|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системахНИР
Modeling structures and properties of biomolecules for live cell multicolor imaging
- Руководитель НИР: Григоренко Б.Л.
- Ответственный исполнитель: Хренова М.Г.
- Участники НИР: Домрачева Т.М., Захарова Т.М., Капуста Д.П., Кулакова А.М., Метелешко Ю.И., Миронов В.А., Мулашкин Ф.Д., Поляков И.В.
- Подразделение: НИЛ квантовой химии и молекулярного моделирования
- Срок исполнения: 1 января 2020 г. - 31 декабря 2021 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 17-13-01051-П
- Номер ЦИТИС: АААА-А17-117042810118-0
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Стратегические информационные технологии
- Критическая технология России: Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.15.03 Теория строения молекул и химической связи
- 31.15.15 Исследования строения и свойств молекул и химической связи
- 34.17.09 Фотофизические и фотохимические процессы в биологии
- Классификатор OECD: Мультидисциплинарные науки
-
Ключевые слова:
флуоресцентные биомолекулы, квантовая химия, квантовая механика – молекулярная механика, фитохромы, органические хромофоры, оптические спектры, флавин-содержащие белки, молекулярное моделирование, производные зеленого флуоресцентного белка, возбужденные электронные состояния
phytochromes, quantum chemistry, organic chromophores, excited electronic states, derivatives of green fluorescent protein, flavin-containing proteins, quantum mechanics - molecular mechanics, fluorescent biomolecules, optical spectra -
Описание:
Проект направлен на определение оптимальных параметров и прогнозирование новых вариантов биомолекул и их наборов – перспективных маркеров для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах по результатам компьютерного моделирования на основе квантовой теории. В настоящее время нарастают потребности в разработках таких меток, которые позволяют проследить несколько разных, но взаимосвязанных событий в живой системе, проводя мониторинг оптических спектров от разных флуорофоров, присоединенных к соответствующим мишеням. В качестве полезных биомолекул для многоцветной визуализации рассматриваются варианты на основе зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein, GFP) или GFP-подобные белки, флавин-содержащие белки и новые варианты маркеров на основе фитохромов с наиболее длинноволновыми полосами в оптических спектрах. За переходы между электронными состояниями в этих трех классах природных биомолекул отвечают различные органические хромофоры с сопряженной системой π-электронных связей, находящиеся внутри белковых матриц. Настройка свойств маркеров для достижения заданных параметров (в частности, положений и интенсивностей полос в спектрах поглощения и испускания, квантового выхода, фотостабильности) экспериментально осуществляется модификацией окружения хромофора за счет точечных мутаций в белковых матрицах, а также модификацией хромофора. Именно в этой части большой исследовательской области, направленной на создание новых флуоресцентных меток на основе природных биомолекул для многоцветной визуализации в живых системах, компьютерное моделирование содействует экспериментальным исследованиям. Результаты расчетов структуры и оптических спектров для вариантов перечисленных природных систем (GFP-подобных, флавин-содержащих, фитохромов), выполненные в рамках единообразной методики на основе квантовой теории строения молекул, позволят определить пути рационального дизайна биомолекул с заданными свойствами. Основным инструментом моделирования предполагается метод квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) с отнесением к квантовой подсистеме хромофор-содержащей области и учетом остальной части белковой макромолекулы в рамках молекулярной механики. Предполагается активное использование оригинальной методики и компьютерных программ метода КМ/ММ в варианте конформационно-подвижных эффективных фрагментов. Расчеты структурных параметров в основном электронном состоянии будут проводиться с использованием квантово-химических методов теории функционала электронной плотности (DFT) для КМ-подсистемы и силовых полей AMBER, CHARMM для ММ-подсистемы. Оптимизация геометрических параметров в возбужденных электронных состояниях будет проводиться с использованием многоконфигурационных подходов (CASSCF, CIS) для квантовых подсистем. Расчеты электронных переходов между основным и возбужденными состояниями будут выполнены методами CASSCF с последующим учетом поправок в рамках многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущений (xMCQDPT2)
-
Abstract:
