Комбинированные ингибиторы трансляции для изучения механизмов действия антибиотиков на молекулярном уровнеНИР

Combined inhibitors of translation for the study of the mechanisms of action of antibiotics at the molecular level

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 3 марта 2020 г.-31 декабря 2020 г. Комбинированные ингибиторы трансляции для изучения механизмов действия антибиотиков на молекулярном уровне
Результаты этапа: В результате выполнения проекта в 2020 г. • На основании доступных данных рентгеноструктурного анализа комплексов антибиотика хлорамфеникола и его аналогов, в том числе, полученных авторским колллективом, а также онкоцина 112 с бактериальными рибосомами, выполнено компьютерное моделирование трехмерной структуры комплексов конъюгатов хлорамфениколамина и фрагментов онкоцина, а также фрагментов онкоцина, модифицированных гидрофобными катионами, с рибосомным бактериальными рибосомаи. На основании моделирования осуществить выбор оптимальных линкеров и фрагментов онкоцина для присоединения заместителей. На стадии моделирования, наряду с опубликованными структурными данными комплексов бактериальных рибосом с исследуемыми лигандами, использованы данные РСА комплексов рибосом Thermus thermophilus с трифенилфосфониевыми аналогами хлорамфеникола, полученные авторами проекта в ходе выполнения проекта РФФИ 16-04-00709. • Осуществлен синтез амино- и карбокси-содержащих алкильных производных трифенилфосфина и берберина (длина алкильного радикала выбрана на основе компьютерного моделирования). • Осуществлен синтез пептидных производных трифенилфосфония, содержащих фрагменты бактеницина. В результате выполнения проекта ожидается получение антибактериальных соединений на основе хлорамфеникола, антимикробных пролин-богатых пептидов и гидрофобных катионов, которые могут связываться с бактериальными рибосомами в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля, блокируя при этом синтез бактериальных белков. Предлагаемые в данном проекте антибактериальные соединения позволят продвинуться в понимании механизмов антибактериального действия известного антибиотика хлорамфеникола, а также проверить роль отдельных участков пептидной цепи и аминокислотных остатков во взаимодействии онкоцинов с бактериальными рибосомами, определить сенсорные участки рРНК в области РТ и ПТЦ, получить новые данные о взаимодействии пептидной цепи и антибиотиков с элементами РТ. Полученные результаты приблизят нас как к пониманию процессов регуляции трансляции, так и к созданию антибактериальных препаратов нового поколения, способных действовать против устойчивых штаммов, при этом наличие в структуре соединений дополнительных фармакофоров может оказать положительное влияние на проникновение соединений в клетки и другие фармакокинетические параметры. • Синтезированы две серии аналоги хлорамфеникола, содержащих гидрофобные катионы -остатки берберина и тетрагидроберберина. • Определены константы связывания полученных производных хлорамфеникола с рибосомой методом конкурентного вытеснения флуоресцентно-меченных антибиотиков. • Показана способность полученных аналогов хлорамфеникола, содержащих бербериновый фрагмент, подавлять трансляцию в двойной репортерной системе pDualrep2. • - Определена эффективность ингибирования биосинтеза белка новыми соединениями в бесклеточной системе трансляции Fluc мРНК.
