Паразитические ракообразные класса Thecostraca в сообществах коралловых рифов: биоразнообразие, жизненные циклы, родственные связи основных таксонов, паразито-хозяинные отношенияНИР

Parasitic Thecostraca in the coral reef communities: diversity, life history, relationships of major taxa, host-parasite relations

Соисполнители НИР

Biodiversity Research Center Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 19 января 2021 г.-1 декабря 2021 г. Паразитические ракообразные класса Thecostraca в сообществах коралловых рифов: биоразнообразие, жизненные циклы, родственные связи основных таксонов, паразито-хозяинные отношения
Результаты этапа: Прежде всего, сообщим, что на наши исследования в 2021 году сильно повлияла эпидемиологическая обстановка, сложившаяся в мире. Так, в течение всего 2021 года, Тайвань был закрыт для визитов иностранных граждан и российская сторона проекта не смогла попасть на остров и полноценно провести полевой сезон (мы осуществили полевые работы по сбору личиночных стадий Facetotecta на Белом и Баренцевом морях в апреле-июле). Мы рассматривали альтернативные варианты: совместные поездки во Вьетнам или Таиланд были невозможны из-за долгого карантина - 2 недели и частичного закрытия. К тому же выезд наших тайваньских партнёров за пределы острова практически невозможен в 2021 году. Специфика сборов предполагала содержание животных в культуре, заморозку для изотопного анализа, что возможно только в условиях работы на биологическом стационаре в Тайване. Освободившиеся деньги на полевые работы были частично потрачены на оборудование и отложены на авиабилеты, в случае если остров откроют до начала финансирования второго года проекта. К счастью, практически все полевые работы были проведены тайваньскими партнёрами. Работы проводились в двух локациях: в январе 2021, в акватории острова Xiaoliuqiu, расположенного в 13 км к юго-западу от Тайваня (22°19'23.0" - 22°19'39.9" с.ш., 120°21'54.7" - 120°22'13.3" в.д.), и в марте 2021, в акватории острова Green Island (Lyudao), расположенного в 30 км к востоку от Тайваня (22°38'33.0" - 22°40'49.9" с.ш., 121°29'10.7" - 121°30'01.5" в.д.). Пробы собирались с помощью водолазных погружений. Материал собран на 9 станциях (4 и 5 для каждого из островов соответственно). Собирались взрослые и личиночные стадии паразитических Ascothoracida, они некоторое время содержались в культуре, а затем фиксировались для молекулярно-генетического анализа, анализа на стабильные изотопы и исследований на электронных микроскопах. Часть работ выполнялась тайваньской стороной, часть материала была прислана нам и исследовалась здесь. В 2021 года нами были проведены исследования и получены следующие результаты: 1. Одним из основных исследований нашего коллектива в 2021 году было изучение биоразнообразия, морфологии и паразито-хозяинных отношений аскотрацид рода Petrarca, паразитирующих на склерактиниевых кораллах рода Turbinaria. Эти паразиты обитают в галлах, хорошо заметных на поверхности коралла (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 1-3), селясь по 2 (иногда 3) особи в каждом галле, и являются гермафродитами, что уникально для Ascothoracida. С помощью молекулярно-генетического анализа (маркёры COI, 12S, 18S, 28S), нами установлено, что в склерактиниевых кораллах рода Turbinaria (T. bifrons, T. mesenterina и T. frondens), обитающих в районе Тайваня, паразитируют 4 вида рода Petrarca. Это P. goanna Grygier, 1991, P. morula Grygier, 1985 и два новых вида Petrarca nasawai sp. nov и Petrarca rubus sp. nov. Причём виды P. goanna и Petrarca rubus sp. nov. образуют криптическую пару и практически не отличимы морфологически. Более того, ранее было высказано предположение, что виды P. goanna и P. morula могут представлять вариации одного вида (Grygier, Nojima 1995). Дело в том, что в своих исследованиях Грайгир, в основном, опирался на данные световой микроскопии, привлечения данных электронной микроскопии этим автором единичны и отрывочны. Немудрено, что изучая материал из различных мест Мирового Океана и придавая разные значения морфологическим признакам (строению антеннул, числу торакоподов, вооружению карапакса и ротовых конечностей), в одних случаях он описывал новые виды, а в других - разные вариации одного вида, создав, таким образом, определённую путаницу в таксономии Ascothoracida. С аналогичной ситуацией мы уже столкнулись при изучении рода Waginella (Kolbasov et al., 2021), когда экземпляры из разных, отдалённых мест Западной Пацифики и обладающие некоторыми морфологическими отличиями, были описаны как представители одного вида - Waginella axotremata. Замечательно, что привлечение молекулярно-генетического анализа «приземляет» полёт подобной таксономической фантазии, а использование электронной микроскопии (СЭМ), позволяет установить те признаки, которые мы можем использовать в таксономическом анализе для разграничения видов. Что мы и сделали. Остановимся на основных выводах. Прежде всего, нами установлено, что все виды рода Petrarca имеют 6 пар одноветвистых торакоподов, лишённых сегментации, первый торакопод всегда рудиментарный, щетинковидный. Ранее считалось, что у некоторых видов первый торакопод может отсутствовать, а число остальных торакоподов (2-6) может быть разным даже в пределах одного вида или особи (разное число торакоподов на правой и левой сторонах!). Установлено, что морфология пениса (размер, форма и вооружение дистальных выростов) не может являться чётким таксономическим признаком. Также морфология антеннул более или менее одинакова у всех представителей рода. Но есть нюансы - так ультраструктура эстетасков, расположенных на выростах антеннул (claw guard) различна у криптических видов P. goanna и Petrarca rubus (является отличительным признаком). Нами показано, что морфология карапакса (мантии) является одним из ключевых таксономических признаков Petrarca. Прежде всего, это форма дорсального края (наличие/отсутствие и размер выступов) и наличие/отсутствие мантийных зубчиков и папилл у вентрального края. Так, P. goanna и Petrarca rubus sp. nov. обладают выряженным фестончатым дорсальным краем карапакса с развитыми выростами (6-7), а у P. morula и Petrarca nasawai sp. nov эти выросты не развиты, но эти виды отличаются разной формой карапакса (округлой и овоидной соответственно). Представители Petrarca обитают в известковых галлах, образованных кораллом, и каким-то образом должны расширять свои камеры по мере роста. Это возможно двумя путями: механическим и химическим. Например, большинство видов сверлящих усоногих надотряда Acrothoracica, живущие в известковых субстратах, несут частые ктеноидные чешуйки на наружной поверхности мантийного мешка (карапакса), формирующие сверлящий аппарат (Колбасов, 2009). Ничего подобного мы не обнаружили на наружной поверхности аскоторацид рода Petrarca. Но на их наружной поверхности располагаются многочисленные папиллы и зубчики (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 2). На вершине каждого такого зубчика или папиллы располагается одиночная центральная микроскопическая пора. Через эти поры может выделяться вещество, растворяющее известковый субстрат хозяина. Неплохим признаком для таксономии рода нам видится морфология мандибул (вооружение). Количество зубчиков разное у видов: 14-15 - у P. morula и Petrarca nasawai sp. nov и 17-21 - у P. goanna и Petrarca rubus sp. nov. У P. morula и Petrarca nasawai sp. nov. эти зубчики простые, тогда как у других двух видов они могут быть с раздвоенной или тройной вершинами. Конечно, нами описана ещё масса ультраструктурных особенностей этих аскоторацид (поры на дистальном членике антеннул, ктеноидные чешуйки на торакоподах, лабруме и максиллах и т.д.), но мы не будем останавливаться на них, чтобы не перегружать отчёт и эксперта. Для изучения спектра питания Ascothoracida, паразитирующих на кораллах, нами использовался метод стабильных изотопов углерода и азота (δ13C и δ15N). Ткани хозяев - склерактиниевых кораллов обрабатывались морской водой ирригатором Waterpik, полученное вещество (пульпа) обрабатывалась раствором соляной кислоты (1N HCL) для удаления остатков CaCO3, потом оно было заморожено, лиофилизировано, гомогенизировано и использовано для изотопного анализа. Мягкие ткани Ascothoracida также препарировались и обрабатывались 1N HCL. Их ткани также были заморожены и лиофилизированы в лиофилизаторе Labconco Lyph-Lock 4.5, USA и затем измельчены в ступке пестиком. Эта часть работы проводилась непосредственно на Тайване, что и логично. Примерно 1 мг каждого из полученных биологических образцов подвергался анализу на стабильные изотопы углерода и азота (δ13C и δ15N) с помощью масс-спектрометра (Thermo Finnigan Delta Plus XL [Thermo Fisher Scientific Inc., USA]) в лаборатории SIFER (the Stable Isotope Ratio Facility for Environmental Research of the University of Utah, USA), куда мы посылали подготовленный биоматериал. Аналитическими стандартами были: VPDB (Vienna Pee Dee Belemnite) и AIR для δ13C и δ15N соответственно. Уровни δ13C и δ15N (в ‰) рассчитывались по формуле [(R проба/R стандарт) – 1] × 1000 (‰), где R – отношение обилия тяжёлого изотопа к лёгкому, т.е. R = 13C/12C или 15N/14N. Аналитическая точность (SD) была 0.2‰ для δ13C и δ15N. Также лиофилизированные образцы посылались в Россию для проведения аналогичных исследований (А.К. Залота) в ФГБУН Палеонтологическом институте им. А.А. Борисяка РАН (масс-спектрометр с индуктивной связанной плазмой высокого разрешения ICP-MS Element XR с приставкой лазерной абляции LA UP-213 от New Wave Research). Изотопный сдвиг между диетой (пищей) и потребителем оценивался исходя из сдвига, определённого у фильтраторов: δ13C как +0.5 ‰ и δ15N как +2.2 ‰ (McCutchan et al. 2003). Таким же способом нами было исследовано питание аскоторацид из рода Baccalaureus (4 вида), обитающих в гастральной полости зоантарий рода Palythoa (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 4). Для контроля нами также получены изотопные профили для зоопланктона, собранного в тоже время и в том же районе. Полученные нами данные позволяют сделать ряд интересных выводов о трофике аскоторацид, паразитирующих в кораллах, и, соответственно сделать выводы о паразито-хозяинных отношениях. При описании первого представителя рода Petrarca (Petrarca bathyactidis Fowler, 1889), Fowler G.H. (1889) указал, что Petrarca, возможно, не является настоящим паразитом, т.к. всасывает переваренную пищу хозяина: “Judged by the contents and appearance of the alimentary canal of Petrarca, it seems probable that its relation to its host is not a case of true parasitism, but it sucks in the nutritive fluid produced by the digestion and maceration of the food of Bathyactis, and does not derive sustenance directly from the tissues of the polyps”. С тех пор не было никаких данных о питании Petrarca. Увы, наши исследования показали, что представители рода Petrarca питаются непосредственно мягкими тканями коралла-хозяина, Turbinaria, целиком, т.е. не отделяя симбиотических зооксантелл и не потребляя собственно пищу хозяина из его гастроваскулярной системы. О таком способе питания аскоторацид рода Petrarca также неопровержимо свидетельствует морфология их ротовых конечностей - уникальная для Ascothoracida (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 3). Дело в том, что большинство аскоторацид обладают стилетовидными колющими и/или листовидными конечностями, тогда как у Petrarca ротовые конечности утолщённые, мандибулы имеют вид мощной гнатобазы с зубчатым режущим краем, режущий край максиллул также несёт развитые зубцы и бугорки, дистальный край максилл не гарпуновидный (как у остальных Ascothoracida), а несёт утолщённую складчатую кутикулу. Такая морфология ротовых конечностей Petrarca свидетельствует о том, что они используются для откусывания и перемалывания тканей хозяина. Таким образом, представители рода Petrarca являются закоренелыми паразитами, наносящими ощутимый вред своим хозяевам. В противоположность Petrarca, аскоторациды рода Baccalaureus более миролюбивы по отношению к своим хозяевам, которые не присутствуют в их рационе (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 4). Из наших данных следует, что сами зоантарии рода Polythoa, несмотря на их токсичность, скорее, являются фитофагами. Действительно, исследования их пищевой диеты свидетельствуют, что основным источником пищи для этих книдарий являются диатомовые водоросли, а не зоопланктон (de Santana et al., 2015). Кроме того, эти зоантарии содержат симбиотических динофлагеллят (зооксантеллы), которые, как и у мадрепоровых кораллов, являются дополнительным источником органического углерода. Тем не менее, в пище зоантарий попадаются представители зоопланктона (яйца беспозвоночных, ракообразные, фораминиферы, нематоды и т.д.) (Sebens, 1977, de Santana et al., 2015). Мы не уверены, что сам коралл активно усваивает их, но аскоторациды Baccalaureus определённо выедают их из пищевой массы в гастральной полости полипа. Причем если некоторые из особей Baccalaureus выедают типичных представителей зоопланктона, то другие, вероятно, съели более высших консументов - предположительно икру рыбы. Ротовые конечности Baccalaureus небольшие, мандибулы и максиллулы без вооружения, листовидные. Таким образом, эти паразиты питаются полупереваренными зоологическими объектами и не наносят значительного вреда хозяину, используя его только для защиты и как субстрат для обитания. По результатам этих исследований нами подготовлена рукопись по морфологии, таксономии и паразито-хозяинным отношениям аскоторацид рода Petrarca. Сейчас решаем: в какой журнал подавать? 