The project aims to determine the optimal parameters and predict novel variants of biomolecules and their sets - promising markers for multicolor fluorescence imaging in living systems based on the results of quantum based computer simulations. There is a current request for the development of such labels, which allow one to trace a number of different, but related events in a living system, monitoring the optical spectra of different fluorophores attached to the respective targets. The following biomolecules are considered as the most useful for multicolor imaging: variants of green fluorescent protein (GFP) or GFP-like proteins, flavin-containing proteins, and phytochromes, the new markers characterized by the longest wavelengths in the optical spectra. Transitions between electronic states in these three classes of natural biomolecules are due to various organic chromophores with a conjugated π-electron system inside the protein matrices. Tuning properties of these markers in order to achieve the desired parameters (in particular, the positions and intensities of the bands in the absorption and emission spectra, quantum yield, photostability) is performed experimentally by modifying the environment of the chromophore by point mutations in the protein matrix, as well as modification of the chromophore. Computer simulations facilitate experimental studies in this particular part of the large field of research aimed at creating new fluorescent labels based on natural biomolecules for multicolor imaging in living systems. The results of calculations of the structure and optical spectra for the listed natural systems (GFP-like, flavin-containing phytochrome) carried out at a uniform theoretical level based on the quantum theory of molecular structure, will highlight the ways of rational design of biomolecules with the desired properties. The main modeling tool will be the method of quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) with an assignment of the chromophore-containing region to the quantum subsystem and taking into account the rest of the protein molecule within the molecular mechanics. The active use of the original methodology and computer programs of the QM/MM method with the flexible effective fragments is planned. Calculations of structural parameters in the electronic ground state will be carried out with the use of density functional theory (DFT) quantum-chemical methods in the QM subsystems and force fields AMBER, CHARMM for MM subsystems. Optimization of geometry parameters in the excited electronic states will be performed with the multiconfigurational approaches (CASSCF, CIS) for quantum subsystems. Calculations of electronic transitions between ground and excited states will be performed with the CASSCF-based methods followed by corrections within the multiconfigurational quasi-degenerate perturbation theory (xMCQDPT2).
-
Планируемые результаты:
(1) Для фотопереключаемого GFP-подобного белка Dreiklang будет установлен механизм фотоиндуцированных химических реакций гидратации/дегидратации имидазольного кольца хромофора, предположительно ответственных за переходы между ON и OFF состояниями. На основании полученных результатов будут предложены способы управления процессом фотопреключения. (2) Будут построены полноатомные трехмерные модели новых фотопереключаемых белков rsLOV1 и rsLOV2 на основе известных первичных последовательностей аминокислотных остатков и шаблона нативного (wt) домена LOV. Будет исследован механизм химических реакций взаимодействия флавинового хромофора с аминокислотным остатком цистеина Cys62. (3) Будут предложены варианты белков Keima и eqFP670 с хромофорами, построенными по мотиву «трёхслойного сэндвича». На этих системах будут апробированы новые способы оценки S0-S1 переходов на основе анализа перераспределения электронной плотности при возбуждении.
-
Научный задел:
Основные достижения последних лет относятся к последовательному применению метода квантовой механики – молекулярной механики (КМ/ММ) для моделирования процессов в белках. Продолжается совершенствование и развитие предложенной ранее оригинальной методики КМ/ММ с конформационно-подвижными эффективными фрагментами; новые разработки изложены, в частности, в кандидатской диссертации Д.И.Морозова (руководитель Б.Л.Григоренко), успешно защищенной в 2012 г. С использованием компьютерных программ КМ/ММ, ориентированных на современные суперкомпьютеры, исследован большой круг вопросов по фотохимическим свойствам зеленого флуоресцентного белка. Помимо оригинальных публикаций эти результаты вошли в написанные с участием Б.Л.Григоренко два обзора: в 2012 г в авторитетном журнале Accounts of Chemical Research "Quantum chemistry behind bioimaging: Insights from ab initio studies of fluorescent proteins and their chromophores", Accounts of Chemical Research, 2012, 45(2):265–275; и в 2016 г в одном из наиболее важных химических журналов Chemical Reviews, "Photoinduced chemistry in fluorescent proteins: Curse or blessing?", Chemical Reviews, 2016, available online October 18 2016, DOI: 10.1021/acs.chemrev.6b00238. Другое направление применений методики КМ/ММ связано с моделированием реакций ферментативного катализа. Пример одной из последних публикаций: Grigorenko B.L., Knyazeva M.A., Nemukhin A.V. "Analysis of proton wires in the enzyme active site suggests a mechanism of c-di-GMP hydrolysis by the EAL domain phosphodiesterases", Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2016, 84, 670-1680, DOI: 10.1002/prot.25108.