2 14 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Комбинированные ингибиторы трансляции для изучения механизмов действия антибиотиков на молекулярном уровне
Результаты этапа: В результате выполнения проекта ожидается получение антибактериальных соединений на основе хлорамфеникола, антимикробных пролин-богатых пептидов и гидрофобных катионов, которые могут связываться с бактериальными рибосомами в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля, блокируя при этом синтез бактериальных белков. Предлагаемые в данном проекте антибактериальные соединения позволят продвинуться в понимании механизмов антибактериального действия известного антибиотика хлорамфеникола, а также проверить роль отдельных участков пептидной цепи и аминокислотных остатков во взаимодействии онкоцинов с бактериальными рибосомами, определить сенсорные участки рРНК в области РТ и ПТЦ, получить новые данные о взаимодействии пептидной цепи и антибиотиков с элементами РТ. Полученные результаты приблизят нас как к пониманию процессов регуляции трансляции, так и к созданию антибактериальных препаратов нового поколения, способных действовать против устойчивых штаммов, при этом наличие в структуре соединений дополнительных фармакофоров может оказать положительное влияние на проникновение соединений в клетки и другие фармакокинетические параметры. Запланированные на 2021 год результаты получены. Все соединения, описанные в проекте оригинальны, сконструированы и синтезированы авторами в рамках данного проекта. Результаты биохимических исследований синтетических соединений получены впервые, во многом, с применением методов, разработанных или оптимизированных авторами проекта. Антибактериальные соединения, специфически взаимодействующие с пептидилтрансферазным центром (ПТЦ) и рибосомным туннелем, (РТ) созданы на основе антибиотика хлорамфеникола и N-концевых фрагментов антимикробных пептидов онкоцина и бактенецина, модифицированых производными гидрофобных катионов. В 2020 г. были сконструированы два типа конъюгатов: 1) аналоги хлорамфеникола, в структуре которых дихлорацетильный остаток заменен на гидрофобный катион - берберин, присоединеный к аминогруппе хлорамфениколамина через линкеры различной длины (Рис.1); 2) конъюгаты N-концевых фрагментов антимикробных пептидов бактенецина и онкоцина с трифенилфосфониевым катионом, в структурах которых варьирована длина линкера между пептидной частью молекулы и гидрофобным катионом (Рис. 2), а также осуществлен их синтез и начаты биохимические исследования. Рисунок 1. Химические структуры аналогов хлорамфеникола, содержащих бербериновые катионы, полученные и исследуемые в проекте. Рисунок 2. Химические структуры аналогов антимикробного пептида бактенецина, содержащих трифенилфосфониевые катионы В 2021 году бербериновые аналоги хлорамфеникола были получены в дополнительных количествах, достаточных для дальнейших исследований, аналоги были охарактеризованы хроматографическими, масс-спектрометрическими методами, а также методами ЯМР. Ранее (на первом этапе проекта) нами было показано, что бербериновые аналоги хлорамфеникола (Рис. 1) способны связываться с бактериальными рибосомами, подавлять процесс трансляции Fluc мРНК in vitro, а также проявлять антибиотическое действие в двойной репортерной системе pDualrep2 . На данном этапе проекта исследования были продолжены. Был исследован механизм подавления трансляции новыми ингибиторами с помощью анализа ингибирования биосинтеза белка по удлинению праймера (ту-принтинг) с применением мРНК Rst2, содержащей кодоны практически всех белковых аминокислотных остатков (Рис. 3). Оказалось, что разные аналоги ингибируют трансляцию по-разному, если для аналога, не содержащего линкер (n = 0), остановка трансляции регистрируется на инициаторном кодоне (соответствующем Met, на электрофореграмме показано зеленым кружком), то с появлением и увеличением длины линкера между фрагментами хлорамфениколамина и берберина в конъюгате, наблюдаются стоп-сигналы на последующих шагах трансляции. Наиболее четко это выражено соединений, содержащих линкеры из 6ти и 9ти метиленовых групп (n = 6, n = 9), для которых наблюдаются стоп-сигналы на 5-ом шаге трансляции в области кодона, соответствующего Ile (показано голубым кружком на электрофореграмме), подобно тому, как это наблюдается для хлорамфеникола. Это означает, что трансляция в присутствии бербериновых аналогов хлорамфеникола является контекст-специфичной, при этом происходят несколько шагов трансляции с образованием коротких пептидов. Рисунок 3. Результаты исследования механизма подавления трансляции бербериновыми аналогами хлорамфеникола с помощью анализа по удлинению праймера (ту-принтинг) с применением мРНК Rst2. Следующим этапом была проверка токсического действия полученных ингибиторов на различных бактериальных штаммах, в том числе штаммах, устойчивых к действию хлорамфеникола (Рис. 4a и 4b ). В опытах использовали штаммы, устойчивость которых к хлорамфениколу или эритромицину определяется мутациями в области связывания этих антибиотиков (Рис. 4a) , а