2. Нами опубликована статья по изучению морфологии, родственных связей и взаимоотношений с хозяином экзопаразитов морских лилий – примитивных Ascothoracida рода Waginella (Kolbasov et al., 2021 - Frontiers in Marine Science, Q1, IF 3.828). Основные результаты этого исследования были получены в 2020-2021 гг, а быстрота публикации обусловлена тем, что журнал – платный (оплачена тайваньским партнёром). Впервые, с использованием электронной микроскопии (СЭМ), нами была детально исследована тонкая морфология всех видов (4) этого рода. Нами был описан новый вид из Тасманова моря – Waginella ebonita Kolbasov et Newman, 2021, обитающий на глубине 520 метров на морской лилии Metacrinus sp.( см. файл с дополнительной информацией, Рис. 5). Установлено, что все виды Waginella отличаются от своих родственников из других примитивных (генерализированных) родов Ascothoracida (Synagoga и Sessilogoga) по следующим признакам (синапоморфиям): i), ii) уплощённые вентральные края створок карапакса с парой больших передних пор; iii) карапакс покрыт многочисленными сенсиллами; iv) на вентральной стороне карапакса располагается специализированный прикрепительный аппарат, состоящий из батарей одноклеточных секреторных желёз, расположенных в районе прикрепления паразита и заканчивающихся наружной папиллой, и сенсилл и микровиллей, служащих для фиксации на морской лилии; одноклеточные железы секретируют крепящий цемент; v) четвёртый сегмент антеннул с простыми щетинками (не шипами); vi) проксимальный сенсорный вырост антеннул сближен с когтем; vii) обе пары передних решётчатых органов повёрнуты на 60-70° относительно дорсо-медиальной линии карапакса. Таким образом, род Waginella является монофилетическим таксоном даже по признакам ультраструктуры. Присутствие прикрепительного аппарата и его морфология указывают на то, что виды рода постоянно прикрепляются к хозяину, но при необходимости могут открепиться, либо растворив прикрепительный цемент, либо полиняв. Питание этих эктопаразитов происходит через округлое отверстие (10-20 мкм) в скелете морской лилии, которое они просверливают стилетовидными мандибулами, вооружёнными шипами. Примечательно, что новый вид Waginella ebonita был инфицирован криптонисцидными изоподами (Epicaridea). Крупная самка изоподы занимала всю выводковую камеру Waginella (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 5F) и, очевидно, что она питается эмбрионами хозяина (отсутствовали в выводковой камере). Сходные паразитические изоподы были обнаружены в выводковых камерах 4 особей W. sandersi (Newman, 1974, Grygier, 1983). Вообще, гиперпаразитические изоподы довольно часто обнаруживаются в различных Ascothoracida (Pyefinch, 1939, Newman, 1974, Grygier, 1981b, 1983b, c, 1984, 1985, 1990, Moyse, 1983, Kolbasov, Petrunina, 2018). Вероятно, что занимая всю выводковую камеру и питаясь эмбрионами, самки этих изопод вызывают паразитарную кастрацию. 3. Интересные результаты были получены нами при изучении метаморфоза усоногих-симбионтов склерактинивых кораллов (род Berndtia, н/отр. Acrothoracica и Darwiniella angularis, н/отр. Thoracica), обитающих в живой части колонии среди зооидов. Не секрет, что заселение новых и уникальных мест обитания, которыми для усоногих определённо являются живые кораллы, представляет основной промотор адаптивной эволюции. Наши исследования были направлены на выяснение вопроса о влиянии заселения сходных экологических ниш (кораллов) на независимую, но сходную адаптивную эволюцию основных фенотипических структур у личинок отдалённо родственных таксонов. Для этого мы исследовали отдалённо родственные таксоны усоногих-кораллобионтов, относящихся к разным надотрядам Cirripedia: (Acrothoracica: род Berndtia и Thoracica: семейство Pyrgomatidae, см. файл с дополнительной информацией, Рис. 6). Мы проанализировали функциональную морфологию (фенотипы) антеннул циприсовидных личинок этих таксонов (прежде всего, строение третьего сегмента на котором расположен орган прикрепления), так как именно антеннулы обеспечивают оседание личинки на субстрат перед дальнейшим метаморфозом. При выполнении этих исследований нами были разработаны и использованы оригинальные методики сбора и содержания в культуре этих симбиотических ракообразных. Живые кораллы Leptastrea purpurea и Psammocora profundacella, в которых обитали взрослые самки сверлящих ракообразных рода Berndtia (B. purpurea, B. utinomii) были собраны в ходе водолазных погружений на коралловых рифах у западного побережья Тайваня в 2020-2021 годах. Участки колоний размером около 3 см2 со взрослыми акроторациками содержались в лаборатории (Academia Sinica, Taipei) в литровых сосудах с фильтрованной и аэрируемой морской водой и искусственным освещением. Морская вода менялась ежедневно, при этом просматривалась на наличие науплиальных стадий, выметанных самками Berndtia. Когда происходил нерест, науплиальные личинки концентрировались в луче фонарика (положительный фототаксис) и отбирались пипеткой в стерильные и аэрируемые чашки Петри. Личиночный материал по балянусам-кораллобионтам Darwiniella angularis (Thoracica: Pyrgomatidae), обитающих в колониях Cyphastrea chalcidicum, был исследован ранее (см. Liu et al., 2016). Весь процесс культивирования личиночных стадий и метаморфоза поэтапно был заснят на видео. Науплиальные стадии Berndtia культивировались в чашках Петри, с ежедневной сменой воды, при 26°C, до тех пор, пока науплиальные стадии не линяли в циприсовидную личинку. Так как науплиальные стадии этих ракообразных лецитотрофные, то их не кормили. Нами осуществлялось наблюдение за поведением личинок во время плаванья, на видео и фото снимались их основные структуры (торакоподы, антеннулы и т.д.). Для этого использовались бинокуляры Olympus SZX7 и световой микроскоп Zeiss AX10 с дифференциальным контрастом. Для детального исследования личиночных структур, более 50 экземпляров всех науплиальных стадий и более 100 экземпляров циприсов были зафиксированы для световой и сканирующей электронной микроскопии (по стандартной методике: раствором глютаральдегида с последующей постфиксацией оксидом осмия, проводкой по серии спиртов и ацетона, сушкой по методу критической точки и напылением образцов золото-палладиевой смесью). Обработка фотографий осуществлялась в программах Corel PHOTOPAINT X8 и Corel DRAW X8. Видео редактировались в ACDSee Photo Studio. В прозрачных 10-литровых аэрируемых аквариумах мы провели эксперименты по оседанию циприсов Berndtia на хозяев. Для этого нами выпускались от 6 до 50 циприсов в разные аквариумы, в которых ежедневно менялась вода. Поведение циприсов проверялось под бинокуляром каждые 10-15 минут с 6.30 до 23.00 и снималось на камеру Lumix G8. Наблюдения осуществлялись в течение 32 дней. Для документирования метаморфоза, во время и после оседания видео снимались каждые 30 минут. Для сравнения функциональной биомеханики, мы дополнительно изучили поведение и строение антеннул у циприсовидных личинок 13 видов других Thecostraca (включая Ascothoracida и Facetotecta). Для того чтобы оценить эволюционные изменения в морфологии антеннул ракообразных класса Thecostraca, установить предковое состояние для каждого из морфо-вариантов и соотнести морфологию антеннул с субстратом обитания, на основе молекулярного анализа семи ядерных и митохондриальных маркёров, нами реконструировано филогенетическое дерево текострак, включающее представителей всех трёх подклассов: Facetotecta, Ascothoracida и Cirripedia (см. файл с дополнительной информацией, Рис.6). Всего нами проанализированы 99 видов текострак, для которых известны строение циприсовидных личинок и субстрат их обитания. Для основных клад полученного филогенетического дерева исследована морфология прикрепительного аппарата антеннул. В частности нам впервые удалось получить сиквенсы 12S rDNA, 16S rDNA, 18S rDNA, 28S rDNA, COI, H3 и RPII для 8 видов Facetotecta (некоторые не описаны) и 9 видов Ascothoracida. Личиночное развитие (6 науплиальных и циприсовидная стадия) протекает за 7 дней у Berndtia и 8-10 дней у Darwiniella. Мы не обнаружили различий в строении личиночных стадий у Berndtia, хотя это двуполые ракообразные с большой самкой и карликовым самцом. Нами установлено, что циприсовидные личинки усоногих-кораллобионтов обладают уникальными сходными копьевидными третьими сегментами антеннул (см. файл с дополнительной информацией, Рис.6), хотя эти таксоны не близкие родственники. Такая форма антеннул характерна исключительно для циприсов кораллобионтов и является личиночной адаптацией к симбиозу с кораллами, возникшей независимо в двух эволюционных линиях Cirripedia. Копьевидная форма антеннул позволяет усоногим-кораллобионтам проникать глубоко в ткани полипов при исследовании благоприятных мест и оседании циприсовидной личинки. Благодаря интенсивным видеосъёмкам, нами установлено, что при оседании на коралл циприсовидная личинка демонстрирует различное поведение. Прежде всего, это так называемое «пробное поведение», в нём мы выделяем: «широкий поиск» (wide searching), когда личинка ходит на антеннулах по большой площади поверхности коралла и 3-й и 4-й сегменты не ощупывают тщательно его поверхность, «точечный поиск» (close searching), когда личинка исследует определённое место коралла без погружения антеннул в мягкие ткани, но с частым использованием дистальных антеннулярных сегментов, и «инспектирование» (inspection), когда личинка периодически проникает своими копьевидными антеннулами в мягкие ткани коралла. Такое поведение начинается сразу при обнаружении коралла и повторяется многократно, пока личинка Berndtia не обнаруживает подходящее место для оседания, порой это происходит в течение нескольких дней (до 8 дней), тогда как у Darwiniella на это уходит всегда меньше 12 часов. Затем личинка с помощью антеннул в течение нескольких часов целиком погружается в мягкие ткани коралла, где и происходит метаморфоз в ювенильную стадию, которая прорывается наружу и начинает питаться только через 23 дня после оседания. В то время как у Darwiniella, осевшие циприсы видны на поверхности коралла в течение 3-4 дней, а ювениль начинает питаться уже через 10 дней. Примечательно, что цирисовидные личинки предковых форм обладали разной морфологией прикрепительного антеннулярного сегмента: «туфлевидной» (shoe-shaped) у Acrothoracica и колоколовидной (bell-shaped) у Pyrgomatidae. Таким образом, эта уникальная система (копьевидные антеннулы), ответственная за инвазионное поведение и прикрепление к живому кораллу, эволюционировала в течение миллионов лет в двух независимых кладах Cirripedia от разного предкового состояния. По полученным данным нами опубликована статья (Dreyer N., Tsai P-Ch., Olesen J., Kolbasov G.A., Høeg J.T., Chan B.K.K. 2021. Independent and adaptive evolution of phenotypic novelties driven by coral symbiosis in barnacle larvae. Evolution, https://doi.org/10.1111/evo.14380 - Q1, IF 3.983). 4. Нами впервые осуществлено комплексное исследование тонкой морфологии (СЭМ, см. файл с дополнительной информацией, Рис. 7, 8) циприсовидных личинок Facetotecta, собранных нами в 2018-2021 гг. из разных мест Мирового Океана (Азорские острова, Белое море, северо-восточная Камчатка, Курило-Камчатский Глубоководный Желоб, Тайвань) и представляющих несколько разных видов (как минимум, 7). Все циприсовидные личинки исследовались по стандартной методике на сканирующих микроскопах Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ (JEOL JSM-6380LA) и на ББС МГУ (Jeol JSM7000). Дело в том, что за время изучения этих ракообразных накоплено довольно большое количество морфологических данных по их Y-циприсам, которые свидетельствуют о большом таксономическом разнообразии этой группы. Так абдомен может состоять из 4 или 2 сегментов, антеннулы могут нести развитый загнутый крюк или быть без него, лабрум может быть развит, с различным вооружением или рудиментарен, сегментация торакоподов различна, морфология карапакса и скульптура тельсона различаются у разных видов и т.д. Эти факты свидетельствуют о том, что Facetotecta включают несколько родов и даже семейств, хотя, до сих пор все известные виды описывались как представители одного рода Hansenocaris. Хотя, две морфологических группы Y-циприсов, не имеющие таксономического значения, были выделены ранее (Kolbasov, Høeg 2003). Первая - ‘Hansenocaris pacifica group’ включает Y-циприсов с удлинённым карапаксом с округлым передним концом и крючьями на антеннулах. В эту группу входят все Y-цирисы из Атлантики, H. itoi из Белого моря, и H. pacifica, H. furcifera и H. papillata из Западной Пацифики. Остальные Y-циприсы обладают укороченным карапаксом с заострённым передним концом и антеннулами без крюков. Это виды H. rostrata, H. acutifrons и H. tentaculata из Японии. Поэтому одной из задач нашего исследования было на основе детального изучения морфологии определить точные границы рода Hansenocaris и провести формальный кладистический анализ известных видов и форм Facetotecta. Прежде всего, нам удалось определить общие и уникальные признаки для всех Y-циприсов, которые отделяют их от остальных циприсовидных личинок Thecostraca и необходимы для будущих исследований систематики и филогении Facetotecta. Такими признаками являются: i) одностворчатый карапакс в форме перевёрнутой лодки и покрывающий тело только с дорсальной стороны; ii) длинный тельсон с развитой скульптурой из кутикулярных гребней в виде табличек; iii) наличие только пяти тергитов торакса; iv) плевральные выросты двух последних торакомеров; v) уникальные четырёхсегментные антеннулы негомологичные четырёхсегментным антеннулам Cirripedia; vi) особые головные придатки – раздвоенный параокулярный вырост и постокулярный пучок филаментов и vii) шесть пар решётчатых органов. Следует особо отметить, что нами впервые описаны 6 пар решётчатых органов у Facetotecta. Ранее (Høeg, Kolbasov, 2002) у циприсовидных личинок фасетотект, как и для остальных Thecostraca, были описаны 5 пар решётчатых органов (2 передних и 3 задних). Нами впервые была обнаружена дополнительная пара решётчатых органов, располагающаяся сбоку и спереди от остальных передних пар. Эта дополнительная пара присутствует у всех исследованных нами Y-циприсов, но отсутствует у циприсовидных личинок других текострак: Ascothoracida и Cirripedia. Таким образом, 6 пар решётчатых органов – аутапоморфия Facetotecta. Пять пар решётчатых органов могут свидетельствовать об их сегментарной природе, т.