| 1 |
1 октября 2020 г.-1 октября 2021 г. |
Выявление роли Р-гликопротеина в реализации пластичности провоспалительных макрофагов человека при действии противотуберкулёзных препаратов |
| Результаты этапа: В первый год реализации проекта были получены следующие ключевые результаты:
1. Было показано, что бедаквилин, как и рифампицин, является субстратом для P-gp, но проявляет гораздо более слабую субстратную специфичность к данному белку, что может быть одним из факторов его эффективности при лечении лекарственно-устойчивых форм туберкулёза. Так же было показано, что рифампицин в составе полимера молочной кислоты также является субстратом для P-gp, что ставят вопрос об эффективности создания инкапсулированных противотуберкулёзных препаратов в целях избежать их взаимодействие с P-gp.
2. Было обнаружено, что рифампицин в терапевтической концентрации увеличивает уровень экспрессии гена MDR1 белка P-gp в процессе макрофагальной дифференцировки, в то время как бедаквилин, напротив, значимо снижает уровень экспрессии гена на ранних этапах дифференцировки макрофагов, что также может быть одним из факторов его эффективности при лечении лекарственно-устойчивых форм туберкулёза.
3. Была определена концентрация, равная 10 мкМ, при которой R-верапамил полностью ингибирует функциональную активность P-gp в провоспалительных макрофагах человека. Это позволило исследовать функциональные характеристики провоспалительных макрофагов в присутствии функционально-активного P-gp и при его фармакологическом ингибировании.
4. Исследование влияния противотуберкулезных препаратов на экспрессию генов и секрецию провоспалительных цитокинов выявлено, что под воздействием рифампицина наблюдается снижение экспрессии таких провоспалительных генов как IL1b, TNF-a и IL6, а также секреции цитокина IL1b, что свидетельствует о противовоспалительных свойствах рифампицина. Действие бедаквилина на экспрессию генов провоспалительных цитокинов зависит от стадии макрофагальной дифференцировки: ингибирующий эффект бедаквилина проявляется только на её ранней стадии. При этом секреция IL10 возрастает при действии бедаквилина, но не рифампицина. В отличие от рифампицина бедаквилин оказывает выраженное действие на экспрессию генов рецепторов фагоцитоза CD64 и CD209, повышая уровень их экспрессии. Таким образом, противовоспалительные свойства рифампицина могут быть использованы для иммуномодулирующего эффекта при туберкулёзном воспалении. Влияние бедаквилина на эффективность фагоцитоза требует дальнейшего изучения, так как его стимулирующее действие на экспрессию рецепторов фагоцитоза свидетельствует о важном терапевтическом свойстве бедаквилина и имеет перспективы для использования в целях повышения эффективности лечения лекарственно-устойчивых форм туберкулёза.
5. Было обнаружено, что фармакологическое ингибирование P-gp R-верапамилом приводит к отмене эффектов рифампицина, которые связаны со снижением уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов. Это свидетельствует о важной роли P-gp как транспортёра и регулятора воспаления. Полученные результаты свидетельствуют о функциональной значимости P-gp для реализации как провоспалительного фенотипа макрофагов, так и фармакологических эффектов антибактериальных препаратов. В связи с тем, что обсуждается вопрос о фармакологическом ингибировании P-gp в целях, повышения эффективности противотуберкулёзной химиотерапии полученные данные свидетельствуют, что этот вопрос требует дальнейшей проработки.
Была сконструирована лентивирусная плазмида, содержащая shRNA против гена MDR1 для последующей конститутивной трансформации макрофагов.
Представленные данные получены впервые и демонстрируют влияние основных противотуберкулёзных препаратов – рифампицина и бедаквилина на функциональные характеристики провоспалительных макрофагов, их провоспалительный фенотип и функциональную активность P-гликопротеина.
|
| 2 |
1 октября 2021 г.-1 октября 2022 г. |
Выявление роли Р-гликопротеина в реализации пластичности провоспалительных макрофагов человека при действии противотуберкулёзных препаратов |
| Результаты этапа: При реализации проекта были получены следующие основные результаты:
1. Было показано, что бедаквилин, как и рифампицин, является субстратом для P-gp. Так как рифампицин является субстратом для P-gp, то его инкапсулирование в полимер молочной кислоты (PLLA) предполагало, что препарат будет поступать в клетки через фагоцитоз и в этом случае рифампицин не будет взаимодействовать с P-gp. Полученные результаты демонстрируют, что PLLA активирует фагоцитоз, что может приводить к интернализации P-gp с плазматической мембраны и снижению его функциональной активности. При этом встаёт вопрос о судьбе высвободившегося в фаголизосомах из полимера рифампицина, который способен диффундировать в цитоплазму и связываться с P-gp. Эти данные не только подтверждают эффективность создания инкапсулированных противотуберкулёзных препаратов, но и ставят вопрос о «судьбе» высвободившегося из полимера рифампицина. По сравнению с рифампицином, бедаквилин проявляет гораздо более слабую субстратную специфичность к P-gp. Слабая субстратная специфичность бедаквилина к P-gp может быть одним из факторов его эффективности при лечении лекарственно-устойчивых форм туберкулёза.
