижности гема (увеличение величины соотношения I1375/I1172) и снижением способности Гб сбрасывать лиганды (снижение величины соотношения I1580/I1375), что может быть вызвано деполяризацией мембраны, увеличением межмолекулярных расстояний между молекулами Гб как за счет входа воды, экранирования молекул Гб молекулами воды, а также, селективного связывания катионов Na+ белками. Увеличение [Na+]in снижение ОРХ эритроцита при блокировании работы Na+/K+-АТФазы происходит за счет входа молекул воды внутрь эритроцита, при этом, в глобиновой части молекулы наблюдается тенденция к снижению плотности упаковки Гб за счет снижения упорядоченности СHn-групп (снижение величины соотношения I2880/I2930),). Все это указывает на увеличение рыхлости структуры молекулы (снижение плотности упаковки глобина не за счет изменений в главной оси белка). При этом, отсутствует влияние увеличения объема клетки при инкубации СЭ с уабаином на количество комплексов окси- и дезоксигемоглобина в пробах, доли гема в куполообразной форме и сродства Гб к лигандам, что может. Эти процессы могут быть связаны с компенсацией заряда при деполяризации мембраны – активация внутриклеточных фосфолипаз, приводит к изменению упорядоченности жирнокислотных хвостов мембранных липидов и снижении доли Гбмс, в комплексе с БП3. Данный процесс может быть компенсирован ионами экстраклеточного Са2+, который будет увеличивать количество кластеров отрицательно заряженных остатков сиаловых кислот на поверхности мембраны эритроцита и свободных ОН-групп тирозина БП3. Эритроциты, являясь клетками с высокой степенью деформации (от нормальной формы двояковогнутого диска из-за изменений условий потока в кровотоке) сохраняют свою форму при блокировании активности Na+/K+-АТФазы, а вход воды в клетку приводит к изменению поверхностного заряда на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны (Рисунок 50В). В этих условиях выявлены изменения конформации как гема, так и белковой глобулы Гб, а именно, снижение плотности упаковки молекулы Гб, которые могут быть обусловлены как с сорбцией Na+ с Гб, так и увеличением количества молекул воды в клетке и перераспределением Гб в клетке. Вероятно, перераспределение Гб и увеличение вероятности нахождения гема в куполообразной форме увеличивает способность связывать О2. При этом, снижается плотность упаковки Гб эритроцитов за счет снижения локальной концентрации Гб и изменения водородных связей гидрофильной поверхности глобина, образующие связи между глобулами Гб, а также, снижается время жизни триптофановой флуоресценции, что может вызвано снижением плотности упаковки глобина и экранированием триптофанов молекулами воды. Доказано, что конформация цитоплазматического и примембранного Гб отлична. При этом, степень изменения конформации мембраносвязанного Гб зависит от времени инкубации с уабаином. Вероятно, выявленные изменения обусловлены главным образом изменениями во вторичной структуре белка - глобина близ центров локализации гема в Гб. Используемые методы: Методика выделения эритроцитов и гемоглобина из цельной крови: Суспензию эритроцитов (СЭ) получали с помощью центрифугирования при 1500g в течении 10 минут при 4°С цельной крови с физиологическим буфером (145мМ NaCl, 5мМ KCl, 4мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, 1мМ СаСl2, 1мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы (Sigma, США), рН 7.4). Отмывку эритроцитов от компонентов плазмы проводили трижды. Суспензию эритроцитов хранили при 4°С и использовали в течение трех часов после выделения. Гемоглобин выделяли из эритроцитов при инкубации клеток в буфере (4мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, рН 7.4 в соотношении 1:10, гемолиз осмотическим шоком) с