к. именно 5 сегментов (изначально для всех Crustacea) состав головного отдела Ascothoracida и Cirripedia, покрытого сверху карапаксом. У Facetotecta первый торакальный сегмент сливается с головой (цефалоторакс) и карапакс покрывает 6, а не 5, сегментов. Этот факт может объяснять наличие 6 пар решётчатых органов у Facetotecta. У паразитических Tantulocarida, которые, по нашим данным, могут принадлежать к Thecostraca (см. Petrunina et al., 2014), свободноплавающие самцы обладают карапаксом, сходным по своему строению с карапаксом циприсовидной личинки Facetotecta (Petrunina, Kolbasov, 2012). Характерно, что их карапакс несёт 7 пар больших пор с пучком сенсилл внутри, которые, вероятно, гомологичны решётчатым органам, также являющимися модифицированными сенсиллами (Rybakov et al., 2003). Интересно, что самцы тантулокарид также обладают цефалотораксом, в который входят 2 торакальных сегмента (5+2). Это может объяснять наличие 7 больших пор с сенсиллами. Несмотря на большое число общих признаков, характерных для Y-циприсов Facetotecta, они различаются по ряду других: i) форма, размер и скульптура карапакса; ii) наличие или отсутствие антеннулярных крюков; iii) форма антеннулярного эстетаска; iv) степень развития лабрума; v) размер ветвей параокулярного выроста; vi) сегментация торакоподов; vii) сегментация, вооружение и орнаментация абдомена и viii) число и строение щетинок фуркальных ветвей. Впервые на основе морфологических признаков Y-циприсов нами был проведён кладистический анализ всех известных видов и форм фасетотект для определения границ рода Hansenocaris s.s. Очевидно, что оптимальным был бы комбинированный анализ филогении, основанный на молекулярных и морфологических данных. Но, к сожалению, молекулярные данные получены только для весьма ограниченного круга представителей Facetotecta, т.к. большинство изученного материала было зафиксировано формалином. Комбинированный анализ филогении будет возможен в будущем, когда будет накоплен значительный массив по молекулярным данным Facetotecta, чем мы и занимаемся. Для всех описанных видов Facetotecta и Y-циприсов, изученных на СЭМ, нами разработана матрица из 15 морфологических признаков (остальные признаки плохо задокументированы в предыдущих описаниях), исследованная в программе Nexus Data Editor 5.0. Восемь признаков были информативными для анализа парсимонии. Неинформативные признаки представляют собой синапоморфии фасетотект, которые очень важны для понимания их эволюции. Наши данные были проанализированы в программе PAUP 4.0 (Swofford, 1998). Нами реконструированы филогенетические деревья методами «bootstrap 50% majority-rule consensus» и «neighbor-joining». Топология этих деревьев указывает, что виды H. itoi, H. furcifera, H. pacifica, H. papillata и H. spiridonovi образуют монофилетическую кладу, которую можно считать эквивалентной роду Hansenocaris s.s. Таким образом, род Hansenocaris s.s. характеризуется: i) вытянутым карапаксом с округлым передним концом и развитыми кутикулярными гребнями, по крайней мере, в передней части; ii) развитым лабрумом с пятью длинными шипами; iii) антеннулы с крюком, который меньше или сравним по длине со вторым антеннулярным сегментом; iv) параокулярный вырост короче антеннул и с равными дистальными ветвями; v) абдомен четырёхсегментный; vi) тельсон с пильчатыми шипами вдоль заднего края. Другие виды: H. acutifrons, H. rostrata и H. tentaculata должны быть исключены из рода Hansenocaris s.s. Мы предполагаем, что каждый из этих видов представляет отдельный род. По проведённым исследованиям нами подготовлена и сдана в печать рукопись: Kolbasov G.A., Savchenko A.S., Dreyer N., Chan B.K.K., Høeg J.T. A synthesis of the external morphology of cypridiform larvae of Facetotecta (Crustacea: Thecostraca) and the limits of the genus Hansenocaris. Evolution (in press). 5. В 2021 году нами исследован оригинальный материал по Facetotecta, собранный из района Азорских островов. По этим исследованиям мы успели опубликовать статью (Kolbasov et al., 2021 - Arthropoda Selecta, Q3, IF 0.42). Циприсовидная стадия нового вида фасетотект Hansenocaris spiridonovi Kolbasov, Savchenko et Høeg sp. nov. была обнаружена в планктоне у Азорских островов (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 7D). Мы впервые использовали сканирующую электронную микроскопию при описании нового вида Facetotecta, необходимую для детального изучения внешней морфологии. Нами проведён сравнительно-морфологический анализ нового вида с уже описанными 7 видами фасетотект. Показано, что по таким признакам, как: карапакс с развитыми кутикулярными гребнями и округлым передним концом, а также наличие крюка на антеннулах, новый вид может быть отнесён к “Hansenocaris–pacifica group”. В статье приводится определительный ключ для всех известных видов этого подкласса. Нами проведён детальный анализ географического распространения Facetotecta. Показано, что личинки Facetotecta имеют космополитическое распространение. Они обнаружены во всех океанах и морях с нормальной или слегка уменьшенной солёностью (в Белом море - 21–25‰ и западной части Балтийского моря - 15–25‰). В тоже время мы не обнаружили этих личинок в распреснённых Чёрном море (14–17‰) и в центральной и восточной частях Балтики (6–9‰). Отсутствие фасетотект в распреснённых водоёмах может быть связано с обеднением морской фауны и исчезновением целых групп организмов, например, иглокожих и губок, которые могут быть возможными хозяевами Y-личинок. Хотя, фасетотекты могут погибать при пониженной солёности, а их возможные хозяева (не губки и иглокожие), наоборот, выживать. В Атлантике фасетотекты встречаются повсеместно от экватора до полярных регионов (Hansen, 1899; Mileikovsky, 1968; Schram, 1972; Grygier, 1987). В Пацифике они также найдены от экватора до бореальных широт (Kolbasov et al., 2007; собственные данные). В Индийском океане и его морях они описаны из экваториальных и тропических районов (Almeida Prado-Por, Por, 1988; Swathi, Mohan, 2019). Также фасетотекты обнаружены в Северном Ледовитом океане и его морях (Mileikovsky, 1968; Kolbasov, Høeg, 2003). Большинство Y-личинок были найдены в неритической зоне, около континентов, но некоторые личинки были обнаружены в океаническом планктоне или у изолированных островов, таких как Гавайи или остров Святой Елены. Добраться до середины океанов самим, что называется «вплавь» даже с помощью течений, из неритической зоны, представляется крайне проблематичным. Фасетотекты, в основном, населяют континентальный шельф (0–200 m), но есть и глубоководные находки из Курило-Камчатского Глубоководного Желоба - 3000–5640 м (дно 5750 м) и 3000–5900 м (дно 8740 м) (собственные данные). В тропических водах фасетотекты присутствуют более или менее перманентно (Almeida Prado-Por, Por, 1988, собственные данные). В субтропиках и бореальной зоне они могут быть найдены также большую часть года, за исключением Белого моря, где они присутствуют с апреля по июль. В планктоне присутствуют науплиальные и циприсовидная стадии фасетотект, но иногда могут быть найдены экзувии последней циприсовидной стадии. Так, экзувии циприсовидной стадии были найдены на Камчатке и Карском море (собственные данные). Присутствие экзувиев Y-циприсов в планктоне, находки Y-личинок в глубоководном планктоне, но в 2800 метрах над дном, встречаемость в океаническом планктоне науплиальных стадий, а также их постоянное присутствие в тропических водах могут свидетельствовать о пелагическом хозяине этих паразитов. 6. В 2021 году нами была опубликована статья, в которой полностью исследовано личиночное развитие паразитических Facetotecta (взрослые стадии не известны), в частности описана детальная морфология всех науплиальных стадий этих ракообразных (Kolbasov et al., 2021 - Organisms Diversity & Evolution, Q1, IF 2.242). Так как эта статья была уже опубликована в 2021 году, очевидно, что основные результаты были получены нами в ходе выполнения предыдущего проекта РФФИ. Тем не менее, при окончательной доработке рукописи, нами также использовались результаты, полученные в 2021 году. Эти исследования проведены впервые для Facetotecta. Личиночный материал исследовался на электронных микроскопах (СЭМ и ТЭМ). Нами впервые описаны 7 науплиальных стадий фасетотект. До наших исследований были описаны только 5 науплиальных стадий Facetotecta (Itô, 1990; Kolbasov, Høeg, 2003). В то же время для представителей класса Thecostraca, как и для Copepoda, иначально характерны 6 науплиальных стадий в личиночном развитии. Текостраки и копеподы объединяются в таксон Haxanauplia, находящий поддержку в некоторых молекулярных филогениях (Oakley et al., 2012), и, как следует из названия, характеризующийся 6 науплиальными стадиями. У текострак, у которых описаны 6 науплиальных стадий, первая стадия – всегда непитающийся ортонауплиус (Grygier, 1987; Itô & Grygier, 1990; Kolbasov et al., 2020). Впервые, благодаря нашим исследованиям, удалось не только описать первую науплиальную стадию фасетотект, представляющую непитающегося ортонауплиуса, но и установить наличие 7(!), а не 6 науплиальных стадий в их цикле. Этот факт ставит, как минимум, вопрос правомочности определения таксона Hexanauplia на основе 6 науплиальных стадий. Науплиус 1 легко отличается от последующих стадий по наличию гладкой кутикулы без кутикулярных гребней, вздутой задней части тела, лабруму, лишённому пор и папилл, более коротким щетинкам конечностей и отсутствию рудиментов максиллул (ортонауплиус). В отличие от последующих стадий, эта стадия не питается и линяет практически сразу (в течение нескольких часов после поимки, т.к. точное время вылупления неизвестно из-за отсутствия знаний по взрослым стадиям). У последующих стадий кутикула покрыта кутикулярными гребнями, формирующими паттерн из полигональных табличек. Первая науплиальная стадия Facetotecta имеет целый набор признаков, характерных для других первых науплиальных стадий Thecostraca (Ascothoracida и Cirripedia). Так, первые науплиальные стадии Ascothoracida и Cirripedia – непитающиеся ортонауплиусы, покрытые тонкой кутикулой без наружной скульптуры, морфология их придатков носит слегка «инфантильный» характер, т.к. плавательные щетинки конечностей короткие, без развитых сетул, необходимых для фильтрации, лабрум без пор и щетинок, линька кутикулы происходит беспорядочно, без определённых швов, сразу после вымётывания в окружающую среду. Нами проведён сравнительно-морфологический анализ первых науплиальных стадий всех Thecostraca,в результате которого выявлен целый ряд не только общих признаков, перечисленных выше, но и отличий (первые науплиальные стадии Cirripedia и Ascothoracida, выведенные нами в лабораториях на ББС МГУ и Тайване, детально исследовались на сканирующем электронном микроскопе). Так, науплиусы у Thecostraca имеют разную сегментацию конечностей (антеннул, антенн и мандибул). Нами установлено, что науплиальные стадии Facetotecta характеризуются редукцией сегментации и числа щетинок плавательных конечностей в сравнении с науплиусами других текострак и эта редукция может считаться синапоморфией фасетотект. Кроме того, первая науплиальная стадия Facetotecta отличается от аналогичных у Ascothoracida и Cirripedia наличием фронтальных филаментов, тогда как у усоногих и аскоторацид они отсутствуют у науплиуса 1. Как говорилось ранее, особенно интригующим выглядит факт наличия 7 науплиальных стадий в развитии Facetotecta, тогда как для всех Thecostraca изначально характерны 6 науплиальных стадий в развитии: один ортонауплиус и 5 метанауплиусов (Grygier, 1987; Høeg et al., 2004; Martin et al. 2014). Мы предполагаем, что основной эволюционной тенденцией у текострак и у остальных ракообразных является сокращение числа науплиальных стадий в личиночном развитии. Поэтому довольно трудно представить обратное увеличение числа науплиальных стадий у Facetotecta. Если так, то 7 науплиальных стадий может быть изначальным (ground pattern) для Thecostraca, и термин ‘Hexanauplia’ в данном случае звучит сомнительно. Так или иначе, мы не можем окончательно установить эволюционное значение 7 науплиальных стадий, пока полный жизненный цикл Facetotecta не будет расшифрован. 7. Итогом наших многолетних исследований, включая и последние данные по молекулярной филогении и морфологии Ascothoracida и Facetotecta, полученные в 2020-2021 годах, стала публикация большой статьи по систематике и филогении всех таксонов ракообразных класса Thecostraca, выполненная большим коллективом ведущих мировых специалистов (Chan et al., 2021 - Zoological Journal of the Linnean Society, Q1, IF 2.920). В статье представлен всесторонний пересмотр и синтез высокоуровневой классификации ракообразных класса Thecostraca и предложена кардинально новая систематика этой группы с выделением ряда новых отрядов, семейств и родов. Новая систематика разработана до уровня родов, включая как существующие, так и ископаемые формы. Нами дана оценка количества видов в каждой группе. Наша классификационная схема была обновлена на основе результатов недавних филогенетических исследований и попыток скорректировать классификации более высокого уровня, чтобы лучше представить эволюционные родственные связи и обосновать эволюционное разнообразие текострак. На основании молекулярного анализа и/или морфологических данных нами выделены монофилетические таксоны Thecostraca (вплоть до семейства). Наша итоговая классификация делит Thecostraca на подклассы Facetotecta, Ascothoracida и Cirripedia. Всего в классе сейчас 14 отрядов, 65 семейств и 367 родов. По нашим оценкам, эти ракообразные насчитывают 2116 видов. Таксономия сопровождается обсуждением основных событий в эволюции текострак и обоснованием различных предлагаемых нами перестроек.