2. Было обнаружено, что рифампицин в терапевтической концентрации увеличивает уровень экспрессии гена MDR1 белка P-gp в процессе макрофагальной дифференцировки, При этом терапевтическая концентрация рифампицина не влияет на уровень функциональной активности P-gp. Эти данные свидетельствуют, что рифампицин является не только субстратом для P-gp, но и индуцирует экспрессию его гена. Бедаквилин в терапевтической концентрации значимо снижает уровень экспрессии гена MDR1, но только на ранних этапах дифференцировки макрофагов. Эффект бедаквилина на экспрессию гена MDR1 может быть одним из факторов его эффективности при лечении лекарственно-устойчивых форм туберкулёза.
3. Исследование влияния противотуберкулезных препаратов на экспрессию генов и секрецию провоспалительных цитокинов показало, что под воздействием рифампицина наблюдается снижение экспрессии таких провоспалительных генов как IL1b, TNF-a и IL6, а также секреции цитокина IL1b, что свидетельствует о противовоспалительных свойствах рифампицина. При этом фармакологическое ингибирование P-gp R-верапамилом приводит к отмене эффектов рифампицина, которые связаны со снижением уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов. При ингибировании P-gp снижается уровень секреции IL1b во всех вариантах фармакологического воздействия, что предполагает участие P-gp в транспорте IL1b. Обнаруженные эффекты свидетельствует о важной роли P-gp как транспортёра и как регулятора воспаления. Полученные результаты свидетельствуют о функциональной значимости P-gp для реализации как провоспалительного фенотипа макрофагов, так и фармакологических эффектов антибактериальных препаратов. В связи с тем, что обсуждается вопрос о фармакологическом ингибировании P-gp в целях повышения эффективности противотуберкулёзной химиотерапии полученные данные свидетельствуют, что этот вопрос требует дальнейшей проработки.
4. Действие бедаквилина на экспрессию генов провоспалительных цитокинов зависит от стадии макрофагальной дифференцировки: ингибирующий эффект бедаквилина проявляется только на её ранней стадии и ставит вопрос о влиянии бедаквилина на формирование провоспалительного фенотипа макрофагов. При этом секреция IL10 возрастает при действии бедаквилина. В отличие от рифампицина бедаквилин индуцирует экспрессию генов рецепторов фагоцитоза CD64 и CD209, а также повышает активность рецепторного фагоцитоза как через Fc-рецепторы, так и через лектиновые рецепторы. Влияние бедаквилина на эффективность фагоцитоза требует дальнейшего изучения, так как его стимулирующее действие на экспрессию рецепторов фагоцитоза свидетельствует о важном терапевтическом свойстве бедаквилина и имеет перспективы для использования в целях повышения эффективности лечения лекарственно-устойчивых форм туберкулёза.
5. Рифампицин и бедаквилин в терапевтических концентрациях, так же как и фармакологический ингибитор P-gp VER - как самостоятельно, так и при комбинации с RIF и BDQ - увеличивают экспрессию IL10, не оказывая влияния на уровень TGF-b. Так как IL10 является важным регулятором активности туберкулёзного воспаления, этот результат ставит вопрос о влиянии данного процесса на морфо-функциональные свойства инфицированных M. tuberculosis макрофагов.
6. Была сконструирована лентивирусная плазмида, содержащая shRNA против гена MDR1 под U6 промотором, а также e-GFP под цитомегалловирусным промотором для последующей конститутивной трансформации макрофагов лентивирусными частицами. С помощью лентивирусной трансформации вирусными частицами была получена клеточная линия, характеризующаяся значительным сниженным уровнем экспрессии гена MDR1, по сравнению с исходными клетками ТНР-1. Было показано, что лентивирусная трансформация не оказывает влияние на морфологию трансфецированных клеток, на их способность приобретать макрофагальный фенотип и является стабильной. Показано, что трансфецирование клеток плазмидой со шпилькой для нокдауна гена MDR1 не влияет на эффективность инфицирования этих клеток M. tuberculosis штамма H37Rv. Инфицирование провоспалительных макрофагов THP-1 штаммом H37RV М. tuberculosis усиливает их провоспалительный фенотип через 24 часа после инфицирования и незначительно снижает экспрессию гена MDR1. После завершения микробиологического и молекулярно-генетического анализа на инфицированных трансфецированных макрофагах ТНР-1 будет проведено сравнение и сопоставление полученных данных для формулирования вывода о влиянии функциональной активности P-gp на эффективность
действия терапевтических концентраций рифампицина и бедаквилина на внутриклеточные формы M. tuberculosis штамма H37Rv.
Представленные данные получены впервые, демонстрируют влияние основных противотуберкулёзных препаратов – рифампицина и бедаквилина на функциональные характеристики провоспалительных макрофагов, их провоспалительный фенотип и функциональную активность P-гликопротеина. |
