ИСТИНА

Проект посвящен определению механизмов действия перспективных эпигенетически активных противоопухолевых соединений полифенолов и кураксинов на структуру хроматина (на уровне нуклеосом и хроматосом), а также механизмов модуляции функциональной активности про-опухолевого фактора FACT и фактора PARP1 этими соединениями.

Many synthetic chemotherapy drugs used in oncology are highly toxic and cause complications, which requires the identification of new antitumor compounds that, in combination with classical chemotherapy drugs, can reduce the side effects of treatment. Such compounds, as shown by a number of studies, include curaxins and plant metabolites polyphenols. Many curaxins and polyphenols exhibit epigenetic activity and are able to affect the functioning of target proteins in cancer therapy, such as pro-tumor factor FACT and poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1). Despite the transition of polyphenols and curaxins to preclinical and clinical studies, detailed studies of the effect of these compounds on the structure of chromatin have not been conducted. Such studies are also relevant for establishing the molecular mechanisms of action of these compounds. This project is aimed to determine the molecular mechanisms of action of promising epigenetically active antitumor compounds polyphenols and curaxins on chromatin structure (at the level of nucleosomes and chromatosomes), as well as the mechanisms of modulation of the functional activity of the pro-tumor factor FACT and PARP1 by these compounds. The study of these mechanisms will be carried out for the first time; it is necessary to understand the role of these compounds in the epigenetic regulation of gene expression. These studies may contribute to the further development of new strategies for the therapy and prevention of cancer. The project is aimed to establish the effects of polyphenols and curaxins on chromatin structure by analyzing the effect of a number of compounds (genistein, resveratrol, quercetin, epigallocatechin gallate (EGCG), kaempferol, fisetin, apigenin and curaxin CBL037) on the structure of nucleosomal DNA in mononucleosomes and chromatosomes. Dynamics and reversibility of binding of these factors to mononucleosomes and chromatosomes will also be determined. The effects of curaxines and polyphenols on chromatin structure and protein factor PARP1 function will be determined. Structural rearrangements in nucleosomes will be revealed under the combined action of PARP1 and polyphenols, as well as curaxin CBL037. Dynamics of formation of PARP1-nucleosome complex and its dissociation in the presence of NAD+ will be investigated . Structural rearrangements in mononucleosomes and chromatosomes occurring under the joint action of FACT and polyphenols will be studied. Using the capabilities of the infrastructure facility of the Center for Collective Use of the IBCh RAS 2020 (CKP IBCh 2020) (TIRF microscopy system with sensitivity at the level of single molecules), the temporal dynamics of structural rearrangements in nucleosomes under the influence of various factors (curaxine CBL0137, polyphenols, protein factors FACT and PARP1) will be determined. The studies will be conducted using fluorescence microscopy of single molecules and their complexes based on Förster resonance energy transfer (FRET), specialized electrophoretic techniques (gel-shift analysis using FRET microscopy in gel), DNA footprinting and other biochemical methods of analysis. The scientific novelty of the project is determined by the fact that most of the tasks of the project are important and new. They will be solved using mostly up-to-date approaches and new functional models in vitro, reproducing key aspects of the action of curaxins, polyphenols, and factors FACT and PARP1 in vivo. The fulfillment of the tasks set in the project will allow for the first time to establish the dynamic aspects of the interaction of the PARP1 and FACT factors with chromatin and to determine the mechanisms of action of curaxins and polyphenols at the level of nucleosomes and chromatosomes, as well as the mechanisms of modulation of the functional activity of the pro-tumor factor FACT and PARP1 by these compounds. This will make it possible to identify promising candidates for use in antitumor therapy among the studied low-molecular compounds. Thus, the solution of the tasks set in the project will facilitate the introduction of new effective anticancer agents into practice and the development of new compounds based on the established mechanisms of their action. The increased diversity of anticancer drugs is of great importance for the development of personalized and preventive medicine.