также штаммы, содержащие ген cat (ген хлорамфениколацетилтрансферазы) и устойчивые к действию хлорамфеникола (Рис. 4b ). На ряде бактериальных штаммов бербериновые аналоги с «длинными» линкерами (n =6, n = 9) оказались более активны, чем хлорамфеникол. Дальнейшее определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) бербериновых аналогов хлорамфеникола в сравнении с хлорамфениколом и соответствующими алкильными аналогами берберина, подтвердило этот факт, причем было показано, что алкилбербериновый фрагмент вносит основной вклад в действие аналогов на устойчивые к хлорамфениколу штаммы. Рисунок 4a. Результаты исследования антибактериальной активности бербериновых аналогов хлорамфеникола на бактериальных штаммах, содержащих мутации в 23S РНК. Рисунок 4b. Результаты исследования антибактериальной активности бербериновых аналогов хлорамфеникола на бактериальном штамме, содержащем ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat). Токсичность бербериновых аналогов хлорамфеникола в отношении эукариотических клеток была определена с помощью МТТ-теста (Таблица). Были использованы линии клеток быстроделящихся (HEK293T и VA13) и опухолевых (MCF7 и A549). Оказалось, что аналоги хлорамфеникола, содержащие тетрагидробербериновый фрагмент (CAM-thBer, CAM-C6-thBer, CAM-C9-thBer), а также алкильные производные берберина (C6-Ber, C9-Ber) обладают некоторым токсическим эффектом, в то время как аналоги хлорамфеникола, содержащие бербериновый фрагмент (CAM-Ber, CAM-C6-Ber, CAM-C9-Ber) не токсичны в отношении эукариотических клеток. Это позволяет рассматривать первую группу, как потенциальные антипролиферативные агенты, в то время как вторую группу — в качестве потенциальных антимикробных средств. Таблица. Результаты определения токсичности бербериновых аналогов хлорамфеникола в отношении эукариотических клеток по МТТ-тесту. Приведены концентрации полуингибирования роста клеток (IG50, µM). Ранее нами была разработана схема синтеза и получен ряд аналогов бактенецина 1-10 (RRIRPRPPYL), содержащих остаток тирозина вместо остатка Arg9 и трифенилфосфониевый катион, присоединенный с помощью соответствующих линкеров к N-концевой аминогруппе, либо к С-концевому карбоксилу (Рис. 2). Остаток тирозина в положении 9 в структуре данного пептида соответствует остатку тирозина 6 в структуре онкоцина, важному для связывания антимикробного пептида с бактериальной рибосомой, и, таким образом, пептид RRIRPRPPYL является гибридным аналогом бактенецина 1-10 и онкоцина 1-7. Изучение связывания полученных трифенилфосфониевых аналогов антимикробного пептида бактенецина (Bac1-10R/Y), содержащих в структуре трифенилфосфониевый катион, с рибосомами E.сoli проведено с использованием разработанной нами методики, основанной на методе поляризации (анизотропии) флуоресценции, который позволяет оценивать константы связывания новых соединений по вытеснению этими соединениями флуоресцентно меченных лигандов из их комплексов с рибосомой. В качестве флуоресцентно меченного антибиотика использовали полученное нами ранее производное эритромицина, содержащее BODIPYFL-C5-группировку. Показано, что все соединения вытесняют производное эритромицина из комплексов с рибосомами E. coli (Рис. 5). Из полученных данных следует, что все соединения способны связываться с рибосомой в РТ, и при этом наличие трифенилфосфониевого катиона (присоединенного, как по N-, так и по С-концу пептида) способствует большей аффинности соединений к рибосомам по сравнению с исходным пептидом. Полученные результаты будут уточняться. В дальнейшем планируется получить и использовать в данном методе флуоресцентные производные антибактериальных пептидов и их фрагментов, на основе которых получены и трифенилфосфониевые производные. Это, возможно, позволит более точно определить константы связывания исследуемых соединений с рибосомой. Рисунок 5. Результаты исследования трифенилфосфониевых аналогов антимикробных пептидов методом анизотропии флуоресценции на их способность связываться с 70S рибосомами E. Coli: ONC – онкоцин 112 (H-VDKPPYLPRPRPPRrIYNr-NH2), ERY – эритромицин, Bac110R/Y – H-RRIRPRPPYL-OH, TPP-Cn-Вас110R/Y и Bac110R/Y-Cn-TPP — трифенилфосфониевые производные Bac110R/Y. На завершающем этапе проекта планируется продолжить исследование полученных и новых аналогов хлорамфеникола и антимикробных пептидов. Будет исследовано взаимодействие с бактериальными рибосомами трифенилфосфониевых аналогов антимикробных пептидов биохимическими методами, а также антибактериальное действие этих аналогов. Планируется завершить синтез ещё нескольких соединений — трифенилфосфониевых аналогов бактенецина, а также осуществить синтез комбинированных аналогов на основе онкоцина 112 и хлорамфениколамина (методом ТФС), и исследовать взаимодействие этих синтетических аналогов с бактериальными рибосомами и их ингибирующую активность. Планируется также исследование комплексов бактериальных рибосом с наиболее перспективными из изученных аналогов, а также моделирование этих комплексов методами молекулярного докинга и молекулярной динамики.