-
Основные результаты:
Создание новых флуоресцентных меток на основе природных биомолекул для многоцветной визуализации в живых системах
- Добавил в систему: Григоренко Белла Людвиговна
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Моделирование строения и свойств биомолекул для многоцветной флуоресцентной визуализации в живых системах |
| Результаты этапа: (1) По результатам моделирования свойств фотоактивного GFP-подобного белка Dreiklang с использованием методов расчетов электронной структуры высокого уровня точности и методов молекулярной динамики установлены молекулярные детали фотоцикла и фотоактивации белка. Характеризованы возбужденные состояния флуоресцентной (ON) и темной (OFF) форм Dreiklang. Ключевым результатом исследования является обнаружение низколежащих возбужденных состояний формы ON с нейтральным хромофором, относящихся к состояниям с переносом заряда. Эти состояния являются практически изоэнергетическими с возбужденными состояниями, отвечающими светлым переходам. Заселение состояний с переносом заряда инициирует цепь реакций, которая приводит к образованию формы OFF с гидратированным хромофором. Результаты работы опубликованы в виде препринта в ChemRxiv 10.10.2020 [Sen, Tirthendu; Ma, Yingying; Polyakov, Igor; Grigorenko, Bella; Nemukhin, Alexander; Krylov, Anna I. (2020): Interplay Between Locally Excited and Charge Transfer States Governs the Photoswitching Mechanism in Fluorescent Protein Dreiklang. ChemRxiv. Preprint. https://doi.org/10.26434/chemrxiv.13077374.v1]. (2) В рамках подходов количественных связей структура – свойство (QSPR) предложена и апробирована модель для предсказания спектральной настройки GFP-подобных флуоресцентных белков голубых, зеленых, оранжевых и красных серий, в которых хромофоры образуют π-стэкинговые комплексы с аминокислотными остатками тирозина, фенилаланина и гистидина. Построены тренировочные наборы π-стэкинговых комплексов для четырех хромофоров с различными замещенными бензолами и имидазолами и проведены тесты с использованием вариации дипольного момента при возбуждении (DMV) как дескриптора при оценках вертикальных энергий возбуждения в подобных системах. По результатам расчетов показано, что использование дескриптора DMV, рассчитанного в приложении sa2-CASSCF(12/12)/cc-pvdz, позволяет предсказывать энергии возбуждения S0,min–S1 в π-стэкинговых комплексах с погрешностями не более 0,1 эВ. Таким образом, модель является практически полезной при разработках эффективных флуоресцентных маркеров для визуализации в живых системах. Результаты приведены в статье [Khrenova M.G., Mulashkin F.D., Bulavko E.S., Zakharova T.M., Nemukhin A.V., «Dipole Moment Variation Clears up Electronic Excitations in the π-Stacked Complexes of Fluorescent Protein Chromophores», принятой для публикации в журнале Journal of Chemical Information and Modeling (издательство American Chemical Society, Q1, IF= 4,549; https://doi.org/10.1021/acs.jcim.0c01028]. (3) Методами молекулярного моделирования построены модельные системы нативных флуоресцентных белков Keima и eqFP670 и белков с предложенными точечными заменами аминокислотных остатков так, чтобы хромофор был заключен в комплекс по мотивам «трёхслойного сэндвича» (triple-decker motif), и π-электронная система органического хромофора находилась в стэкинговом взаимодействии с параллельно расположенными ароматическими группами от окружающих с двух сторон хромофор аминокислотными остатками тирозина и аргинина. Методами КМ/ММ рассчитаны равновесные геометрические конфигурации всех модельных систем в основном электронном состоянии. Для вариантов Keima прямые квантово-химические расчеты методом XMCQDPT2/sa-CASSCF(16/12)/cc-pVDZ показывают значительный сдвиг в красную область спектра от 585 нм (экспериментальное значение 576 нм) до 682 нм. Для вариантов eqFP670 оценки по модели «количественных связей структура – свойство» (QSPR) с использованием вариации дипольного момента при возбуждении как дескриптора также показывают тенденцию к сдвигу полос в красную сторону. (4) Результаты моделирования методами квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) свойств зеленого флуоресцентного белка (GFP) - родоначальника биомаркеров для визуализации молекулярных процессов в живых системах, подведены в главе в коллективной монографии серии Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics издательства Springer. В главе всесторонне представлены результаты применения оригинального метода КМ/ММ с конформационно-подвижными эффективными фрагментами для моделирования свойств GFP – от реакции автокаталического формирования хромофора до тушения флуоресценции. Монография опубликована в октябре 2020 г. [Nemukhin A.V., Grigorenko B.L. «QM/MM Approaches Shed Light on GFP Puzzles», In Andruniów T., Olivucci M. (eds) QM/MM Studies of Light-responsive Biological Systems. Challenges and Advances in Computational Chemistry and Physics, V. 31, Pages 271-292 (2020); Издательство Springer, Cham; ISBN 978-3-030-57720-9]. https://doi.org/10.1007/978-3-030-57721-6_6]. (5) Методами