В рамках проекта будут определены молекулярные основы функционирования перспективных противоопухолевых соединений полифенолов и кураксинов и их взаимодействия с многофункциональными белковыми факторами PARP1 и FACT в хроматине на уровне нуклеосом и хроматосом. Полученные данные позволят: (1) определить структуры хроматосом, содержащих линкерные гистоны Н1.0 и Н1.5, и охарактеризовать их отличия; (2) определить структуры комплексов факторов PARP1 и FACT с хроматосомами; (3) определить эффекты семи различных полифенолов и клинически важного кураксина CBL0137 на структуру нуклеосом и хроматосом; (4) определить эффекты этих соединений на структуры комплексов факторов PARP1 и FACT с нуклеосомами и хроматосомами и (5) предложить детальные модели действия кураксинов и полифенолов на структуры нуклеосом, а также модели FACT- и PARP1-опосредованного ремоделирования нуклеосом в присутствии кураксинов и полифенолов. С использованием ОИ ЦКП ИБХ 2020 будут реализованы методические подходы, которые позволят осуществить анализ конформационной динамики нуклеосом на уровне одиночных частиц и их комплексов с PARP1, FACT, кураксином CBL0137 и полифенолами. Полученные в проекте результаты существенно расширят понимание механизмов эпигенетической активности перспективных противоопухолевых агентов кураксинов и полифенолов, связанных с реорганизацией структуры нуклеосом и хроматосом, а также комплексов нуклеосом и хроматосом с фактором FACT и ферментом PARP1 (мишенями действия противораковых соединений). Результаты проекта будут служить научным заделом, обеспечивающим поддержку разработки новых недорогих и безопасных противоопухолевых лекарств для комбинированной терапии и профилактики онкологических заболеваний на основе широко распространенных природных растительных полифенолов. Результаты проекта будут соответствовать мировому уровню и обеспечат значимый вклад в последующую разработку новых фармакологических подходов для персонифицированной профилактики и лечения онкологических заболеваний на основе многообразия противоопухолевых средств с детально изученными мишенями и механизмами действия (согласно направлению Н3 Стратегии НТР РФ).

Научный коллектив имеет существенный научный задел по проекту. В основе задела лежат рабочие модели и гипотезы, предложенные в наших недавних высокорейтинговых публикациях. Предложена модель структурных перестроек в хроматине при взаимодействии с фактором FACT дрожжей и «универсальный» механизм разворачивания нуклеосом факторами FACT дрожжей и человека. Обнаружено связывание FACT человека с нуклеосомами в присутствии кураксина CBL0137 (n-траппинг, trapping), которое сопровождается обратимыми изменениями нуклеосомной структуры без потери коровых гистонов. Установлено, что кураксин CBL0137 ингибирует связывание фактора FACT человека с генами, транскрибируемыми РНК-полимеразой II, что приводит к снижению FACT-зависимой транскрипции этих генов, при этом соединение не влияет на каталитическую активность РНКП II. Обнаружена хроматин-модулирующая активность PARP-1, которая не зависит от каталитической функции белка и проявляется при взаимодействии неактивированного PARP-1 c нуклеосомой в разворачивании коровой части и сближении линкерных участков. Обнаружено, что ряд ингибиторов PARP-1 способны вызывать заякоревание (trapping) PARP-1 на нуклеосомах, что является механизмом, усиливающим противоопухолевый эффект соединений. Продемонстрировано, что мононуклеосомные субстраты могут быть успешно использованы для выявления ингибирующей активности соединений с неизвестным механизмом действия по отношению к PARP-1 и FACT. Начата работа по исследованию влияния природных полифенолов (госсипола) на структуру нуклеосом методами spFRET-микроскопии. При выполнении проекта будут использованы уникальные разработанные нами за последние годы исследований специализированные экспериментальные системы из высокоочищенных белков, методические подходы, экспериментальные протоколы и программы для анализа данных.