2 27 апреля 2022 г.-1 декабря 2022 г. Паразитические ракообразные класса Thecostraca в сообществах коралловых рифов: биоразнообразие, жизненные циклы, родственные связи основных таксонов, паразито-хозяинные отношения
Результаты этапа: 1. Прежде всего, 2022 год - второй год выполнения проекта. Неудивительно, что одними из его результатов являются продолжение и завершение (опубликование) ранее начатых исследований. Так, в этом году нами опубликована статья и другая принята к печати в хороших журналах (Q1) и ещё несколько сданы в печать. Обе работы связаны с морфологией, филогенией и жизненными циклами уникальных паразитических ракообразных Facetotecta, известных только по личиночным стадиям. Первая публикация посвящена детальному изучению морфологии, включая ультраструктуру, всех известных циприсовидных личинок Facetotecta и определению родственных связей между ними (Kolbasov G.A., Savchenko A.S., Dreyer N., Chan B.K.K., Høeg J.T. 2022. A synthesis of the external morphology of cypridiform larvae of Facetotecta (crustacea: Thecostraca) and the limits of the genus Hansenocaris. Ecology and evolution, 12(11): 1-21. DOI: 10.1002/ece3.9488. IF 3.445). Более детально эти исследования были освещены в отчёте за 2021 год. Поэтому опишем их вкратце. Дело в том, что до сих пор все описанные виды подкласса Facetotecta формально относились к единственному роду Hansenocaris Itô, 1985. С помощью сканирующей электронной микроскопии нами детально исследована тонкая морфология циприсовидных личинок Facetotecta, представляющих отдельные таксоны и собранных из разных мест Мирового океана (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 1). Все циприсовидные личинки исследовались по стандартной методике на сканирующих микроскопах Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ (JEOL JSM-6380LA) и на ББС МГУ (Jeol JSM7000). Нами выделены различные паттерны сегментации абдомена (4 или 2 сегмента), наличие/отсутствие лабрума и его вооружения (количество шиповидных выростов), особенности и различия в морфологии антеннул (наличие или отсутствие крюка на втором сегменте, форма эстетаска, число и строение щетинок), торакоподов (сегментация экзо- и эндоподита), тельсона (количество пор, число и размер задних выростов, паттерны кутикулярных табличек) и других структур, указывающие на наличие у фасетотект большего числа крупных таксонов, чем единственный род Hansenocaris. Хотя, оптимальным был бы интегративный (морфологический + молекулярный) анализ родственных связей фасетотект, мы использовали только морфологические признаки Y-циприсов для проведения кладистического анализа и установления границ рода Hansenocaris s.s.. Это связано с отсутствием молекулярных данных для большинства известных Facetotecta. Нами составлена матрица из 15 надёжных морфологических признаков, и по ней впервые произведена кладистическая реконструкция филогении фасетотект (PAUP 4.0; см. файл с дополнительной информацией, Рис. 2). Нами установлено, что кроме самого рода Hansenocaris s.s., включающего 5 валидных видов и несколько неописанных форм из Мирового океана, в пределах Facetotecta имеются ещё 3 монофилетических таксона рангом не ниже родового. Нами определены морфологические границы самого рода Hansenocaris s.s. и общий план строения циприсовидных личинок Facetotecta. Нами установлены общие признаки для всех циприсовидных личинок фасетотект, включающие шесть пар решетчатых органов, вместо пяти пар, рассматриваемых ранее как «ground pattern» для всех ракообразных класса Thecostraca. Мы впервые описали «лишнюю» переднюю пару решётчатых органов и предположили, что эти хемосенсорные структуры имеют сегментарную природу. Так, у Cirripedia и Ascothoracida в состав переднего отдела (головы) входят 5 типичных сегментов и у них карапакс несёт 5 пар решётчатых органов. У Facetotecta имеется цефалоторакс, где с головой сливается первый торакальный сегмент (5+1), и для них характерны 6 пар решётчатых органов. Мы также выявили плезиоморфные и апоморфные состояния признаков для всех известных Y-циприсов, которые отличают их от циприсовидных личинок остальных Thecostraca. По этим данным нами также сделаны 2 доклада на конференциях: 1. Колбасов Г.А., Савченко А.С. "Уникальные особенности личиночных стадий Facetotecta". Научно-практическая всероссийская конференция с международным участием "Актуальные проблемы изучения ракообразных", 23-25 мая 2022 г., Борок, ИБВВ РАН. 2. Колбасов Г.А., Савченко А.С. «Внешняя морфология циприсовидных личинок Facetotecta и определение границ их таксонов». XIV Всероссийская конференция с международным участием "Проблемы изучения, рационального использования и охраны природных ресурсов Белого моря", ЗИН РАН, Санкт-Петербург, Россия 4-7 октября 2022. 2. За время наших совместных усилий с зарубежными коллегами накопился достаточно большой массив данных по различным аспектам биологии ракообразных подкласса Facetotecta (Y-личинок), включая их морфологию, анатомию, развитие, жизненные циклы, распространение, молекулярную генетику и т.д. Поэтому нашему коллективу было предложено опубликовать обзор по этой группе в журнале Oceanography and Marine Biology: an annual review (IF 5.389) (Dreyer N., Olesen J., Grygier M.J., Eibye-Jacobsen D., Høeg J.T., Kerbl A., Fujita Y., Kolbasov G.A., Savchenko A.S., Worsaae K., Palero F., Chan B.K.K. 2023. The biology and life cycle of enigmatic crustacean y-larvae: a review. Oceanography and Marine Biology: an annual review, 61, accepted). В этой публикации мы представляем краткий исторический обзор изучения Y-личинок, обзор их систематики, подробно излагаем структурные особенности каждой известной функциональной стадии жизненного цикла (Y-науплиусы, Y -циприс, ипсигон (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 3-5). Мы обсуждаем жизненный цикл Facetotecta с точки зрения филогенетического и экологического контекста и сравниваем его с жизненным циклом других свободноживущих и паразитирующих Thecostraca. Вместе с обобщением того, что известно об экологии и биогеографии Y-личинок, на основе новых полученных данных, мы проверяем конкретные гипотезы, связанные с пространственно-временной динамикой и экологией Y-личинок. Чтобы не отнимать слишком много драгоценного времени рецензента, мы упомянём здесь только те оригинальные результаты, о которых не писали в предыдущем отчёте. Нашей исследовательской группой только за последние 5 лет собрано более 10000 экземпляров личиночных стадий фасетотект из различных мест Мирового океана. Для получения данных нами использовались как классические методы планктонного сбора личинок и исследования на электронных микроскопах, так и методы молекулярного анализа и конфокальной микроскопии. Довольно часто личиночные стадии фасетотект попадаются в единичных экземплярах, а в случае множественных находок в одной пробе трудно определить к одному или нескольким видам принадлежат личинки. Поэтому нами были разработаны специальные протоколы работы с единичными экземплярами личинок, позволяющие получать как молекулярные, так и морфологические данные, с сохранением ваучерного экземпляра (экзувий). Для повышения эффективности амплификации, мы разработали специфические для фасетотект и более длинные (> 20 п.н.) праймеры. Мы протестировали в общей сложности 28 пар праймеров (23 новых) и провели с ними 2056 ПЦР-реакций. Нашей целью было разработать и проверить эффективность быстрых методов выделения ДНК из отдельных особей, с сохранением «экзувиев» в качестве ваучеров. Нами использовался метод экстракции ДНК с использованием набора GeneReleaser® (BioVentures, Теннесси, США) и упрощенный метод DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN, Калифорния, США). Мы выделили ДНК из 421 отдельных экземпляров личинок (9 с Азорских островов, 326 с острова Сесоко (Япония), 4 из Малайзии, 105 из разных мест на Тайване и 17 из Белого моря, Россия). Были получены сиквенсы трех рибосомных локусов (митохондриальный 16S и ядерный 18S, 28S) и двух белок-кодирующих генов (митохондриальный COX1 и ядерный H-3) из 74 образцов. Все сиквенсы были депонированы в NCBI GenBank. Интересные новые данные были получены по метаморфозу циприсовидной личинки фасетотект в ювенильную червеобразную стадию – ипсигон, индуцированному линочным гормоном 20-hydroxyecdysone и строению этой стадии. Нахождение экзувиев циприсовидных личинок фасетотект в планктоне (Kolbasov et al., 2021) может свидетельствовать, что в природе метаморфоз происходит в планктоне, т.е. предполагаемые хозяева Facetotecta – планктонные формы. Ипсигон формируется внутри циприсовидной личинки, его эпидермис отделяется от кутикулы циприса и быстро покрывается собственной, очень тонкой кутикулой (<5nm толщиной; см. файл с дополнительной информацией Рис. 3-5). После 31-72 часов, ипсигон начинает медленно изгибаться внутри циприса и постепенно выходит из экзувия кпереди от верхней губы (см. файл с дополнительной информацией Рис. 3), т.е. как раз в том месте где предполагается прикрепление антеннулами циприсовидной личинки к хозяину. Вышедший ипсигон обладает очень ограниченной подвижностью, он способен жить более суток (до 72 часов) и даже может несколько раз линять сбрасывая кутикулу на переднем конце, но, не меняя своей формы. Для сравнения червеобразная инфекционная стадия корнеголовых усоногих Rhizocephala – вермигон никогда не линяет в процессе инфицирования и роста (Glenner 2001). Нами описано разнообразие морфологии ипсигонов от гладких изометрических и вытянутых до яйцевидных (см. файл с дополнительной информацией Рис. 3), что может отражать процесс инвазии различных хозяев. Спереди ипсигоны несут многочисленные мелкие шипы и поры, функция которых не ясна. Под тонкой кутикулой, не имеющей слоёв (эпикутикула), расположен эпителий. По сравнению в вермигоном Rhizocephala, состоящим из 3-4 типов клеток (Høeg 1987; Glenner 2001), ипсигон имеет более сложное внутреннее строение (см. файл с дополнительной информацией Рис. 4, 5). Правда, неясно, какие из этих структур возникли и будут функционировать в самом ипсигоне, а какие остались от циприсовидной личинки (например, сложные глаза) и дегенерируют впоследствии? Возможно, дегенерирующие органы могут служить источником пищи для ипсигона в процессе инвазии. Производные бывшей нервной системы циприса занимают большую часть переднего конца иписигона (см. файл с дополнительной информацией Рис. 4, 5). Конфокальная микроскопия и ТЭМ показывают наличие большого срединного нейропиле у переднего конца, соответствующего нейритам Y-циприса. Ипсигон содержит пучки дорсальных и вентральных мышц, которые обеспечивают амебоидное движение этой стадии. Такие структуры отсутствуют у вермигона ризоцефал, также способного двигаться. Ипсигон лишён функциональной кишки, но нами обнаружена удлинённая тёмная масса клеток, наполненных жировыми каплями и тянущаяся практически через всё тело, она может представлять остаток пищеварительной системы циприса (хотя, он сам не питается). Сравнение с анатомией инвазивных стадий Rhizocephala (Høeg 1985, 1987; Glenner 2001) показывает, что эти клетки не являются зачатками ооцитов и, таким образом, ипсигон не представляет взрослую стадию фасетотект. Эти липидосодержащие клетки могут выполнять функцию питательных веществ пока ипсигон не развился во взрослую питающуюся стадию. По данным молекулярного анализа нами установлено, что одновременно (в течение нескольких дней) в планктоне в определённом месте может присутствовать до 23 (Тайвань) или даже 40 (южная Япония) видов фасетотект. Этот факт вызывает вопрос: кто может быть их хозяином? Особенно для лецитотрофных личинок, жизненный цикл которых умещается в одну неделю (у планктотрофных до 3 месяцев в северных широтах – Белое море). В этом случае хозяева должны обитать непосредственно в том месте, где собраны лецитотрофные личинки. Если фасетотекты действительно паразиты и обладают специфичностью к хозяевам (а морфология циприсов и ипсигонов может на это указывать), то перманентно в таком месте должны присутствовать множество инфицированных особей хозяев, причём разных видов. Наши данные свидетельствуют, что Y-личинки распространены в основном в прибрежных водах. Предположительно паразитические взрослые стадии могут воздействовать на аквакультуру, как скрытые паразиты, пока не идентифицированные нами. 3. В 2022 году нами написана и сдана в печать статья по празито-хозяинным отношениям (питанию) у двух групп эндопаразитических Ascothoracida (Kolbasov G.A., Zalota A.K., Chan B.K.K. Trophic ecology of crustacean endoparasites in scleractinian and zoanthid corals, Petrarca and Baccalaureus (Ascothoracida, Thecostraca): do they feed on their host tissue? Marine Ecology Progress Series (in press)). О начале этих исследований мы подробно писали в отчёте за 2021, поэтому вкратце упомянем их. Известно, что коралловые рифы - самые богатые экосистемы океана в них существует огромное число различных симбиотических ассоциаций, включая паразитизм. Питание паразитов - один из наиболее важных аспектов паразито-хозяинных отношений. Очень часто паразитизм в кораллах является эндопаразитизмом, и трофические связи трудно определить, поскольку они происходят только в неповрежденных ассоциациях. Роды Ascothoracida: Petrarca и Baccaulareus являются эндосимбиотическими ракообразными в склерактиниевых кораллах (образующих галлы в коралловом скелете) и зоантариях (живущих внутри гастральной полости) соответственно. Анализ стабильных изотопов δ13C и δ15N Petrarca и хозяина - склерактиниевого коралла Turbinaria выявил сходные изотопные сигнатуры паразита и хозяина (δ13C -11.77-12.69 ‰; δ15N 3.66-5.52 ‰). Это говорит о том, что Petrarca получает углерод и азот от своего хозяина-коралла (питается им). Petrarca имеет развитые мандибулы с рядом острых и частых зубов, служащие для отрезания коралловой ткани, максиллулы со сложными зубами и массивные максиллы, которые принимают участие в дальнейшем пережевывании пищи. Напротив, анализ стабильных изотопов δ13C и δ15N у аскоторацид рода Baccaulaures и его хозяина-зоантарии рода Palythoa выявил, что значения этих изотопов у паразита и хозяина разошлись на два основных кластера с разницей более 12 ‰. Совершенно очевидно, что Baccalaureus не питается своим хозяином. Значения δ13C и δ15N Baccalaureus разделены на две группы с разными диапазонами δ15N. Это говорит о том, что эти две группы Baccalaureus могут питаться на разных трофических уровнях. Ротовой аппарат Baccalaureus имеет редуцированные