ИСТИНА

В проекте планируется изучить нековалентные взаимодействия низкомолекулярных органических соединений с карбоцианиновыми красителями, излучающими в ближней ИК-области спектра, и на этой основе разработать способы визуализации таких аналитов. Подобные подходы в химическом анализе не использовали, хотя известен аналог – метод флуоресцентных зондов, позволяющий изучать полярность и вязкость в мицеллах поверхностно-активных веществ, измерять дипольный потенциал мембран и т. п. Наши предварительные исследования показали, что взаимодействие низкомолекулярных аналитов с карбоцианинами может происходить опосредованно, вероятно, за счет влияния аналита на дипольный потенциал мицелл ПАВ или на степень их гидратации (такой механизм разгорания флуоресценции не сводится к концентрированию веществ в мицеллах). Эти предположения будут проверены экспериментально с применением комплекса физико-химических методов. В качестве модельных аналитов будут использованы простые монофункциональные соединения и лекарственные вещества разных классов (цефалоспорины, пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины, фторхинолоны, сульфаниламиды и др.), всего 30-50 соединений. Будут проведены скрининговые исследования, позволяющие систематически изучить влияние ряда факторов на эмиссию флуорофоров, а также выбрать наиболее практически интересные системы. Для изучения в качестве флуорофоров будут получены новые карбоцианины на основе индоленина и хинолина, излучающие в видимой и ближней ИК-областях спектра, причем структуры следующих поколений будут предложены на основании результатов изучения предыдущих. Для повышения селективности определения потребуется ограничить круг соединений, взаимодействующих с флуорофором, для чего будет применен новый прием – заключение красителя в наноструктуры (смешанные мицеллы ПАВ с полиэлектролитами, в том числе ковалентно сшитыми, и полиэлектролитные капсулы). Это позволит сузить круг аналитов, дающих аналитический сигнал, и избежать мешающего влияния компонентов матрицы объекта. Кроме того, предполагается использовать селективное образование комплексов аналитов с полиэлектролитами. С помощью полученных наноструктур будут визуализированы физиологически активные аналиты в клетках и тканях. Выполнение проекта позволит расширить круг низкомолекулярных органических веществ, определяемых и визуализируемых флуориметрическим методом.

The project is aimed at studying the non-covalent interactions of low-molecular-weight organic compounds with carbocyanine dyes emitting in the near-infrared region of the spectrum, and developing methods of imaging for these analytes. Such strategies have not been used in chemical analysis, although there is an analogue, the so called fluorescent probe technique, which makes it possible to study the polarity and viscosity in surfactant micelles, measure the dipole potential of membranes, etc. Our preliminary studies have shown that the interaction of small molecules with carbocyanine dyes can occur indirectly, by the mechanism of the analyte influence on the dipole potential of surfactant micelles or on the hydration degree of the micelles. These assumptions will be verified experimentally using a complex of physicochemical methods. Simple monofunctional compounds and drugs of different classes (cephalosporins, penicillins, aminoglycosides, tetracyclines, fluoroquinolones, sulfanilamides, etc.) will be used as model analytes, a total of 30-50 compounds. Screening studies will be conducted to systematically study the influence of a number of factors on the emission of fluorophores, as well as to select the most practically interesting systems. New indolenin and quinoline-based carbocyanine dyes emitting in the visible and near-IR spectral regions will be obtained, and the structures of the next generations of these fluorophores will be suggested based on the results of the studies of the previous ones. To increase the selectivity of the determination, it will be necessary to limit the range of compounds interacting with the fluorophore. With this purpose, a novel technique will be applied involving the inclusion of the dye in nanostructures (polyelectrolyte-surfactant mixed micelles, including the covalently crosslinked ones, and polyelectrolyte capsules). This will restrict the number of analytes giving an analytical signal and decrease the interferences of the matrix components. In addition, it is proposed to use the selective formation of complexes of analytes with polyelectrolytes. Using the obtained nanostructures, the physiologically active analytes in cells and tissues will be visualized. Implementation of the project will expand the range of small organic molecules whose determination and imaging by the fluorimetric techniques is feasible.