3 14 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Комбинированные ингибиторы трансляции для изучения механизмов действия антибиотиков на молекулярном уровне
Результаты этапа: В результате выполнения проекта полученs антибактериальныt соединениz на основе хлорамфеникола, антимикробных пролин-богатых пептидов и гидрофобных катионов, которые могут связываться с бактериальными рибосомами в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля, блокируя при этом синтез бактериальных белков. Полученные в данном проекте антибактериальные соединения позволят продвинуться в понимании механизмов антибактериального действия известного антибиотика хлорамфеникола, а также проверить роль отдельных участков пептидной цепи и аминокислотных остатков во взаимодействии онкоцинов с бактериальными рибосомами, определить сенсорные участки рРНК в области РТ и ПТЦ, получить новые данные о взаимодействии пептидной цепи и антибиотиков с элементами РТ. Полученные результаты приблизят нас как к пониманию процессов регуляции трансляции, так и к созданию антибактериальных препаратов нового поколения, способных действовать против устойчивых штаммов, при этом наличие в структуре соединений дополнительных фармакофоров может оказать положительное влияние на проникновение соединений в клетки и другие фармакокинетические параметры. Запланированные в проекте результаты получены. Все соединения, описанные в проекте оригинальны, сконструированы и синтезированы авторами в рамках данного проекта. Результаты биохимических исследований синтетических соединений получены впервые, во многом, с применением методов, разработанных или оптимизированных авторами проекта. Антибактериальные соединения, специфически взаимодействующие с пептидилтрансферазным центром (ПТЦ) и рибосомным туннелем, (РТ) созданы на основе антибиотика хлорамфеникола и N-концевых фрагментов антимикробных пептидов онкоцина и бактенецина, модифицированых производными гидрофобных катионов. В проекте были сконструированы два типа конъюгатов: 1) аналоги хлорамфеникола, в структуре которых дихлорацетильный остаток заменен на гидрофобный катион - берберин, присоединеный к аминогруппе хлорамфениколамина через линкеры различной длины; 2) конъюгаты N-концевых фрагментов антимикробных пептидов бактенецина и онкоцина с трифенилфосфониевым катионом, в структурах которых варьирована длина линкера между пептидной частью молекулы и гидрофобным катионом; осуществлен их синтез и проведнны биохимические исследования. Полученные бербериновые аналоги хлорамфеникола были охарактеризованы хроматографическими, масс-спектрометрическими методами, а также методами ЯМР. В результате исследования этих аналогов показано, что бербериновые аналоги хлорамфеникола способны связываться с бактериальными рибосомами, подавлять процесс трансляции Fluc мРНК in vitro, а также проявлять антибиотическое действие в двойной репортерной системе pDualrep2 . Был исследован механизм подавления трансляции новыми ингибиторами с помощью анализа ингибирования биосинтеза белка по удлинению праймера (ту-принтинг) с применением мРНК Rst2, содержащей кодоны практически всех белковых аминокислотных остатков, в результате которого оказалось, что разные аналоги ингибируют трансляцию по-разному. Если для аналога, не содержащего линкер (n = 0), остановка трансляции регистрируется на инициаторном кодоне (соответствующем Met), то с появлением и увеличением длины линкера между фрагментами хлорамфениколамина и берберина в конъюгате, наблюдаются стоп-сигналы на последующих шагах трансляции. Наиболее четко это выражено соединений, содержащих линкеры из 6ти и 9ти метиленовых групп (n = 6, n = 9), для которых наблюдаются стоп-сигналы на 5-ом шаге трансляции в области кодона, соответствующего Ile, подобно тому, как это наблюдается для хлорамфеникола. Это означает, что трансляция в присутствии бербериновых аналогов хлорамфеникола является контекст-специфичной, при этом происходят несколько шагов трансляции с образованием коротких пептидов. Следующим этапом была проверка токсического действия полученных ингибиторов на различных бактериальных штаммах, в том числе