последующим удалением клеточных мембран центрифугированием в течении 10 минут при 6000g и 4°С. Концентрацию гемоглобина (далее, раствор Гб) определяли спектрофотометрическим методом (длина волны 415 нм). Инкубация эритроцитов и Гб в растворе с содержанием Са2+ 1мкМ-1мМ: СЭ получали согласно описанной выше методике. Физиологический буфер, при помощи которого проводили отмывку эритроцитов содержал в себе различное количество СаСl2 в зависимости от исследуемой концентрации Са2+. После отмывки эритроцитов, гемолиз проводили в соответствующем фосфатном буфере с добавлением СаCl2 (1мкМ, 10-5 М, 10-4 М, 5х10-4 М, 1 мМ). Измерения проводили через 10 минут после начала инкубации. Инкубация эритроцитов и Гб в растворе с содержанием уабаина 10мкМ – 3 мМ: Для приготовления образцов с уабаином готовили стоковый раствор с исходной концентрацией 10мМ уабаина в буфере Аллена и 10 мМ уабаина в растворе для гемолиза. Выделение мембран эритроцитов (тени эритроцитов): Для приготовления теней эритроцитов из цельной крови человека, готовят буферы следующего состава: Буфер В (из расчета на V = 500 мл): 5 мМ KCl (0,185 гр), 145 мМ NaCl (4,205 гр), 1мМ NaH2PO4*2H2O (0,075 гр), 4мМ Na2HPO4*12H2O (0,715) гр, 1мМ CaCl2 (550 мл 10% р-ра), 1мМ MgSO4*7H2O (0,060 гр), 10мМ C6H12O6 (0,9 гр). Буфер С (из расчета на V = 500 мл): NaH2PO4*2H2O (0,075 гр), 4мМ Na2HPO4*12H2O (0,715) гр, рН=7.4. Выделенную накануне кровь человека ночь хранили на льду, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (5 Ед/мл крови). После, пробирки с кровью (Vacuette, Greiner Bio-One, Австрия) центрифугировали (Laborfuge 400R, ThermoScientific, США) при 1500g в течении 10 минут при +4 °С. Посце центрифугирования, супернатант и лейкоцитарную фракцию удаляли. К полученной суспензии эритроцитов добавляли буфер В в соотношении 1:1, аккуратно перемешивали и центрифугировали при тех же параметрах. Полученный супернатант удаляли. После, проводили отмывку СЭ ещё раз. Полученную СЭ перемешали и хранили на льду. Буфер С разливали в 3 пробирки по 30 мл буфера в каждой, после чего, одну из пробирок помещали в морозильную камеру (-18 ℃) до образования кристаллов льда, две оставшиеся пробирки хранили в холодильнике при +4 ℃. В 30 мл ледяного буфера С вносили покапельно 1.5 мл СЭ при постоянном перемешивании. Полученный образец помещали в морозильную камеру на 10 минут, после чего хранили при +4 ℃ в течении 20 минут. После охлаждения образца, его аккуратно перемешивают и центрифугируют при 3500g (Laborfuge 400R, ThermoScientific, США), при +4 ℃ в течении 40 мин. Полученный супернатант сливают до появления мутного осадка. Осадок переносят в пробирку с 30 мл буфера С, который хранили при +4 ℃. После чего повторяют дважды процедуры отмывки осадка. После последнего центрифугирования, осадок переносят в пробирку типа эппендорф (1.5 мл) и центрифугируют при 13000g (Laborfuge 400R, ThermoScientific, США), при +4 °С в течении 40 мин. Образовавшийся супернатант удаляют автоматической пипеткой. Приготовленные аликвоты теней эритроцитов распределяют по эппендорфам и хранят при температуре -80 ℃ [211]. Изменение содержания кислорода в пробах: Проводили с помощью продувки газовой фазы над средой инкубации с объектом исследования (объем пробы 2 мл (Ht = 40%) в течение 20 мин) газовой смесью (смесь А: азот и 0.04% СО2 (ООО «ПГС-сервис», РФ)) в течение 20 мин при постоянном перемешивании (при 18-21°С, скорость потока газовой смеси 0.1 л/мин). При формировании смеси с требуемым парциальным давлением кислорода (смесь Б) внутри герметичного бокса проводилось смешивание определенных долей смеси А и кислорода (рО2 контролировали при помощи электрода КЕ-25 (Figaro Engineering Inc., Япония). В герметичном боксе эритроциты (или