ротовые конечности со слабым вооружением. Очевидно, что Baccalaureus является оппортунистом, который подворовывает пищу непосредственно из гастральной полости хозяина, что приводит к большим вариациям значений δ13C и δ15N. 4. Мы рады сообщить, что не смотря на все перипетии, связанные с обстановкой в мире, нам удалось провести полноценный полевой сезон в Малайзии (с 27 мая по 14 июня). В 2021 году нами были запланированы две альтернативных возможности полевых работ: уже привычные нам работы на Тайване и новые для нас исследования в Малайзии. К сожалению, в 2022 году Тайвань был закрыт для научных визитов из-за COVID 19. Более того, вакцина Спутник V была невалидна там (и некоторые другие события, о которых мы не хотим говорить). Тем не менее, все полевые исследования на Тайване были проведены нашими партнёрами. Представившаяся нам возможность провести аналогичные полевые исследования очень ценна, так как позволяет провести сравнение полученных данных из разных тропических биоценозов. К счастью, у нас есть коллеги из университета Куала-Теренгану, которые сильно поспособствовали в проведении работ. Нами исследовались различные морские прибрежные сообщества, расположенные вдоль восточного побережья Малайзии (Южно-Китайское море): от Куала-Теренгану на северо-востоке до штата Джохор на самом юге страны. Наши полевые работы включали, прежде всего, исследования коралловых сообществ для сбора паразитических ракообразных Ascothoracida (водолазные погружения); планктонные пробы для сбора личиночных стадий ракообразных Facetotecta и сбор ракообразных Decapoda (водолазные погружения, сбор у берега и просмотр, покупка на рынках крабов-плавунцов), являющихся хозяевами паразитических усоногих ракообразных Rhizocephala (см. файл с дополнительной информацией Рис. 7). Очень приятно, что все три направления наших исследований принесли интересные результаты (см. далее). Из Ascothoracida нам удалось собрать представителей трёх родов (Sessilogoga, Baccalaureus и Zibrowia), являющихся эндопаразитами трёх различных групп кораллов: антипатарий, зоантарий и склерактиний соответственно. Причём трофические связи Sessilogoga и Zibrowia нами не исследовались ранее, а для Baccalaureus было бы интересно сравнить спектры питания на Тайване (данные получены в 2021 г.) и Малайзии. При обработке материала, для последующего проведения изотопного анализа, из живых кораллов извлекались паразиты, отчищались от тканей хозяина, и в зависимости от их размера помещались по одной или несколько особей в пробирку для замораживания. У живых или замороженных кораллов под микроскопом отделялась мягкая ткань без известковых вкраплений и поверхностной слизи, которые могут загрязнить пробу. Планктон был собран в районе сбора кораллов при помощи планктонной сети Джеди, диаметром 40 см и ячеёй 72 µм, с горизонта 0-20 м. Были подготовлены несколько проб тотального сбора планктона. Затем из остатка пробы, под микроскопом были выбраны морские стрелки (Chaetognatha), копеподы (Copepoda) для отдельного анализа. Также нами были собраны креветки – эпибионты антипатарий. Весь материал был заморожен (-20 °С) в пластиковых пробирках и перевезен в лабораторию в Москве в термосе с сухим льдом. Перед анализом образцы были высушены до постоянного веса в течение 3-5 дней при 70°C, перетерты в порошок в ступке и упакованы в оловянную фольгу (по 200-500 микрограмм). Изотопный анализ был проведен с помощью изотопного масс-спектрометра ThermoDeltaVPlus и элементного анализатора ThermoFlash 1112 в Центре коллективного пользования при Институте проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН. Соотношение стабильных изотопов представлено в промилле (‰), согласно формуле: 13C, 15N = [(Rпроба/Rэталон) – 1]*1000 Где R= отношения 13C/12C для углерода и 15N/14N для азота в пробе и эталоне (VPDB для δ13C и атмосферный N2 для δ15N). Аналитическая погрешность определения изотопного состава (SD при анализе лабораторного стандарта, n=6-8) не превышала 0.2‰. Значения δ13C у образцов с массовым отношением C/N выше 4 были скорректированы для учета концентрации липидов с использованием математического уравнения, предложенного Post et al. (2007). Кораллы Antipatharia и Tubastrea sp. (склерактинии) имеют схожие показатели δ13C и δ15N (-21 до -17.6, и 5.8 до 6.8‰), что говорит о схожести их питания (см. файл с дополнительной информацией Рис. 6). С другой стороны аналогичные показатели для зоантарий (Palythoa) заметно отличаются (в среднем на 6‰ δ13C и 2‰ δ15N) что свидетельствует о сдвиге их спектра питания в сторону симбиотических зооксантелл. Тотальные пробы зоопланктона имели очень широкий диапазон разброса δ13C (около 7‰). Такой разброс говорит о значительном разнообразии источников питания и состава планктона и не позволяет судить о едином сигнале зоопланктона в питании потребителей. Судя по всему, кораллы (Antipatharia и Tubastrea sp.) используют селективное питание при захвате/усвоении планктонных организмов. При неселективном питании, у кораллов δ13C близок к среднему показателю зоопланктона. Кораллы Antipatharia и Tubastrea имеют схожее питание с эпибионтными креветками, которые, вероятно, могут питаться антипатариями, (в среднем -18.8±0.5‰ δ13C и 7.2±0.2‰ δ15N). Все они, в свою очередь, по спектру питания близки к морским стрелкам и копеподам по δ13C (-21.5 и 21.1±0.2‰, соответственно). Таким образом, копеподы, как и стрелки (но в меньшей мере), могут быть добычей кораллов Antipatharia и Tubastrea (но не единственной). Разница δ13C больше чем в 2‰ между копеподами и кораллами говорит о присутствии другой пищи, помимо копепод, в их рационе. Все аскоторациды имеют схожие δ13C со своими хозяевами (в среднем разница не более 1‰), и δ15N чуть ниже (в среднем разница 2‰) что близко к среднему трофическому шагу. Таким образом, полученные данные указывают на прямое паразитическое питание симбионтов тканями их хозяина. Очень близкие показатели δ13C и δ15N у хозяина Antipatharia и симбионта (паразита) Sessilogoga (разница в δ15N в среднем 1.3 ‰) указывает на то, что симбионт может питаться как тканями коралла, так и изымать из гастроваскулярной системы пищу у хозяина (см. файл с дополнительной информацией Рис. 6). Развитые колюще-сосущие ротовые конечности могут указывать на это. Представители Sessilogoga - достаточно плезиоморфные (примитивные) аскоторациды, паразитирующие в гастроваскулярной системе антипатарий, но способные выходить наружу через ротовые отверстия зооидов и свободно плавать. Собранные особи уже детально изучены нами (СЭМ) и относятся к новому виду. Аскоторациды рода Zibrowia – эндопаразиты склерактиниевых кораллов Tubastrea, родственны другим эндопаразитам склерактиниевых кораллов рода Petrarca, питание которых было изучено нами ранее. Они также обладают режущими мандибулами и максиллулами и массивными максиллами. Ожидаемо, аскоторациды обоих родов питаются непосредственно тканями кораллов-хозяев. Наиболее интересен полученный результат для пары: хозяин -зоантария Palythoa, симбионт - Baccalaureus. Анализ стабильных изотопов показал, что особи Baccalaureus, обитающие в зоантариях в Малайзии, могут питаться их тканями (см. файл с дополнительной информацией Рис. 6). Хотя, ранее полученные нами изотопные данные из Тайваня (см. выше) показали большую разницу в δ 13C (около 10 ‰), что однозначно указывает на то, что особи Baccalaureus из Тайваня не питаются хозяином и могут являться оппортунистами. Однако, среди самих симбионтов из Тайваня была неоднородность изотопных показателей (разница около 3‰ δ 13C и 4‰ δ15N). Нами так же было показано, что Palythoa из Тайваня являются хозяевами для, как минимум, 4 видов Baccalaureus (данные генетического анализа и морфологии). Такая разница изотопных показателей между симбионтами из Тайваня и Малайзии может быть связана с межвидовыми различиями в питании. Хотя, этот вывод очень спорный, так как нет существенных различий в строении ротового аппарата и локализации в коралле аскоторацид рода Baccalaurues из Тайваня и Малайзии. Мы только недавно получили данные по питанию малайских аскоторацид, поэтому сейчас осмысливаем их. Таким образом, полученные столь различные изотопные данные не могут дать однозначного ответа о питании Baccalaureus, и требуют дальнейших генетических, морфологических и изотопных работ для разгадки этого вопроса,что и будет проведено нами. 5. В ходе полевых работ в Малайзии, на побережье Южно-Китайского моря, в провинции Джохор были собраны крабы Portunus pelagicus L, 1758, (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 7), зараженные корнеголовым ракообразным Diplothylacus sinensis (Keppen, 1877) (сем. Thompsoniidae). D. sinensis относится к достаточно слабо изученной группе «Akentrogonida». Наши исследования были направлены на выявление наличия связи столонов паразита D. sinensis с нервной системой хозяина. Явление прямого взаимодействия столонов корнеголовых ракообразных было ранее описано на ряде видов, относящихся к группе «Kentrogonida» (Nielsen, 1970; Payen et al., 1981; Miroliubov et al., 2020; Lianguzova et al., 2021). У большинства представителей базальных семейств (Peltogastridae, Peltogasterellidae, Sacculinidae) были обнаружены специализированные столоны, проникающие в толщу нервной ткани хозяина. При этом дистальные участки этих столонов модифицированы в бокаловидные органы. У корнеголовых из сем. Polyascidae бокаловидные органы, по-видимому, были утрачены; вместо них в нейропиле ганглия расположены многочисленные тонкие столоны. И бокаловидные органы, и тонкие столоны предположительно играют решающую роль в регуляции паразито-хозяинных отношений (Miroliubov et al., 2020; Lianguzova et al., 2021). Следует отметить, что семейство Polyascidae является сестринской кладой к эволюционно продвинутой группе «Akentrogonida» (Høeg et al., 2020; Chan et al., 2021). Взаимодействие «акентрогонид» с нервной системой хозяина до настоящего времени оставалось неизученным вовсе. При этом считается, что акентрогониды гораздо слабее воздействуют на своих хозяев, чем кентрогониды. В рамках данного проекта было проведено гистологическое исследование вентральной ганглиозной массы крабов P. pelagicus, зараженных D. sinensis. Вскрытие живых зараженных хозяев проводилось с использованием стереомикроскопа в морской воде. Нервные ганглии вентральной ганглиозной массы хозяина были зафиксированы в жидкости Буэна. Затем объекты были заключены в парафиновые блоки по стандартной гистологической методике. Срезы толщиной 5 мкм были изготовлены с использованием ротационного микротома Lieca RM 2555. В дальнейшем срезы были окрашены полихромным красителем по Маллори (фуксин, фосфорномолибденовая кислота, оранж G, анилиновый синий). Многочисленные столоны D. sinensis проникают в нервную ткань ганглиев вентральной ганглиозной массы крабов P. pelagicus. Кроме того, столоны были обнаружены также и в нервных стволах, отходящих от самих ганглиев. Дистальные части этих столонов не преобразованы в бокаловидные органы. Специализированные столоны, ассоциированные с нервными ганглиям хозяина, были обнаружены у всех обследованных видов корнеголовых, включая и представителей «Akentrogonida». Принимая во внимание способность к манипулированию хозяином можно предположить, что столоны, расположенные в нервной ткани, играют важную роль в эволюции Rhizocephala. Отсутствие бокаловидных органов у одного из представителей продвинутой клады «Akentrogonida» и у сестринского им сем. Polyascidae указывает на вероятную утрату бокаловидных органов у общего предка. При этом столоны, внедряющиеся в нервную ткань хозяина, продолжают выполнять функцию регулирования паразито-хозяинных взаимодействий. Столоны D. sinensis, расположенные в нервной ткани краба, значительно отличаются от таковых столонов представителей группы «Kentrogonida». Помимо этого, эти столоны сами по себе демонстрируют выраженный полиморфизм. Мы обнаружили как минимум четыре разных типа столонов, различающихся по своей тканевой организации. Столоны первого типа покрыты тонкой кутикулой, под которой залегает один слой гиподермы, а в центре столона расположен центральный канал. В столонах второго типа присутствует обширное субкутикулярное пространство, которое заполнено гомогенным содержимым, окрашивающимся синим цветом при окраске препаратов по Маллори. В этом субкутикулярном пространстве встречаются округлые пустоты. Слой гиподермы залегает под обширным субкутикулярным пространством; центральный канал практически не выражен, а его полость заполнена отдельно лежащими клетками. У столонов третьего типа субкутикулярное пространство также очень обширно. У этих столонов отсутствуют какие-либо выраженные слои клеток, клетки хаотично лежат в гомогенном матриксе, продолжении субкутикулярного пространства. Центральный канал полностью отсутствует. Четвертый тип обнаруженных столонов характеризуется наличием выраженного гиподермального слоя, небольшим объёмом субкутикулярного пространства и множеством гранул, вероятно, секреторной природы. При этом мы обнаруживали и переходные формы между указанными выше типами столонов. Скорее всего, в данном случае обнаруженный полиморфизм обусловлен не дискретными типами столонов, а последовательным изменением гистологической организации по ходу столона. Считается, что представители группы «Akentrogonida» в гораздо меньшей степени воздействуют на своих хозяев, чем представители «Kentrogonida». Так в отличие от базальных семейств акентрогониды не блокируют линочный цикл хозяина, а лишь немного пролонгируют межлиночный период (Lützen, Jespersen 1992; Jespersen, Lützen 1992). Связано это в первую очередь с особенностью их жизненного цикла. Прорастание экстерн связано с линькой хозяина, при этом паразит продуцирует огромное число короткоживущих экстерн, которые сбрасываются при следующей линьке хозяина. Кроме того, не было отмечено существенного изменения поведения зараженных хозяев. Однако, следует отметить, что в целом акентрогониды изучены гораздо хуже, чем кентрогониды. Все поведенческие эксперименты были поставлены на представителях базальных семейств (Rasmussen, 1959; Bishop, Cannon, 1979; Takahashi et al., 1997; Innocenti et al., 1998; Innocenti et al., 2003; Vázquez-López et al., 2006; Vazquez-Lopez, 2019). Наши результаты (наличие множественных столонов, поражающих нервные ганглии хозяина) и недавно опубликованный транскриптом гемолимфы зараженного хозяина (Yang et al., 2022) указывают на существенное паразито-хозяинное взаимодействие.