Ожидается, что будет выявлена роль заряда наноструктуры, природы флуоресцентного реагента, зарядового состояния аналита и степени его гидрофобности в изменении спектра флуоресценции карбоцианиновых красителей. Будут проверены гипотезы о механизмах влияния аналита на спектр эмиссии карбоцианинов (опосредованное взаимодействие через влияние на дипольный потенциал наноструктуры или через степень ее гидратации, а также непосредственное специфическое взаимодействие). На основе выявленных закономерностей будет выработан общий подход к получению сигнала от низкомолекулярных аналитов разной природы с использованием различных гидрофобных флуорофоров. Появится возможность подобрать подходящий флуорофор и условия получения аналитического сигнала для низкомолекулярных органических соединений, не определявшихся ранее флуориметрическим методом и не взаимодействующих непосредственно с флуорофорами (то есть не являющихся тушителями и не участвующими в процессах переноса энергии и электронов), но имеющих ионизирующиеся группы. Мы ожидаем (и это подтверждают предварительные результаты), что будут разработаны методики селективного определения или визуализации отдельных аналитов. Кроме того, предполагается, что селективность определения будет повышена путем частичной изоляции флуорофора слоем полиэлектролита. Возможно, будут найдены условия определения групп аналитов одной природы. Ожидается, что аналитическим сигналом во многих системах будет повышение интенсивности эмиссии, а не тушение, что благоприятно для использования в визуализации аналитов. Возможности предлагаемого подхода будут продемонстрированы на примерах визуализации физиологически активных веществ в биообъектах (клетках и тканях).

Предварительно исследовали в качестве флуорофоров следующие карбоцианины (схема 3). Эмиссия этих флуорофоров сильно тушится водой, поэтому флуорофоры включали в мицеллы ПАВ. Приведенные соединения изучили по отношению к 28 лекарственным веществам. Выявлено, что аналиты вызывают, в основном, разгорание, а не тушение флуоресценции, в том числе в длинноволновой области (680-750 нм). В мицеллах катионного ПАВ типично проявление эффектов аналитами, существующими в условиях опытов (pH 7,4) в виде анионов (пенициллина, цефалоспоринов). В присутствии анионного ПАВ, наоборот, характерны эффекты катионных аналитов (аминогликозиды). Вероятно, за возникновение сигнала отвечает не непосредственное взаимодействие аналит – флуорофор, а действие аналита на заряд или дипольный потенциал мицеллы или степени ее гидратации. Скрининг также выявил, что в мицеллярных растворах ПАВ некоторые группы аналитов дают селективный сигнал. Например, в растворе ЦТАБ эмиссия карбоцианина 1b при 680 нм усиливается в присутствии цефтазидима и цефазолина; не влияют на сигнал 26 других лекарственных веществ. Существенно, что с разными флуорофорами наблюдали сигналы разных модельных аналитов. Предварительный вывод заключается в том, что карбоцианиновые красители могут быть пригодны для визуализации низкомолекулярных соединений в водных средах. Ранее мы обнаружили, что некоторые низкомолекулярные соединения довольно селективно образуют молекулярные комплексы с некоторыми синтетическими полиэлектролитами, например, цефтриаксон – с неразветвленным полиэтиленимином, а диклофенак – с хитозаном. Это явление положили в основу способа селективного определения цефтриаксона флуориметрическим методом в водном растворе без использования разделения.