гемоглобин) помещали в предварительно продутые в течении 2 минут смесью Б стеклянные капилляры (диаметр поперечного сечения 1 мм, ООО «Агат-Мед», РФ). Для нормализации давления газовой смеси в боксе применяли воздушный клапан с порогом срабатывания около 1 атм. В качестве контроля использовали СЭ и раствор Гб, приготовленные в тех же условиях, но без использования смеси Б. После заполнения капилляры герметично запаивали и хранили при температуре 4°С не более 3 ч. Исследование конформации гема и глобина гемоглобина: Осуществляли при помощи конфокального микроскоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT, РФ) в диапазоне 1000 - 3000 см-1, с шагом измерения 0.8 см-1, регистратор - ССD детектор с Пельтье охлаждением -50 ℃ (объектив 5х с апертурой 0.15, решетка 600 штр/мм), мощность лазера на образце составляла не более 3мВт, длина волны возбуждения 532 нм. Зарегистрированные спектры обрабатывали в программе Origin2017 (OriginLab Corporation, США). Распределение амплитуды КР в клетке (построение Рамановских карт): Проводили с одиночных эритроцитов, нанесенных на покровное стекло. Регистрацию сигнала осуществляли при помощи конфокального микроскоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT, РФ) в диапазоне 1000–3000 см–1, с шагом измерения 0.8 см–1 (объектив 20× с апертурой 0.45, решетка 600 штр/мм), длина волны возбуждения 532 нм, время получения одного изображения – 10 мин. Зарегистрированные спектры обрабатывали в программе Origin2017 (OriginLab Corporation, США). КР-спектроскопия в поляризованном свете: Для выявления изменений упорядоченности молекулярных колебаний связей гема и глобина КР регистрировали в условиях с различными положениями плоскости поляризации лазера относительно образца. Для этого СЭ наносили на покровное стекло и регистрировали сигнал от одиночных клеток или от раствора Гб. Регистрацию спектров КР в поляризованном свете проводили на КР-спектрометре WITec alpha 300 (Zeiss, Германия) в диапазоне 200–3100 см–1 с шагом измерения 0.3 см–1 (объектив 20× с апертурой 0.45, решетка 1800 штр/мм), мощность лазера на образце – 7мВт, длина волны возбуждения 532 нм, время регистрации сигнала – 5 с. Поляризацию осуществляли с помощью установки поляризатора (ThorLabs, США) под углом поляризации 0 и 90 градусов в специальное отверстие. Регистрация спектров методом гигантского комбинационного рассеяния (ГКР): Для использования метода ГКР необходимо синтезировать наноструктуры: Синтез наноструктур проводили по следующей схеме: 0,3 гр AgNO3 растворяли в 100 мл воды MilliQ и перемешивали большим мешальником (Deltalab, Испания) при 300 об./мин. После полного растворения AgNO3, тонкой струей вливали 30 мл 5мМ NaOH (из расчета 7 гр NaOH на 30 мл воды), после чего наблюдали выпадение темного осадка. Выпавший осадок трижды аккуратно промывали 100 мл MilliQ. После отмывки, к осадку добавляли около 5 мл концентрированного раствора аммиака ч.д.а. под тягой, перемешивали стеклянной палочкой до полного растворения осадка и добавляли 20 мл MilliQ. Покровные стекла, отмытые в детергенте, высушивали на воздухе. После, выдерживались в этиловом спирте ч.д.а. и ультразвуковой бане 3 минуты для обезжиривания поверхности. Высушенные на воздухе покровыне стекла помещали в термически устойчивый стеклянный стакан объемом 1 л. Стакан с покровными стеклами устанавливали на предварительно разогретую до 340 ℃ нагревающую поверхность (IKA C-mag HS 4, Германия). Контроль температуры дополнительно осуществляли при помощи теплового щупа. 20 мл аммиачного раствора серебра заливали в ультразвуковой распылитель Альбедо и равномерно напыляли на поверхность покровных стекол медленными круговыми движениями циклами с перерывами на каждые 5 минут. Расстояние