3 1 января 2023 г.-1 декабря 2023 г. Паразитические ракообразные класса Thecostraca в сообществах коралловых рифов: биоразнообразие, жизненные циклы, родственные связи основных таксонов, паразито-хозяинные отношения
Результаты этапа: Прежде всего, скажем, что в итоговом отчёте необходимо приводить результаты, полученные за все три года выполнения проекта. Поэтому мы заранее извиняемся перед экспертами, если им придётся читать некоторые результаты по второму разу. Мы старались перечислить здесь только важные результаты, уже опубликованные или принятые в печать. Одним из важнейших результатов выполнения проекта являются подготовленные и опубликованные статьи. По теме проекта нами опубликовано 10 статей (из них 9 в Q1 и 8 совместно с тайваньскими партнёрами), ещё 3 статьи находятся в печати (3 в Q1 и 3 совместно с тайваньскими партнёрами). Поэтому, прежде всего, остановимся на результатах изложенных в них. Для удобства перечислим результаты для каждой из исследованных групп паразитических ракообразных. Но, для начала, следует упомянуть о публикации по систематике и филогении всех таксонов ракообразных класса Thecostraca (Ascothoracida, Facetotecta, Cirripedia), ставшей итогом наших многолетних исследований, включающих последние данные по молекулярной филогении и морфологии этих ракообразных. Эта статья выполнена большим коллективом ведущих мировых специалистов (Chan B.K.K., Dreyer N., Gale A.S., Glenner H., Ewers-Saucedo C., Pérez-Losada M., Kolbasov G.A., Crandall K.A., Høeg J.T. 2021. The evolutionary diversity of barnacles, with an updated classification of fossil and living forms Zoological Journal of the Linnean Society, 2021, XX, 1–58. DOI: 10.1093/zoolinnean/zlaa160, IF 3.834, Q1). В статье представлен всесторонний пересмотр и синтез высокоуровневой классификации ракообразных класса Thecostraca и предложена кардинально новая систематика этой группы с выделением ряда новых отрядов, семейств и родов. Новая систематика разработана до уровня родов, включая как существующие, так и ископаемые формы. Нами дана оценка количества видов в каждой группе. Наша классификационная схема была обновлена на основе результатов недавних филогенетических исследований и попыток скорректировать классификации более высокого уровня, чтобы лучше представить эволюционные родственные связи и обосновать эволюционное разнообразие текострак. На основании молекулярного анализа и/или морфологических данных нами выделены монофилетические таксоны Thecostraca (вплоть до семейства). Наша итоговая классификация делит Thecostraca на подклассы Facetotecta, Ascothoracida и Cirripedia. Всего в классе сейчас 14 отрядов, 65 семейств и 367 родов. По нашим оценкам, эти ракообразные насчитывают 2116 видов. Таксономия сопровождается обсуждением основных событий в эволюции текострак и обоснованием различных предлагаемых нами перестроек. По паразитическим ракообразным подкласса Ascothoracida нами получены следующие результаты: Одной из задач проекта было изучение биоразнообразия, морфологии и паразито-хозяинных отношений аскотрацид рода Petrarca, паразитирующих на склерактиниевых кораллах рода Turbinaria (Gregory A. Kolbasov, Alexandra S. Savchenko, Meng-Chen Yu, Yao-Feng Tsao, Monthon Ganmanee, Benny K.K. Chan. 2023. Integrative taxonomy, larval biology and functional morphology of the little known gall-forming coral endoparasite Petrarca (Thecostraca: Ascothoracida), Zoological Journal of the Linnean Society, 198, 3: 767–801. https://doi.org/10.1093/zoolinnean/zlad009, IF 2.800, Q1). Эти паразиты обитают в галлах, хорошо заметных на поверхности коралла (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 1-3), селясь по 2 (иногда 3) особи в каждом галле, и являются гермафродитами, что уникально для Ascothoracida. С помощью молекулярно-генетического анализа (маркёры COI, 12S, 18S, 28S), нами установлено, что в склерактиниевых кораллах рода Turbinaria (T. bifrons, T. mesenterina и T. frondens), обитающих в районе Тайваня, паразитируют 4 вида рода Petrarca. Это P. goanna Grygier, 1991, P. morula Grygier, 1985 и два новых вида Petrarca nasawai Kolbasov et al., 2023 и Petrarca rubus Kolbasov et al., 2023. Причём виды P. goanna и Petrarca rubus образуют криптическую пару и практически неотличимы морфологически. Ранее было высказано предположение, что виды P. goanna и P. morula также могут представлять вариации одного вида (Grygier, Nojima 1995). Благодаря привлечению методов молекулярно-генетического анализа и электронной микроскопии (СЭМ), нами установлены признаки, которые мы можем использовать в таксономическом анализе для разграничения видов этих паразитов. Показано, что все виды рода Petrarca имеют 6 пар одноветвистых торакоподов, лишённых сегментации, первый торакопод всегда рудиментарный, щетинковидный. Ранее считалось, что у некоторых видов первый торакопод может отсутствовать, а число остальных торакоподов может быть разным даже в пределах одного вида или особи. Установлено, что морфология пениса (размер, форма и вооружение дистальных выростов) не может являться чётким таксономическим признаком. Несмотря на то, что морфология антеннул более или менее одинакова у всех представителей рода, ультраструктура эстетасков, расположенных на выростах антеннул (claw guard), различна у криптических видов и является отличительным признаком. Нами показано, что морфология карапакса (мантии) является одним из ключевых таксономических признаков Petrarca (форма дорсального края, наличие/отсутствие мантийных зубчиков и папилл у вентрального края). Представители Petrarca обитают в известковых галлах, образованных кораллом, и каким-то образом должны расширять свои камеры по мере роста. Это возможно двумя путями: механическим и химическим. Например, большинство видов сверлящих усоногих надотряда Acrothoracica, живущие в известковых субстратах, несут частые ктеноидные чешуйки на наружной поверхности мантийного мешка (карапакса), формирующие сверлящий аппарат (Колбасов, 2009). Ничего подобного мы не обнаружили на наружной поверхности аскоторацид рода Petrarca. Но на их наружной поверхности располагаются многочисленные папиллы и зубчики (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 2). На вершине каждого такого зубчика или папиллы располагается одиночная центральная микроскопическая пора. Через эти поры может выделяться вещество, растворяющее известковый субстрат хозяина. Неплохим признаком для таксономии рода нам видится морфология мандибул (вооружение) - количество и форма зубчиков разное у видов. Основной и оригинальной целью нашего проекта было исследование характера паразито-хозяинных отношений Ascothoracida с их хозяевами. Известно, что коралловые рифы - самые богатые экосистемы океана в них существует огромное число различных симбиотических ассоциаций, включая паразитизм. Питание паразитов - один из наиболее важных аспектов паразито-хозяинных отношений. Очень часто паразитизм в кораллах является эндопаразитизмом, и трофические связи трудно определить, поскольку они происходят только в неповрежденных ассоциациях. Впервые для изучения спектра питания Ascothoracida использовался метод стабильных изотопов углерода и азота (δ13C и δ15N). Нами исследованы трофические связи аскоторацид и их хозяев, обитающих, как на Тайване, так и в Малайзии (использованные методы указаны ниже в «Методах и подходах»). Было исследовано питание эндопаразитических аскоторацид из родов Petrarca (4 вида) и Baccalaureus (4 вида), обитающих на Тайване в галлах склерактиний рода Turbinaria и в гастральной полости зоантарий рода Palythoa соответственно (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 4). Kolbasov GA, Zalota AK, Chan BKK. 2023. Trophic ecology of crustacean endoparasites Petrarca and Baccalaureus (Ascothoracida, Thecostraca) in scleractinian and zoantharian corals. Marine Ecology Progress Series, 715:69-78. https://doi.org/10.3354/meps14358, IF 2.600, Q1). Для контроля нами также получены изотопные профили для зоопланктона, собранного в тоже время и в том же районе. Анализ стабильных изотопов δ13C и δ15N Petrarca и хозяина - склерактиниевого коралла Turbinaria выявил сходные изотопные сигнатуры паразита и хозяина (δ13C -11.77-12.69 ‰; δ15N 3.66-5.52 ‰). Это говорит о том, что Petrarca получает углерод и азот от своего хозяина-коралла (питается им). Petrarca обладает развитыми мандибулами с рядом острых и частых зубов, служащих для отрезания коралловой ткани, максиллулы со сложными зубами и массивные максиллы также принимают участие в пережевывании пищи. Напротив, анализ стабильных изотопов δ13C и δ15N у аскоторацид рода Baccaulaures и его хозяина-зоантарии рода Palythoa выявил, что значения этих изотопов у паразита и хозяина разошлись на два основных кластера с разницей более 12 ‰. Совершенно очевидно, что Baccalaureus не питается своим хозяином. Значения δ13C и δ15N Baccalaureus разделены на две группы с разными диапазонами δ15N. Это говорит о том, что эти две группы Baccalaureus могут питаться пищей на разных трофических уровнях. Ротовой аппарат Baccalaureus имеет редуцированные ротовые конечности со слабым вооружением. Очевидно, что Baccalaureus является оппортунистом, который подворовывает пищу непосредственно из гастральной полости хозяина, что приводит к большим вариациям значений δ13C и δ15N. Поэтому возникает вопрос: каков спектр питания тех же аскоторацид, обитающих в другом месте? Благодаря работам в Малайзии, нам удалось ответить на этот вопрос (Zalota A.K., Savchenko A.S., Miroliubov A.A., Waiho K., Fazhan H., Chan B.K.K., Kolbasov G.A. Parasitism in coral reefs: Trophic ecology of crustacean ascothoracidan parasites and their coral hosts from Malaysia. Zoology, IF 2.00, Q1, in press). Нам удалось изучить трофическую экологию представителей трёх родов аскоторацид (Sessilogoga, Baccalaureus и Zibrowia), являющихся эндопаразитами трёх различных групп кораллов: антипатарий, зоантарий и склерактиний соответственно. Причём трофические связи Sessilogoga и Zibrowia нами не исследовались ранее, а для Baccalaureus было бы интересно сравнить спектры питания на Тайване и Малайзии. Дополнительно, чтобы установить возможный спектр питания паразитов и хозяев, для исследований методом анализа стабильных изотопов, были подготовлены несколько проб тотального сбора планктона. Также отдельно выбирались массовые формы макропланктона морские стрелки (Chaetognatha) и копеподы (Copepoda) для отдельного анализа. Также нами были собраны креветки – эпибионты антипатарий. Весь материал был заморожен (-20 °С) в пластиковых пробирках и перевезен в лабораторию в Москве в термосе с сухим льдом. Перед анализом образцы были высушены до постоянного веса в течение 3-5 дней при 70°C, перетерты в порошок в ступке и упакованы в оловянную фольгу (по 200-500 микрограмм). Изотопный анализ был проведен с помощью изотопного масс-спектрометра ThermoDeltaVPlus и элементного анализатора ThermoFlash 1112 в Центре коллективного пользования при Институте проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН (см. «Методы и подходы»). Кораллы Antipatharia и Dendrophyllia sp. (склерактинии) имеют схожие показатели δ13C и δ15N (-21 до -17.6, и 5.8 до 6.8‰), что говорит о схожести их питания (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 5, 6). Это объясняется тем, что эти кораллы не содержат симбиотических зооксантелл и являются хищниками. С другой стороны аналогичные показатели для зоантарий (Palythoa) заметно отличаются (в среднем на 6‰ δ13C и 2‰ δ15N) что свидетельствует о сдвиге их спектра питания в сторону симбиотических зооксантелл. Тотальные пробы зоопланктона имели очень широкий диапазон разброса δ13C (около 7‰). Такой разброс говорит о сильном разнообразии источников питания и состава планктона и не позволяет судить о едином сигнале зоопланктона в питании потребителей. Судя по всему, кораллы (Antipatharia и Dendrophyllia sp.) используют селективное питание при захвате/усвоении планктонных организмов. При неселективном питании, у кораллов δ13C близок к среднему показателю зоопланктона. Кораллы Antipatharia Dendrophyllia имеют схожее питание с эпибионтными креветками, которые, вероятно, могут питаться антипатариями, (в среднем -18.8±0.5‰ δ13C и 7.2±0.2‰ δ15N). Все они, в свою очередь, по спектру питания близки к морским стрелкам и копеподам по δ13C (-21.5 и 21.1±0.2‰, соответственно). Таким образом, копеподы, как и стрелки (но в меньшей мере), могут быть добычей кораллов Antipatharia и Dendrophyllia (но не единственной). Разница δ13C больше чем в 2‰ между копеподами и кораллами говорит о присутствии другой пищи, помимо копепод, в их рационе. Sessilogoga и Zibrowia имеют схожие δ13C со своими хозяевами (в среднем разница не более 1‰), и δ15N чуть ниже (в среднем разница 2‰) что близко к среднему трофическому шагу. Таким образом, полученные данные указывают на прямое паразитическое питание симбионтов тканями их хозяина. Очень близкие показатели δ13C и δ15N у хозяина Antipatharia и симбионта (паразита) Sessilogoga (разница в δ15N в среднем 1.3 ‰) указывает на то, что симбионт может питаться как тканями коралла, так и изымать из гастроваскулярной системы пищу у хозяина (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 6). Развитые колюще-сосущие ротовые конечности могут указывать на это. Представители Sessilogoga - достаточно плезиоморфные (примитивные) аскоторациды, паразитирующие в гастроваскулярной системе антипатарий, но способные выходить наружу через ротовые отверстия зооидов и свободно плавать. Аскоторациды рода Zibrowia – эндопаразиты склерактиниевых кораллов Dendrophyllia и родственны другим эндопаразитам склерактиниевых кораллов рода Petrarca, питание которых было изучено нами ранее для Тайваня. Они также обладают режущими мандибулами и максиллулами и массивными максиллами. Ожидаемо, аскоторациды обоих родов питаются непосредственно тканями кораллов-хозяев. Как и для тайваньского материала, наиболее интересен полученный результат для пары: хозяин -зоантария Palythoa, симбионт - Baccalaureus. Наши результаты показали очень большую изотопную нишу для Palythoa sp., где значения δ13C колеблются от -16 до -11.5‰ и для δ15N от 2.9 до 4.2‰ (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 6 ). Тогда как для паразита Baccalaureus эти значения колеблются от -15.8 до -11.3 ‰ для δ13C и от 3.9 до 8‰ для δ15N. В этом случае нет ясного трофического шага между исследованными колониями Palythoa и обитающими в них паразитами (пары Baccalaureus1/Palythoa1, Baccalaureus2/Palythoa2 и Baccalaureus3/Palythoa3). Так если для пары Baccalaureus2/Palythoa2 мы ещё можем предполагать возможность питания тканями хозяина (сходные значения δ13C и 1.5‰ трофический шаг в значениях δ15N), это крайне маловероятно для пары Baccalaureus1/Palythoa1 (где значение δ13C у паразита более чем на 2‰ ниже, чем у хозяина), и совершенно невероятно для пары Baccalaureus3/Palythoa3 (где значение δ15N паразита более чем на 5‰ выше, чем у хозяина, т.