ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Изменение коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы от NADPH к NADH позволит значительно упростить и удешевить проведение процессов с её использованием не только за счет меньшей стоимости NADH, но и за счет большей распространённости систем регенерации NADH, по сравнению с NADPH. В рамках данной работы предлагается провести детальное изучение структуры центра связывания NADPH PAMO, выявить аминокислотные остатки, участвующие в связывании фосфатной группы кофермента и выбрать мутации, которые могут привести к изменению коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы от NADPH к NADH
Due to the high cost of nicotinamide cofactors, the coenzyme specificity of the enzyme makes a great contribution to the cost of the process. The high cost and low stability of NADPH, in comparison with NADH, causes great interest in the work on changing the coenzyme specificity of NADPH-dependent oxidoreductases. One of the practically important enzymes is phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca (PAMO), which is NADPH-dependent Bayer-Villiger monooxygenase and catalyzes the conversion of aromatic ketones to esters. The products resulting from these reactions may find application as precursors in the synthesis of medicinal compounds or flavorings for the perfume industry. Changing the coenzyme specificity of PAMO from NADPH to NADH will significantly reduce the cost and simplify processes with PAMO not only due to the lower cost of NADH, but also due to the greater prevalence of NADH regeneration systems compared to NADPH. Attempts to change the coenzyme specific specific PAMO and structurally similar monooxyganes of this family are known from literature [Biotechnology Advances 36 (2018) 247–263]. In the framework of this work, it is proposed to conduct a detailed study of the structure of the NADPH PAMO binding center, identify amino acid residues involved in the binding of the phosphate group of the coenzyme, and select mutations that can lead to a change in the coenzyme specificity of phenylacetone monooxygenase from NADPH to NADH. Genetic constructs encoding enzyme variants with mutations will be created and their effectiveness in reactions with different cofactors will be studied. Based on the results obtained, conclusions about the structure-function relationships in the NADPH binding center will be drawn and enzymes with multipoint substitutions combining the most successful options will be obtained.
В результате выполнения работ по проекту будут получены варианты PAMO, с мутациями, затрагивающими центр связывания NADPH. Будут изучено влияние данных мутаций на свойства фермента в реакциях с NADPH и с NADH и сделаны выводы о взаимосвязи структура-функция в процессе связывания кофермента фенилацетонмонооксигеназой.
Научный задел руководителя проекта. Пометун А.А. занимается научной деятельностью в области генетической инженерии ферментов с 2004 г. За это время Пометун А.А. было осуществлено клонирование нескольких новых генов ферментов, а также получены ферменты с улучшенными свойствами методами белковой инженерии. В том числе были получены ферменты с улучшенной температурной стабильностью, измененной коферментной специфичностью, увеличенной каталитической активностью по сравнению с ферментами дикого типа. Пометун А.А. были проведены исследования по получению и изучению свойств гибридных молекул на основе формиатдегидрогеназы и монооксигеназы. Пометун А.А. владеет такими методами как биоинформатический анализ последовательностей генов, кодирующих ферменты, имеет навыки молекулярного моделирования, а также имеет практические навыки в генетической инженерии, молекулярной биологии и физической химии ферментов.
Основные результаты 1. Проведено моделирование центра связывания NADPH и выбраны наиболее перспективные аминокислотные остатки – T218, K336 2. Проведено моделирование аминокислотных замен выбранных остатков и выбраны наиболее перспективные аминокислотные замены – T218D, T218E, K336A, K336R 3. Получены генетические конструкции с геном PAMO, содержащим выбранные мутации 4. Проведены экспрессия и очистка мутантных форм PAMO. Ферменты получены в практически гомогенном виде 5. Показано, что полученные мутантные варианты PAMO способны связывать NADH, но не обладают монооксигеназной активностью в реакции с NADH
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 октября 2020 г.-1 октября 2021 г. | Инженерия коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы |
Результаты этапа: | ||
2 | 2 октября 2021 г.-1 октября 2022 г. | Инженерия коферментной специфичности фенилацетонмонооксигеназы |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".