сопла Альбедо от покровных стекол составляло около 2 см. После распыления аммиачного раствора серебра, полученные пластинки выдерживали 15 минут при температуре 340 ℃, после чего охлаждали и хранили в течении месяца в темном месте при комнатной температуре. Использование пластинок для измерений возможно через неделю после напыления наноструктур. Для регистрации спектров ГКР, на СЭ разводили в 1000 раз буфером Аллена без добавления глюкозы. После, на покровное стекло наносили каплю образца объемом 5 мкл и накрывали сверху подложкой с наноструктурами типа серебряных колец. Регистрацию сигнала проводили на КР-спектрометре NTEGRA-SPECTRA (NT-MTD, Россия) с использованием объектива 5х с числовой апертурой 0,15 при комнатной температуре. Диаметр пятна лазера составлял 400-500 нм. Время регистрации сигнала составило 20 секунд с трехкратным накоплением сигнала. Ослабление лазера составило ND = 0,2. Мощность лазера на образце менее 3мВт. Перед измерения предварительно проверяли выгорание образца последовательным снятием спектров с образца в течении 5 минут. Обработку спектров проводили в программе OriginPro. Обработка сигнала включала в себя вычитание базовой линии.. Изменения морфологии эритроцита и оптической разности хода (ОРХ) луча света цитоплазмы: Проводили на СЭ методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ). Для этого, СЭ разводили в 1000 раз в буфере с тестируемой концентрацией Са2+ (или уабаина) инкубировали в течении 10 минут (или 20 и 60 минут для уабаина) и фиксировали в 25 % глутаровом альдегиде. Суспензию фиксированных эритроцитов наносили на предметное стекло с зеркальным покрытием и регистрировали топографию распределения величины ОРХ цитоплазмы клетки с помощью лазерного интерференционного микроскопа (ЛИМ, ВНИИОФИ, РФ) на базе микроинтерферометра Линника МИИ-4 (ЛОМО, РФ) с объективом 30× (NA = 0.65), с мощностью лазера на объекте менее 2 мВт (λ = 650 нм). Размер регистрируемого кадра составлял 195 × 145 мкм. Для восстановления фазового изображения использовали программу WinPhast (ВНИИОФИ, РФ), а для реконструкции изображений – программы FIJI (ImageJ, США) и Origin2017 (Microcal Inc., OriginLab Corporation, США). Реконструкция позволяла анализировать изменения величины ОРХ цитоплазмы эритроцита (средняя фазовая высота эритроцита) и площади клетки. Регистрация изменений ζ-потенциала: Изменение ζ-потенциала плазматической мембраны проводили в термостатируемой кювете при 25°С, время адаптации образца к температуре – 100 с при помощи Zetasizer ZS (Malvern). Для этого, СЭ (Нt = 40%) разводили в 1000 раз в буфере с соответствующей концентрацией Са2+ (или предварительно инкубировали пробу СЭ с уабаином соответствующей концентрации 20 и 60 минут, после чего осуществляли измерение параметра). Счет одиночных фотонов с корреляцией по времени (Time Correlated Single Photon Counting — TCSPC) триптофана: Изменение структуры молекулы Гб исследовали путем измерения собственной кинетики затухания флуоресценции триптофанов, которую возбуждали импульсным субнаносекундным УФ-светодиодом (EPLED 265, Edinburgh Instruments, Шотландия), с максимальным излучением при 260 нм, скорректированным металлическим полосовым фильтром (260 нм, ширина 15 нм, Chroma, США), выдающий импульсы длительностью 700 пс со средней мощностью 0,6 мкВт при частоте повторения 20 МГц. Флуоресценцию образцов в диапазоне 300–400 нм с выделенным максимумом при 340 нм регистрировали перпендикулярно пути возбуждающего луча через коллимационную линзу, соединенную с оптическим волокном 16-канального коррелированного по времени спектрографа с однофотонным счетом (PML-SPEC, Becker & Hickl GmbH, Германия). Спектрограф оснащен детектором ПМЛ-16-С и решеткой 1200 