е. значительно больше трофического шага). Такие различия исключают возможность питания паразита тканями хозяина и отражают достаточно широкий спектр пищевых источников для паразита. Эти результаты схожи с теми, что мы получили для Baccalaureus sp. из Тайваня, где паразиты распределяются на две группы с различными трофическими нишами (Kolbasov et al. 2023). Морфология изученных особей, указывает на присутствие не менее двух видов Baccalaureus в малазийском материале (Bidong Island). Тем не менее, структура их ротовых придатков идентична и, как у всех Baccalaureus, характеризуется слаборазвитыми мандибулами, максиллулами и максиллами, непригодными для прокалывания и жевания. Поэтому видовые различия паразитов и хозяев не могут объяснить такие различия в питании между Baccalaureus и зоантариями - хозяевами. Тем не менее, Baccalaureus обитает внутри гастральной полости зоантарий и не имеет другой возможности получать пищу, кроме как из неё. В гастральные полости зоантарий может попадать весьма разнородная пища, включая зоопланктон, икру рыб, личинки морских животных, а также фракции органического вещества (POM - particular organic matter), что даёт разные изотопные подписи δ13C и δ15N у Baccalaureus. Поэтому мы делаем вывод, что Baccalaureus является пищевым оппортунистом и «подворовывает» пищу из гастральной полости хозяев. Palythoa характеризуется наибольшим разбросом значений изотопов среди кораллов-хозяев (от -16 до -11.5 ‰ и от 2.9 до 4.2‰ δ13C и δ15N соответсвенно). Palythoa, в отличие от предыдущих кораллов-хозяев, содержит симбиотические зооксантеллы и получает питание непосредственно от них, а также от фитопланктона (диатомовых водорослей), тогда как «прилов» не нужный для питания зоантарии, может быть использован для питания паразита. Таким образом, остаётся загадкой питание паразита Baccalaureus, а так же сильный разброс в изотопных показателях его хозяина Palythoa. Для решения этой проблемы летом 2023 г. был специально собран обширный материал в Тайване. Материал был отобран на изотопный анализ для установления трофических взаимосвязей, а так же на молекулярно-генетический анализ для выявления межвидовых различий. Так же был произведён повторный отбор склерактиний Turbinaria и их эндопаразитов Petrarca, и склерактиний Dendrophyllia и эндопаразитов Zibrowia для выявления возможных различий между регионами и подтверждения первоначальных результатов. Кроме того, был собран материал по Synagoga (S. arabesque Kolbasov et al., 2019) – примитивной аскоторациде, эктопаразиту антипатарии Myriopathes cf. japonica, родственному Sessilogoga, питание которого не изучалось нами ранее. Паразиты для изотопного анализа отбирались отдельными особями или по несколько штук в зависимости от их размера. Всем отобранным паразитам и их хозяевам были даны условные номера для отслеживания взаимосвязей конкретных пар. Однако для Dendrophyllia и Zibrowia, такого разделения произвести не удалось в связи с малым размером хозяев и паразитов. На изотопный анализ было отобрано 28 проб Baccalaureus из 16 колоний Palythoa. Материал хозяев и по одному экземпляру паразита из соответствующей колонии взяты на молекулярно-генетический анализ для определения видовой принадлежности. Из 13 колоний Turbinaria было отобрано 13 проб Petrarca на изотопный и молекулярно-генетический анализ. Из 7 колоний Antipatharia 5 взяты на изотопный анализ, из которых взято 5 проб Synagoga. Из 6 колоний Antipatharia так же взяты другие организмы в основном на молекулярно-генетический анализ и только 2 краба и одна офиура на изотопный анализ. Отобрано 7 проб Dendrophyllia и 6 проб паразита Zibrowia, из которых 2 пробы хозяина и 2 паразита взяты на молекулярно-генетический анализ. Весь материал был предварительно заморожен (-20 °С) в пластиковых пробирках, далее высушен в течение 3-5 дней при 70°C и перевезен в лабораторию в Москве. Перед анализом образцы были повторно высушены до постоянного веса в течение 3-5 дней при 70°C, перетерты в порошок в ступке и упакованы в оловянную фольгу (по 200-500 микрограмм). Материал находится сейчас в процессе анализа в Центре коллективного пользования при Институте проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН, где он производится с помощью изотопного масс-спектрометра ThermoDeltaVPlus и элементного анализатора ThermoFlash 1112. Ожидаемые результаты Обширный материал хозяев Palythoa (16 колоний) и их соответствующих паразитов Baccalaureus (28 проб) позволят определить природу широкого спектра питания паразитов. Молекулярно-генетический анализ позволит выявить возможные различия (что маловероятно) в питании разных видов Baccalaureus и их хозяев. Так, при наличии одного вида хозяина и паразита, широкий спектр питания может быть связан с различием в питании хозяина и, следовательно, его паразита (при прямом поедании паразитом тканей хозяина). А так же внутривидовое различие в питании паразита может быть не связано с изотопными различиями в тканях хозяев, например при различной доступности организмов попадающих в пищевой тракт хозяина и изъятых из него паразитом. Такие различия могут быть связаны с разным местом обитания хозяина (глубина, особенности местного течения и окружающей среды). При наличии разных видов хозяина и паразита данные могут позволить выявить как межвидовые различия в питании хозяев, так и их паразитов. Первичные выводы о питании Petrarca ее хозяином Turbinaria (Kolbasov et al., 2023) основаны на очень маленькой выборке (по 2 пробы каждого). Таким образом, 13 колоний Turbinaria и 13 проб их соответствующих паразитов Petrarca позволят более достоверно подтвердить такой вывод. Молекулярно-генетический анализ этих образцов, так же позволит исключить наличие межвидовых различий. Сравнение данных, полученных из Малайзии, с данными 7 проб Dendrophyllia и 6 проб паразита Zibrowia из Тайваня, позволит подтвердить первоначальные выводы о питании паразитов, а так же выявить возможные межрегиональные различия, как в питании хозяев, так и их соответствующих паразитов. Нами проведены исследования по изучению морфологии, родственных связей и взаимоотношений с хозяином экзопаразитов морских лилий – примитивных Ascothoracida рода Waginella (Kolbasov Gregory A., Savchenko Alexandra S., Newman William A., Chan Benny K. K. 2021. A new species of Waginella (Crustacea: Thecostraca: Ascothoracida) parasitic on a stalked crinoid from Tasman Sea, with notes on morphology of related genera. Frontiers in Marine Science, 8, 642, DOI: 10.3389/fmars.2021.616001, IF 5.247, Q1). Впервые, с использованием электронной микроскопии (СЭМ), нами была детально исследована тонкая морфология всех видов (4) этого рода. Нами был описан новый вид из Тасманова моря – Waginella ebonita Kolbasov et Newman, 2021, обитающий на глубине 520 метров на морской лилии Metacrinus sp.(см. файл с дополнительной информацией, Рис. 7). Установлено, что все виды Waginella отличаются от своих родственников из других примитивных (генерализированных) родов Ascothoracida (Synagoga и Sessilogoga) по следующим признакам (синапоморфиям): i), ii) уплощённые вентральные края створок карапакса с парой больших передних пор; iii) карапакс покрыт многочисленными сенсиллами; iv) на вентральной стороне карапакса располагается специализированный прикрепительный аппарат, состоящий из батарей одноклеточных секреторных желёз, расположенных в районе прикрепления паразита и заканчивающихся наружной папиллой, и сенсилл и микровиллей, служащих для фиксации на морской лилии; одноклеточные железы секретируют крепящий цемент; v) четвёртый сегмент антеннул с простыми щетинками (не шипами); vi) проксимальный сенсорный вырост антеннул сближен с когтем; vii) обе пары передних решётчатых органов повёрнуты на 60-70° относительно дорсо-медиальной линии карапакса. Таким образом, род Waginella является монофилетическим таксоном даже по признакам ультраструктуры. Присутствие прикрепительного аппарата и его морфология указывают на то, что виды рода постоянно прикрепляются к хозяину, но при необходимости могут открепиться, либо растворив прикрепительный цемент, либо полиняв. Питание этих эктопаразитов происходит через округлое отверстие (10-20 мкм) в скелете морской лилии, которое они просверливают стилетовидными мандибулами, вооружёнными шипами. Примечательно, что новый вид Waginella ebonita был инфицирован криптонисцидными изоподами (Epicaridea). Крупная самка изоподы занимала всю выводковую камеру Waginella (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 7F), очевидно, что она питается эмбрионами хозяина (отсутствовали в выводковой камере). Сходные паразитические изоподы были обнаружены в выводковых камерах 4 особей W. sandersi (Newman, 1974, Grygier, 1983). Вообще, гиперпаразитические изоподы довольно часто обнаруживаются в различных Ascothoracida (Pyefinch, 1939, Newman, 1974, Grygier, 1981b, 1983b, c, 1984, 1985, 1990, Moyse, 1983, Kolbasov, Petrunina, 2018). Вероятно, что занимая всю выводковую камеру и питаясь эмбрионами, самки этих изопод вызывают паразитарную кастрацию. За время выполнения проекта по паразитическим Facetotecta нами получены следующие результаты: Нами опубликована статья, в которой полностью исследовано личиночное развитие паразитических Facetotecta (взрослые стадии не известны), в частности описана детальная морфология всех науплиальных стадий этих ракообразных (Kolbasov, G.A., Petrunina, A.S., Dreyer, N. Prudkovky A.A., Olesen J., Chan B.K.K., Høeg J.T. 2021. Naupliar development of Facetotecta (Crustacea: Thecostraca) and the nature of the first nauplius instar in the Crustacea - pro et contra the Hexanauplia concept. Organisms Diversity and Evolution, 21, 209–230 (2021). https://doi.org/10.1007/s13127-021-00479-y, IF 2.663, Q1). Личиночный материал исследовался на электронных микроскопах (СЭМ и ТЭМ). Нами впервые описаны все 7 науплиальных стадий фасетотект. До наших исследований были описаны только 5 науплиальных стадий Facetotecta (Itô, 1990; Kolbasov, Høeg, 2003). В то же время для представителей класса Thecostraca, как и для Copepoda, изначально характерны 6 науплиальных стадий в личиночном развитии. Текостраки и копеподы часто объединяются в таксон Haxanauplia, находящий поддержку в некоторых молекулярных филогениях (Oakley et al., 2012), и, как следует из названия, характеризующийся 6 науплиальными стадиями. У текострак, у которых описаны 6 науплиальных стадий, первая стадия – всегда непитающийся ортонауплиус (Grygier, 1987; Itô & Grygier, 1990; Kolbasov et al., 2020). Впервые, благодаря нашим исследованиям, удалось не только описать первую науплиальную стадию фасетотект, представляющую непитающегося ортонауплиуса, но и установить наличие 7(!), а не 6 науплиальных стадий в их цикле. Этот факт ставит вопрос правомочности определения таксона Hexanauplia на основе 6 науплиальных стадий. Науплиус 1 фасетотект легко отличается от последующих стадий по наличию гладкой кутикулы без кутикулярных гребней, вздутой задней части тела, лабруму, лишённому пор и папилл, более коротким щетинкам конечностей и отсутствию рудиментов максиллул (ортонауплиус). В отличие от последующих стадий, эта стадия не питается и линяет практически сразу (в течение нескольких часов после поимки, т.к. точное время вылупления неизвестно из-за отсутствия знаний по взрослым стадиям). У последующих стадий кутикула покрыта кутикулярными гребнями, формирующими паттерн из полигональных табличек. Первая науплиальная стадия Facetotecta имеет целый набор признаков, характерных для других первых науплиальных стадий Thecostraca (Ascothoracida и Cirripedia). Так, первые науплиальные стадии Ascothoracida и Cirripedia – непитающиеся ортонауплиусы, покрытые тонкой кутикулой без наружной скульптуры, морфология их придатков носит слегка «инфантильный» характер, т.к. плавательные щетинки конечностей короткие, без развитых сетул, необходимых для фильтрации, лабрум без пор и щетинок, линька кутикулы происходит беспорядочно, без определённых швов, сразу после вымётывания в окружающую среду. Нами проведён сравнительно-морфологический анализ первых науплиальных стадий всех Thecostraca, в результате которого выявлен целый ряд не только общих признаков, перечисленных выше, но и отличий (первые науплиальные стадии Cirripedia и Ascothoracida, выведенные нами в лабораториях на ББС МГУ и Тайване, детально исследовались на сканирующем электронном микроскопе). Так, науплиусы у Thecostraca имеют разную сегментацию конечностей (антеннул, антенн и мандибул). Нами установлено, что науплиальные стадии Facetotecta характеризуются редукцией сегментации и числа щетинок плавательных конечностей в сравнении с науплиусами других текострак и эта редукция может считаться синапоморфией фасетотект. Кроме того, первая науплиальная стадия Facetotecta отличается от аналогичных у Ascothoracida и Cirripedia наличием фронтальных филаментов, тогда как у усоногих и аскоторацид они отсутствуют у науплиуса 1. Как говорилось ранее, особенно интригующим выглядит факт наличия 7 науплиальных стадий в развитии Facetotecta, тогда как для остальных Thecostraca изначально характерны 6 науплиальных стадий в развитии: один ортонауплиус и 5 метанауплиусов (Grygier, 1987; Høeg et al., 2004; Martin et al. 2014). Мы предполагаем, что основной эволюционной тенденцией у текострак и у остальных ракообразных является сокращение числа науплиальных стадий в личиночном развитии. Поэтому довольно трудно представить обратное увеличение числа науплиальных стадий у Facetotecta. Если так, то 7 науплиальных стадий может быть изначальным (ground pattern) для Thecostraca, и термин ‘Hexanauplia’ в данном случае звучит сомнительно. Так или иначе, мы не можем окончательно установить эволюционное значение 7 науплиальных стадий, пока полный жизненный цикл Facetotecta не будет расшифрован. Нами впервые осуществлено комплексное исследование тонкой морфологии циприсовидных личинок Facetotecta (СЭМ, см. файл с дополнительной информацией, Рис. 8, 9), собранных нами в из разных мест Мирового Океана (Азорские острова, Белое море, северо-восточная Камчатка, Курило-Камчатский Глубоководный Желоб, Тайвань) и представляющих несколько разных видов (Gregory A. Kolbasov, Alexandra S. Savchenko, Niklas Dreyer, Benny K. K. Chan, Jens T. Høeg. 2022. A synthesis of the external morphology of cypridiform larvae of Facetotecta (crustacea: Thecostraca) and the limits of the genus Hansenocaris. Ecology and Evolution, 12, 11: 1-21. https://doi.org/10.1002/ece3.9488, IF 3.000, Q1). За время изучения этих ракообразных накоплено довольно большое количество морфологических данных по их Y-циприсам, которые свидетельствуют о большом таксономическом разнообразии этой группы. Так абдомен может состоять из 4 или 2 сегментов, антеннулы могут нести развитый загнутый крюк или быть без него, лабрум может быть развит, с различным вооружением или рудиментарен, сегментация торакоподов различна, морфология карапакса и скульптура тельсона различаются у разных видов и т.д. Эти факты свидетельствуют о том, что Facetotecta включают несколько родов и даже семейств, хотя, до сих пор все известные виды описывались как представители одного рода Hansenocaris. Поэтому одной из задач нашего исследования было на основе детального изучения морфологии определить точные границы рода Hansenocaris и провести формальный кладистический анализ известных видов и форм Facetotecta. Прежде всего, нам удалось определить общие и уникальные признаки для всех Y-циприсов, которые отделяют их от остальных циприсовидных личинок Thecostraca и необходимы для будущих исследований систематики и филогении Facetotecta. Такими признаками являются: i) одностворчатый карапакс в форме перевёрнутой лодки и покрывающий тело только с дорсальной стороны; ii) длинный тельсон с развитой скульптурой из кутикулярных гребней в виде табличек; iii) наличие только пяти тергитов торакса; iv) плевральные выросты двух последних торакомеров; v) уникальные четырёхсегментные антеннулы негомологичные четырёхсегментным антеннулам Cirripedia; vi) особые головные придатки – раздвоенный параокулярный вырост и постокулярный пучок филаментов и vii) шесть пар решётчатых органов. Следует особо отметить, что нами впервые описаны 6 пар решётчатых органов у Facetotecta. Ранее (Høeg, Kolbasov, 2002) у циприсовидных личинок фасетотект, как и для остальных Thecostraca, были описаны 5 пар решётчатых органов (2 передних и 3 задних). Нами впервые была обнаружена дополнительная пара решётчатых органов, располагающаяся сбоку и спереди от остальных передних пар. Эта дополнительная пара присутствует у всех исследованных нами Y-циприсов, но отсутствует у циприсовидных личинок других текострак: Ascothoracida и Cirripedia. Таким образом, 6 пар решётчатых органов – аутапоморфия Facetotecta. Пять пар решётчатых органов могут свидетельствовать об их сегментарной природе, т.к. именно 5 сегментов (изначально для всех Crustacea) входят в состав головного отдела Ascothoracida и Cirripedia, покрытого сверху карапаксом. У Facetotecta первый торакальный сегмент сливается с головой (цефалоторакс) и карапакс покрывает 6, а не 5, сегментов. Этот факт может объяснять наличие 6 пар решётчатых органов у Facetotecta. Несмотря на большое число общих признаков, характерных для Y-циприсов Facetotecta, они различаются по ряду других: i) форма, размер и скульптура карапакса; ii) наличие или отсутствие антеннулярных крюков; iii) форма антеннулярного эстетаска; iv) степень развития лабрума; v) размер ветвей параокулярного выроста; vi) сегментация торакоподов; vii) сегментация, вооружение и орнаментация абдомена и viii) число и строение щетинок фуркальных ветвей. Впервые на основе морфологических признаков Y-циприсов нами был проведён кладистический анализ всех известных видов и форм фасетотект для определения границ рода Hansenocaris s.s. Очевидно, что оптимальным был бы комбинированный анализ филогении, основанный на молекулярных и морфологических данных. Но, к сожалению, молекулярные данные получены только для весьма ограниченного круга представителей Facetotecta, т.