штаммах, устойчивых к действию хлорамфеникола. В опытах использовали штаммы, устойчивость которых к хлорамфениколу или эритромицину определяется мутациями в области связывания этих антибиотиков, а также штаммы, содержащие ген cat (ген хлорамфениколацетилтрансферазы) и устойчивые к действию хлорамфеникола. На ряде бактериальных штаммов бербериновые аналоги с «длинными» линкерами (n =6, n = 9) оказались более активны, чем хлорамфеникол. Дальнейшее определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) бербериновых аналогов хлорамфеникола в сравнении с хлорамфениколом и соответствующими алкильными аналогами берберина, подтвердило этот факт, причем было показано, что алкилбербериновый фрагмент вносит основной вклад в действие аналогов на устойчивые к хлорамфениколу штаммы. Токсичность бербериновых аналогов хлорамфеникола в отношении эукариотических клеток была определена с помощью МТТ-теста (Таблица). Были использованы линии клеток быстроделящихся (HEK293T и VA13) и опухолевых (MCF7 и A549). Оказалось, что аналоги хлорамфеникола, содержащие тетрагидробербериновый фрагмент (CAM-thBer, CAM-C6-thBer, CAM-C9-thBer), а также алкильные производные берберина (C6-Ber, C9-Ber) обладают некоторым токсическим эффектом, в то время как аналоги хлорамфеникола, содержащие бербериновый фрагмент (CAM-Ber, CAM-C6-Ber, CAM-C9-Ber) не токсичны в отношении эукариотических клеток. Это позволяет рассматривать первую группу, как потенциальные антипролиферативные агенты, в то время как вторую группу — в качестве потенциальных антимикробных средств. Нами была разработана схема синтеза и получен ряд аналогов антимикробного пептида бактенецина 1-10 (RRIRPRPPYL), содержащих остаток тирозина вместо остатка Arg9 и трифенилфосфониевый катион, присоединенный с помощью соответствующих линкеров к N-концевой аминогруппе, либо к С-концевому карбоксилу. Остаток тирозина в положении 9 в структуре данного пептида соответствует остатку тирозина 6 в структуре онкоцина, важному для связывания антимикробного пептида с бактериальной рибосомой, и, таким образом, пептид RRIRPRPPYL является гибридным аналогом бактенецина 1-10 и онкоцина 1-7. Изучение связывания полученных трифенилфосфониевых аналогов антимикробного пептида бактенецина (Bac1-10R/Y), содержащих в структуре трифенилфосфониевый катион, с рибосомами E.сoli проведено с использованием разработанной нами методики, основанной на методе поляризации (анизотропии) флуоресценции, который позволяет оценивать константы связывания новых соединений по вытеснению этими соединениями флуоресцентно меченных лигандов из их комплексов с рибосомой. В качестве флуоресцентно меченных лиганлов использовали полученное нами ранее производное эритромицина, содержащее BODIPYFL-C5-группировку, а также флуоресцентные производные Вас(1-10). Показано, что все соединения вытесняют флуоресцентные лиганды из комплексов с рибосомами E. coli. Из полученных данных следует, что все соединения способны связываться с рибосомой в РТ, и при этом наличие трифенилфосфониевого катиона (присоединенного, как по N-, так и по С-концу пептида) способствует большей аффинности соединений к рибосомам по сравнению с исходным пептидом. На завершающем этапе проекта исследовано антибактериальное действие бербериновых аналогов хлорамфеникола и антимикробных пептидов с применением различных бактериальных штаммов. Оказалось, что бербериновые аналоги хлорамфеникола более избирательно действуют на грам-положительные бактерии, чем хлорамфеникол и берберин. Трифенилфосфониевые аналоги бактенецина 1-10, оказались способны действовать на микобактерии и некоторые другие бактериальные штаммы. Для объяснения полученных биохимических и микробиологических данных, а также определения структурно-фунцциональных взаимодействий, проведено моделирование комплексов бактериальных рибосом с наиболее перспективными из изученных аналогов методами молекулярного докинга. Бербериновые аналоги хлорамфеникола были изучены также методом РСА, для чего эти аналоги были переданы в лабораторию Ю.С.Поликанова (Университет Иллинойса, Чикаго, США).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".