штр/мм, что позволяет получить разрешение 6,25 нм для каждого отдельного спектрального канала. Регистрацию спектров проводили на одном спектральном канале при помощ коррелированной по времени и длине волны системы счета одиночных фотонов (TCSPC) на базе одного модуля TCSPC (SPC-130EM, Becker & Hickl GmbH, Германия). Синий светодиод управлялся драйвером светодиода (DC2200, Thorlabs, США), который также обеспечивал TTL-сигналы для синхронизации с системой TCSPC. Аппаратура TCSPC работала в режиме FIFO, таким образом записывая поток спектрально меченных одиночных фотонов вместе с внешними маркерами в программном обеспечении для измерений SPCM 9.82 (https://www.becker-hickl.com, Becker & Hickl GmbH, Германия). Измерения проводили в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Для регистрации приблизительно 106 фотонов потребовалось 10 секунд, чтобы добиться надежного отношения сигнал/шум, измерение повторялось три раза. Для измерений, СЭ разводили в 1000 раз в буфере Аллена и ждали установления температуры в термостатирующей ячейке при +25°С. Время адаптации образца к температуре — 60 секунд. Все эксперименты проводились не менее трех раз. Изменения интенсивности, времени жизни и спектра флуоресценции обрабатывали с помощью пакета программ SPCImage 8.0 (https://www.becker-hickl.com, Becker & Hickl, Германия). Все эксперименты, повторяли не менее шести раз. Статистический анализ: Выявление статистической значимости наблюдаемых различий в данных молекулярной спектроскопии (сравнение соотношений интенсивностей пиков, времени жизни пикосекундной триптофановой флуоресценции, величины ζ-потенциала) между результатами проводили с использованием теста Манна-Уитни (Mann-Whitney U test) или с использованием дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса, (Kruskal-Wallis one-way analysis of variance). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Анализ изображений, полученных методом ЛИМ осуществляли в программе FIJI ImageJ. Разложение кривых затухания времени жизни пикосекундной флуоресценции проводили в пакете программ SPCImage 8.0, Данные считали удовлетворимыми при построении аппроксимационной кривой при распределении χ2 = [0,88 — 1,11], что соответствует величине p-значения = [0,90 — 0,80], то есть, кривая аппроксимации построенная по рассчитанным коэффициентам достаточно достоверно описывает экспериментальные значения. Заключение: Изменение поверхностного потенциала эритроцита оказывает существенное влияние на конформацию мембраносвязанного и цитоплазматического Гб. При этом, цитоплазматический Гб принимает участие в компенсации изменения поверхностного потенциала клетки. При этом, отмечается снижение плотности упаковки мембраносвязанного Гб, что может приводить к снижению эффективности его взаимодействия с белком полосы 3 и оказывать таким образом влияние на кислород-транспортную функцию эритроцита. Деполяризация плазматической мембраны эритроцита приводит не только к изменению конформации цитоплазматического Гб, но и его перераспределению внутри клетки. При этом, Гб с гемом в куполообразной форме (характерной для дезоксиГб) равномерно распределяется по внутреннему пространству клетки. Для 1 мМ Са характерно распределение интенсивности сигнала ближе к краям клетки, а для 1 мкМ – к центру клетки. Важно отметить, что изменение конформации гема сопровождается изменением плотности упаковки глобина. В центральной части эритроцита (самая тонкая часть тора) установлена максимальная вероятность нахождения гема в плоской форме (характерной для оксиГб). При изменении поверхностного потенциала отмечено образование олигомерных структур цитоплазматического Гб внутри эритроцита.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".