к. большинство изученного материала было зафиксировано формалином. Комбинированный анализ филогении будет возможен в будущем, когда будет накоплен значительный массив по молекулярным данным Facetotecta. Для всех описанных видов Facetotecta и Y-циприсов, изученных на СЭМ, нами разработана матрица из 15 морфологических признаков (остальные признаки плохо задокументированы в предыдущих описаниях), исследованная в программе Nexus Data Editor 5.0. Восемь признаков были информативными для анализа парсимонии. Неинформативные признаки представляют собой синапоморфии фасетотект, которые очень важны для понимания их эволюции. Наши данные были проанализированы в программе PAUP 4.0 (Swofford, 1998). Нами реконструированы филогенетические деревья методами «bootstrap 50% majority-rule consensus» и «neighbor-joining». Топология этих деревьев указывает, что виды H. itoi, H. furcifera, H. pacifica, H. papillata и H. spiridonovi образуют монофилетическую кладу, которую можно считать эквивалентной роду Hansenocaris s.s. Таким образом, род Hansenocaris s.s. характеризуется: i) вытянутым карапаксом с округлым передним концом и развитыми кутикулярными гребнями, по крайней мере, в передней части; ii) развитым лабрумом с пятью длинными шипами; iii) антеннулы с крюком, который меньше или сравним по длине со вторым антеннулярным сегментом; iv) параокулярный вырост короче антеннул и с равными дистальными ветвями; v) абдомен четырёхсегментный; vi) тельсон с пильчатыми шипами вдоль заднего края. Другие виды: H. acutifrons, H. rostrata и H. tentaculata должны быть исключены из рода Hansenocaris s.s. Мы предполагаем, что каждый из этих видов представляет отдельный род. За время наших совместных исследований накопился достаточно большой массив данных по различным аспектам биологии ракообразных подкласса Facetotecta (Y-личинок), включая их морфологию, анатомию, развитие, жизненные циклы, распространение, молекулярную генетику и т.д. По этим данным была опубликована статья (Niklas Dreyer, Jørgen Olesen, Mark J. Grygier, Danny Eibye-Jacobsen, Jens T. Høeg, Alexandra Kerbl, Yoshihisa Fujita, Gregory A. Kolbasov, Alexandra S. Savchenko, Katrine Worsaae, Ferran Palero, Benny K. K. Chan. 2023. The biology and life cycle of enigmatic crustacean y-larvae: a review. Oceanography and Marine Biology. An annual review, 61, 81-126. https://doi.org/10.1201/9781003363873-4, IF 8,694, Q1). В этой публикации мы представляем краткий исторический обзор изучения Y-личинок и их систематики, подробно излагаем структурные особенности каждой известной функциональной стадии жизненного цикла (Y-науплиусы, Y -циприс, ипсигон (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 10-12). Мы обсуждаем жизненный цикл Facetotecta с точки зрения филогенетического и экологического контекста и сравниваем его с жизненным циклом других свободноживущих и паразитирующих Thecostraca. Вместе с обобщением того, что известно об экологии и биогеографии Y-личинок, на основе новых полученных данных, мы проверяем конкретные гипотезы, связанные с пространственно-временной динамикой и экологией Y-личинок. Нашей исследовательской группой только в последние годы собрано более 10000 экземпляров личиночных стадий фасетотект из различных мест Мирового океана. Для получения данных нами использовались как классические методы планктонного сбора личинок и исследования на электронных микроскопах, так и методы молекулярного анализа и конфокальной микроскопии (см. раздел «Методы и подходы»). Интересные новые данные были получены по метаморфозу циприсовидной личинки фасетотект в ювенильную червеобразную стадию – ипсигон, индуцированному линочным гормоном 20-hydroxyecdysone, и строению этой стадии. Нахождение экзувиев циприсовидных личинок фасетотект в планктоне (Kolbasov et al., 2021) может свидетельствовать, что в природе метаморфоз происходит в планктоне, т.е. предполагаемые хозяева Facetotecta – плавающие формы. Ипсигон формируется внутри циприсовидной личинки, его эпидермис отделяется от кутикулы циприса и быстро покрывается собственной, очень тонкой кутикулой (<5nm толщиной; см. файл с дополнительной информацией Рис. 10-12). После 31-72 часов, ипсигон начинает медленно изгибаться внутри циприса и постепенно выходит из экзувия кпереди от верхней губы, т.е. как раз в том месте, где предполагается прикрепление антеннулами циприсовидной личинки к хозяину. Вышедший ипсигон обладает очень ограниченной подвижностью, он способен жить более суток (до 72 часов) и даже может несколько раз линять, сбрасывая кутикулу на переднем конце, но, не меняя своей формы. Для сравнения червеобразная инфекционная стадия корнеголовых усоногих Rhizocephala – вермигон никогда не линяет в процессе инфицирования и роста (Glenner 2001). Нами описано разнообразие морфологии ипсигонов от гладких изометрических и вытянутых до яйцевидных (см. файл с дополнительной информацией Рис. 10), что может отражать процесс инвазии различных хозяев. Спереди ипсигоны несут многочисленные мелкие шипы и поры, функция которых не ясна. Под тонкой кутикулой, не имеющей слоёв (эпикутикула), расположен эпителий. По сравнению в вермигоном Rhizocephala, состоящим из 3-4 типов клеток (Høeg 1987; Glenner 2001), ипсигон имеет более сложное внутреннее строение (см. файл с дополнительной информацией Рис. 11, 12). Правда, неясно, какие из этих структур возникли и будут функционировать в самом ипсигоне, а какие остались от циприсовидной личинки (например, сложные глаза) и дегенерируют впоследствии? Возможно, дегенерирующие органы могут служить источником пищи для ипсигона в процессе инвазии. Производные бывшей нервной системы циприса занимают большую часть переднего конца иписигона. Конфокальная микроскопия и ТЭМ показывают наличие большого срединного нейропиле у переднего конца, соответствующего нейритам Y-циприса. Ипсигон содержит пучки дорсальных и вентральных мышц, которые обеспечивают амебоидное движение этой стадии. Такие структуры отсутствуют у вермигона ризоцефал, также способного двигаться. Ипсигон лишён функциональной кишки, но нами обнаружена удлинённая тёмная масса клеток, наполненных жировыми каплями и тянущаяся практически через всё тело, она может представлять остаток пищеварительной системы циприса (хотя, он сам не питается). Сравнение с анатомией инвазивных стадий Rhizocephala (Høeg 1985, 1987; Glenner 2001) показывает, что эти клетки не являются зачатками ооцитов и, таким образом, ипсигон не представляет взрослую стадию фасетотект. Эти липидосодержащие клетки могут выполнять функцию питательных веществ пока ипсигон не развился во взрослую питающуюся стадию. По данным молекулярного анализа нами установлено, что одновременно (в течение нескольких дней) в планктоне в определённом месте может присутствовать до 23 (Тайвань) или даже 40 (южная Япония) видов фасетотект. Этот факт вызывает вопрос: кто может быть их хозяином? Особенно для лецитотрофных личинок, жизненный цикл которых умещается в одну неделю (у планктотрофных до 3 месяцев в северных широтах – Белое море). В этом случае хозяева должны обитать непосредственно в том месте, где собраны лецитотрофные личинки. Если фасетотекты действительно паразиты и обладают специфичностью к хозяевам (а морфология циприсов и ипсигонов может на это указывать), то перманентно в таком месте должны присутствовать множество инфицированных особей хозяев, причём разных видов. Наши данные свидетельствуют, что Y-личинки распространены в основном в прибрежных водах. Предположительно паразитические взрослые стадии могут воздействовать на аквакультуру, как скрытые паразиты, пока не идентифицированные нами. Довольно часто личиночные стадии фасетотект попадаются в единичных экземплярах, а в случае множественных находок в одной пробе трудно определить к одному или нескольким видам принадлежат личинки? Международная команда учёных при нашем участии подготовила статью по данному вопросу, которая будет опубликована в конце 2023 - начале 2024 годов (Dreyer N., Olesen J., Grygier M.J., Eibye-Jacobsen D., Savchenko A.S., Fujita Y., Kolbasov G.A., Machida R.J., Chan B.K.K., Palero F.P. Novel molecular resources for single-specimen barcoding of enigmatic crustacean y-larvae. Invertebrate Systematics, IF 2.2, Q1, in press, accepted). Нами были разработаны специальные протоколы, работающие на одной особи и позволяющие получать данные по сиквенсам и сохранять при этом ваучерный экземпляр (экзувий). Чтобы повысить специфичность и успех амплификации, мы стремились разработать более длинные (> 20 п.н.) праймеры с содержанием GC от 30 до 60%. Мы протестировали в общей сложности 28 пар праймеров (23 новых) и провели с ними 2056 ПЦР-реакций. Нашей целью было разработать и проверить эффективность быстрых «безфильтровых» методов выделения ДНК, позволяющих получать сиквенсы из единичной особи, сохраняя при этом их «экзувии» в виде ваучеров. Нами применялся метод экстракции ДНК с использованием набора GeneReleaser® (BioVentures, Теннесси, США), который ранее доказал свою эффективность при извлечении ДНК из зоопланктона (Schizas et al., 1997; Böttger-Schnack and Machida, 2011) и упрощенный метод DNeasy с использованием набора реагентов из набора Blood and Tissue (QIAGEN, Калифорния, США). Мы выделили ДНК в общей сложности 421 экземпляра для каждой личинки, из которых девять были с Азорских островов, 326 с острова Сесоко (Япония), 4 из Малайзии, 105 из разных мест на Тайване и 17 из Белого моря (Россия). Все реакции ПЦР проводили в термоциклере DNA Engine (Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США), а продукты ПЦР визуализировали в агарозном геле с различными концентрациями в зависимости от размера фрагмента. Секвенирование ДНК проводили компании Genomics BioSci & Tech Ltd. (Нью-Тайбэй, Тайвань) и Macrogen Europe BV (Амстердам, Нидерланды). Мы секвенировали матрицы геномной ДНК трех рибосомных локусов (митохондриальный 16S и ядерный 18S, 28S) и двух белок-кодирующих генов (митохондриальный COX1 и ядерный H-3) из 74 образцов и добавили новые последовательности в NCBI GenBank. Благодаря нашим исследованиям разработан и протестирован набор новых праймеров для ядерных и митохондриальных белок-кодирующих и рибосомальных генов, которые могут быть использованы для оценки биоразнообразия и филогении Facetotecta. Разработанная новая процедура поможет разгадать сложную систематику Y-личинок и покажет, как развивались эти удивительные личиночные формы. Более того, мы полагаем, что наши протоколы должны работать на образцах личинок самых разных таксонов линяющих морских беспозвоночных. По паразитическим Rhizocephala нами были получены следующие результаты: В ходе выполнения гранта впервые был описан характер взаимодействия корнеголовых ракообразных из группы «Akentrogonida» с нервными ганглиями хозяина на примере вида Diplothylacus sinensis паразитирующего на крабе-плавунце Portunus pelagicus (Miroliubov A, Lianguzova A, Waiho K, Fazhan H, Gusti-Afiz GRN. 2023. Histological description of specialized rootlets of the akentrogonid rhizocephalan Diplothylacus sinensis (Keppen, 1877) (Thompsoniidae) invading nervous ganglia of the blue swimming crab Portunus pelagicus. Zoologischer Anzeiger 303:33–37. DOI: 10.1016/j.jcz.2023.01.006, IF 1.4, Q1). В ходе полевых работ в Малайзии, на побережье Южно-Китайского моря, в провинции Джохор были собраны крабы Portunus pelagicus (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 13-15), зараженные корнеголовым ракообразным Diplothylacus sinensis (Keppen, 1877) (сем. Thompsoniidae). D. sinensis относится к относительно слабо изученной группе «Akentrogonida». Наши исследования были направлены на выявление наличия связи столонов паразита D. sinensis с нервной системой хозяина. Явление прямого взаимодействия столонов корнеголовых ракообразных было ранее описано на ряде видов, относящихся к группе «Kentrogonida» (Nielsen, 1970; Payen et al., 1981; Miroliubov et al., 2020; Lianguzova et al., 2021). У большинства представителей базальных семейств (Peltogastridae, Peltogasterellidae, Sacculinidae) были обнаружены специализированные столоны, проникающие в толщу нервной ткани хозяина. При этом дистальные участки этих столонов модифицированы в бокаловидные органы. У корнеголовых из сем. Polyascidae бокаловидные органы, по-видимому, были утрачены; вместо них в нейропиле ганглия расположены многочисленные тонкие столоны. И бокаловидные органы, и тонкие столоны предположительно играют решающую роль в регуляции паразито-хозяинных отношений (Miroliubov et al., 2020; Lianguzova et al., 2021). Следует отметить, что семейство Polyascidae является сестринской кладой к эволюционно продвинутой группе «Akentrogonida» (Høeg et al., 2020; Chan et al., 2021). Взаимодействие «акентрогонид» с нервной системой хозяина до настоящего времени оставалось неизученным вовсе. При этом считается, что акентрогониды гораздо слабее воздействуют на своих хозяев, чем кентрогониды. Вскрытие зараженных хозяев проводилось с использованием стереомикроскопа в морской воде. Нервные ганглии вентральной ганглиозной массы хозяина были зафиксированы в жидкости Буэна. Затем объекты были заключены в парафиновые блоки по стандартной гистологической методике. Срезы толщиной 5 мкм были изготовлены с использованием ротационного микротома Lieca RM 2555. В дальнейшем срезы были окрашены полихромным красителем по Маллори (фуксин, фосфорномолибденовая кислота, оранж G, анилиновый синий). Многочисленные столоны D. sinensis проникают в нервную ткань ганглиев вентральной ганглиозной массы крабов P. pelagicus. Кроме того, столоны были обнаружены также и в нервных стволах, отходящих от самих ганглиев. Дистальные части этих столонов не преобразованы в бокаловидные органы. Столоны D. sinensis, расположенные в нервной ткани краба, значительно отличаются от таковых столонов представителей группы «Kentrogonida». Помимо этого, эти столоны сами по себе демонстрируют выраженный полиморфизм. Мы обнаружили как минимум четыре разных типа столонов, различающихся по своей тканевой организации (см. файл с дополнительной информацией, Рис. 14, 15). Столоны первого типа покрыты тонкой кутикулой, под которой залегает один слой гиподермы, а в центре столона расположен центральный канал. В столонах второго типа присутствует обширное субкутикулярное пространство, которое заполнено гомогенным содержимым, окрашивающимся синим цветом при окраске препаратов по Маллори. В этом субкутикулярном пространстве встречаются округлые пустоты. Слой гиподермы залегает под обширным субкутикулярным пространством; центральный канал практически не выражен, а его полость заполнена отдельно лежащими клетками. У столонов третьего типа субкутикулярное пространство также очень обширно. У этих столонов отсутствуют какие-либо выраженные слои клеток, клетки хаотично лежат в гомогенном матриксе, продолжении субкутикулярного пространства. Центральный канал полностью отсутствует. Четвертый тип обнаруженных столонов характеризуется наличием выраженного гиподермального слоя, небольшим объёмом субкутикулярного пространства и множеством гранул, вероятно, секреторной природы. При этом мы обнаруживали и переходные формы между указанными выше типами столонов. Скорее всего, в данном случае обнаруженный полиморфизм обусловлен не дискретными типами столонов, а последовательным изменением гистологической организации по ходу столона. Так же в ходе экспедиции на остров Тайвань был собран представитель рода Polyascus. С помощью использования генетических маркеров 18S и COI удалось установить, что этот экземпляр группируется с последовательностями, соответствующими виду Polyascus plana в Генбанке. В стенке столонов интерны этого экземпляра были обнаружены звездчатые мышечные элементы. Кроме того, на рыбном рынке были обнаружены четыре экземпляра крабов Plagusia squamosa зараженных корнеголовым ракообразным предположительно принадлежащем семейству Sacculinidae. Для более точного установления видовой принадлежности требуется провести дополнительные исследования молекулярных маркеров, которые проводятся в настоящее время. После этого запланировано изучение анатомии этого паразита.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".