Обнаружено селективное повышение интенсивности флуоресценции в ближней ИК-области спектра для водных растворов, содержащих краситель, аналит и ПАВ, где краситель – один из синтезированных нами новых гидрофобных карбоцианинов, аналит – водорастворимое ионизующееся соединение массой 300–700 Да, а ПАВ заряжен противоположно аналиту. Выявлено три механизма повышения интенсивности флуоресценции. Первый реализуется для аналитов, образующих большое количество ионных и/или водородных связей; в нем краситель вводится в виде нефлуоресцирующих наночастиц, а ПАВ – в субмицеллярной концентрации, не солюбилизирующей краситель. В присутствии аналита образуются тройные агрегаты краситель – аналит – ПАВ размерами порядка 100 нм, в которых краситель, по-видимому, входит в гидрофобные домены, образованные углеводородными цепочками ПАВ, где и начинает флуоресцировать. Селективность сигнала определяется соответствием зарядов аналита и ПАВ, возможностью образования многоцентровых ионных и/или водородных связей между крупным аналитом и ионами ПАВ, а также природой ПАВ и карбоцианина (флуорофор должен быть достаточно гидрофобным и иметь сродство к используемому ПАВ). Новизна результатов заключается в выявлении эффекта солюбилизации наночастиц красителя в ионных агрегатах аналит–ПАВ (именно этот процесс отвечает за резкое увеличение эмиссии). Показана возможность прямого определения неомицина в моче человека в диапазоне 0.05 – 2 мМ с пределом обнаружения 40 мкМ, sr = 0.09, при использовании флуориметрического планшета и ИК-визуализатора. Второй тип механизма основан на образовании мицеллоподобных наночастиц крупных гидрофобных аналитов в водных растворах, которые солюбилизируют гидрофобный флуорофор, в результате чего значительно повышается интенсивность флуоресценции в ближней ИК-области. В третьем механизме реализуются специфические взаимодействия карбоцианиновых флуорофоров с некоторыми аналитами (метамизолом и гентамицином) в мицеллярном растворе ПАВ, вероятно, вызывающие искажение полиметиновой цепи флуорофора. Вследствие таких конформационных изменений практически полностью тушится БИК-флуоресценция и существенно повышается интенсивность флуоресценции в видимом диапазоне. Этот метод позволяет обнаружить метамизол в водном растворе в диапазоне 0.5 мкМ – 0.5 мM с пределом обнаружения 0.1 мкМ. Общность предложенных представлений о возникновении флуоресценции подтверждается тем, что природный гидрофобный флуорофор хлорофилл также может встраиваться в агрегаты катионных аналитов с анионными ПАВ и анионных аналитов – с катионными ПАВ. Химически не модифицированный хлорофилл а впервые применили в качестве флуориметрического реагента: определили неомицин в моче (диапазон определяемых содержаний: 30 мкМ – 0,9 мМ, предел обнаружения – 6 мкМ). Из-за невысокой устойчивости агрегатов наиболее целесообразной областью применения обнаруженных эффектов разгорания флуоресценции может стать визуализация доставки лекарственных веществ. Таковая хорошо разработана для гидрофобных, но не для гидрофильных соединений. В качестве модельных лекарственных веществ использовали цефтриаксон и короткий пептид – глутатион, а в качестве противоионов – ЦТАБ или полимер-олигомер полигексаметиленгуанидин (ПГМГ). Для переноса через клеточные мембраны тройные агрегаты инкапсулировали в полиэлектролитные контейнеры, которые сшивали методом ковалентной или ионной сшивки и изучали проникновение в клетки аденокарциномы молочной железы человека. Поглощение контейнеров клетками в конфокальном микроскопе наблюдали для контейнеров карбоксиметилированного или малеинированного хитозана; немодифицированный хитозан, а также альгинат в качестве внешнего слоя контейнеров не приводили к интернализации красителя. В ряде случаев удалось показать, что флуоресценция, проявляемая клетками, вызывается целыми контейнерами, а не их отдельными компонентами, то есть лекарственное вещество доставляется в клетки в виде инкапсулированного тройного агрегата. В качестве красителя в составе контейнеров, кроме карбоцианинов, впервые использовали хлорофилл а. Показали, что контейнеры хитозан – лекарственное вещество – противоион – краситель устойчивы при хранении в суспензии не менее недели, а при диализе распадаются за время порядка часов, что позволяет рассчитывать на их разрушение в среде организма. Таким образом, предложен подход к мониторингу доставки крупных гидрофильных соединений в эукариотические клетки. В перспективе это позволит наблюдать разложение контейнеров in vivo с высвобождением соединения в реальном времени.