молекулярного моделирования впервые построены полноатомные трехмерные модели новых обратимо переключаемых флавин-содержащих белков с LOV-доменами (Light, Oxygen, Voltage) rsLOV1 и rsLOV2, для которых известны первичные последовательности аминокислотных остатков, но не пространственные структуры. При построении моделей rsLOV1 и rsLOV2 за основу взята структура PDB ID: 2MWG фоторецепторного белка YtvA и выполнены необходимые точечные замены аминокислотных остатков. Построенные модели заключены в водные оболочки, для которых выполнены расчеты молекулярно-динамических траекторий и проведен динамический сетевой анализ. Показано, что динамические свойства нативной и мутантных систем различаются, прежде всего, в отношении Jα спирали, ответственной за передачу сигнала при фотовозбуждении. Результаты работы изложены в статье [Метелешко Ю.И., Хренова М.Г., Немухин А.В., «Компьютерное моделирование структур обратимо переключаемых флуоресцентных белков с LOV-доменами», принятой для публикации в журнале Кристаллография в 2021 г.]. (6) С использованием методов квантовой химии и квантовой механики/молекулярной механики исследованы свойства флуоресцентного белка IFP1.4 на основе бактериофитохрома DrBphP. Модельная система была построена для анализа различных состояний протонирования хромофора биливердина (BV) в белке, соответствующем красной (Pr) форме. Перемещения протонов с пиррольных колец BV на подходящий акцептор проводились в пределах системы. Показано, что депротонирование BV в основном состоянии требует затраты энергии порядка 5 ккал/моль или больше и сопровождается значительными сдвигами (~ 50-100 нм) в положении полос поглощения. Впервые определены положения точек S1/S0 конических пересечений минимальной энергии (MECI), что позволяет характеризовать пути дезактивации IFP1.4. Найденная точка конического пересечения, лежащая ниже положения минимума энергии на пологой поверхности возбужденного состояния S1 демонстрирует скручивание пиррольного кольца D, которое потенциально может приводить к изомеризации Pr → Pfr; однако этот процесс в IFP1.4 затруднен из-за стерических препятствий. | ||
| 2 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Коэффициенты трудового участия исполнителей НИР |
| Результаты этапа: (1) По результатам молекулярного моделирования структур и спектров возбуждения обратимо-переключаемого GFP–подобного флуоресцентного белка rsEGFP2 методами квантовой химии и КМ/ММ показано, что и флуоресцентное (ON), и неактивное (OFF) состояния белка rsEGFP2 характеризуются совокупностью структур с близкими энергиями в пределах 2-3 ккал/моль. Эти структуры различаются конформациями и состояниями протонирования хромофора, а также конформациями и состояниями протонирования аминокислотных остатков His149 и Glu223. Результаты моделирования объясняют наблюдаемую зависимость от pH спектров поглощения в ON-состоянии белка. Важным результатом работы является заключение, что за цис-транс превращение хромофора при ON-OFF фотопереключении может отвечать катионная форма хромофора, что необычно для флуоресцентных GFP-подобных белков. Выполненные оригинальные расчеты молекулярно-динамических траекторий с потенциалами КМ/ММ для участка OFF → ON показывают, что на пути от белка со скрученным транс-хромофором (OFF) к белку с плоским цис-хромофором (ON) происходят существенные конформационные изменения с аминокислотными остатками Glu223 и His149 в хромофор-содержащей области. (2) Доведены до публикации результаты моделирования структур новых обратимо-переключаемых флавин-содержащих белков rsLOV1 и rsLOV2, построенных по первичным последовательностям. (3) Завершены и доведены до публикации начатые на первом этапе проекта исследования флуоресцентного белка в ближней инфракрасной области IFP1.4, сконструированного из хромофор-содержащего домена бактериофитохрома. (4) Завершены и доведены до публикации начатые на первом этапе исследования фотопереключаемого флуоресцентного белка Dreiklang. (5) Развита практически полезная модель для спектральной настройки флуоресцентных белков семейства GFP, включающих красные белки eqFP670, Keima, mRoja. Модель основана на использовании физически обоснованной корреляции между энергией возбуждения флуоресцентного белка и величиной вариации дипольного момента перехода при возбуждении. Показано, что для адекватных расчетов величин вариации дипольного момента необходимо построить структуры белковых систем методами КМ/ММ и в полученных геометрических конфигурациях рассчитать электронные плотности в основном и возбужденном состояниях. Показано, что использование теории TDDFT с функционалами CAM-B3LYP, BHHLYP и M06-2X и базисными наборами cc-pvdz позволяет добиться хорошей корреляции – средне-квадратичная ошибка не превышает 0,01 эВ. 6) Опубликована обзорная статья (Invited Review) «Перспективы многомасштабного моделирования фоторецепторных белков» автортитетного международного коллектива с соавторством участника проекта, в которой, в частности, отражены результаты работ по данному проекту. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".