![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Выяснить аспекты межклеточной коммуникации, играющие ключевую роль в развитии ожирения и диабета 2 типа, выяснить, как изменяются эти механизмы при метаболически здоровом ожирении и в тканях, полученных от доноров с сахарным диабетом второго типа.
Adipose tissue is an endocrine organ that regulates metabolic processes throughout the body. It plays an important role in the regulation of glucose metabolism and energy metabolism. Adipose tissue is constantly renewed and contains stem/progenitor cells (mesenchymal stem cells, MSCs). Dysregulation of the processes of renewal and differentiation of cells in the adipose tissue lead to its hypertrophy and, as a consequence, loss of sensitivity to hormonal and secreted paracrine stimuli, which is associated with obesity, type 2 diabetes mellitus, arterial hypertension and many other socially significant diseases. According to our hypothesis, the decrease in the efficiency of self-renewal of adipose tissue is based on disturbances in the processes of intercellular communication between its cellular components (adipocytes, MSCs, vascular cells). This project is focused on the study of the fundamental mechanisms of intercellular communication between the components of adipose tissue in health and during the development of insulin resistance. Within the framework of this project, various aspects of the interaction of cells with the help of soluble signaling molecules, their role in the regulation of cells associated with heterologous sensitization of receptors will be examined, the hypothesis of the existence of specialized regulatory subpopulations in the composition of adipose tissue, the disruption of which may be associated with the development of insulin resistance, will be tested. In addition, the mechanisms of contact interactions of stromal cells that play a key role in the regulation of adipogenic differentiation, as well as the mechanism of information transfer between cells using extracellular vesicles and the role of the adiponectin-T-cadherin signaling system in the initiation of the secretion of extracellular vesicles will be described in detail. To elucidate the aspects of intercellular communication that play a key role in the development of obesity and type 2 diabetes, it will be elucidated how these mechanisms change in metabolically healthy obesity and tissues obtained from donors with type 2 diabetes mellitus
Ожидаемые конкретные результаты по годам. 2021 Роль регуляторных субпопуляций в контроле дифференцировки клеток жировой ткани будет впервые изучена на примере следующих популяций-кандидатов: 1) субпопуляция, препятствующая спонтанной адипогенной дифференцировке в жировой ткани, описанная Schwalie и соавторами (Schwalie 2018, Nature), состоящая из CD142+ABCG1+ клеток 2) субпопуляция клеток, несущая на поверхности инсулиновый рецептор. Согласно нашим предварительным данным, в популяции МСК, выделенных из жировой ткани 86% клеток экспрессируют рецепторы к инсулину, тем не менее менее 2% клеток экспонируют данный рецептор на своей поверхности. Более того, согласно нашим предварительным экспериментам, удаление данной субпопуляции клеток значительно снижает способность культуры МСК к адипогенной дифференцировке. 3) субпопуляция, обогащенная рецептором адипонектина 2 типа и метадгерином, которая характеризуется повышенной продукцией адипокинов, согласно нашим предварительным данным, полученным путем независимой обработки массивов данных single cell RNAseq, взятых из открытых баз данных, статей Burl et al., CellMetab, 2018 и Liu et al., SciData, 2019. Будет впервые проведен анализ представленности этих субпопуляций у доноров перечисленных выше групп, затем будут проанализированы параметры адипогенной дифференцировки (скорость, доля клеток с липидными каплями, экспрессия генов, характерных для разных этапов дифференцировки) клеток этих субпопуляций по сравнению с общей популяцией МСК или популяций, из которых были удалены целевые субпопуляции. Будут получены результаты относительно продукции адипонектина и экспрессии Т-кадгерина этими клетками. Будут получены результаты по сравнению эффективности протекания гетерологической сенситизации в регуляторных субпопуляциях и МСК, деплетированных на них. 2022 Будут впервые получены результаты относительно роли паракринных сигналов и контактных взаимодействий клеток малых регуляторных субпопуляций, выделенных и охарактеризованных на предыдущем этапе проекта, в контроле адипогенной дифференцировки остальной популяции МСК. Будут получены результаты относительно вклада этих механизмов в регуляцию адипоцитарной дифференцировки МСК, будут выявлены паракринные факторы и микроРНК, опосредующие паракринные взаимодействия клеток. Будут впервые получены данные о вкладе экзосом, продуцируемых клетками, несущими Т-кадгерин в ответ на адипонектин, в регуляцию адипоцитарной дифференцировки МСК. 2023 Будут получены результаты относительно транскрипционного профиля выявленных регуляторных субпопуляций, в том числе будут выявлены специфические сигнальные каскады и микроРНК, опосредующих регуляторную функцию этих клеток. Будут получены данные относительно тканевого распределения этих клеток в жировой ткани. Будут получены доказательства участия выбранной субпопуляции в поддержании эндокринной функции жировой ткани.
Грант носит в значительной степени фундаментальный характер, но полученные результаты, касающиеся выявленных в жировой ткани регуляторных субпопуляций стволовых клеток позволят предложить новые подходы контролируемого использования стволовых клеток для регуляции метаболического состояния жировой ткани. Кроме того, полученные данные позволят предложить подходы по использованию в терапевтических целях секретома не всей популяции МСК, а функционально гомогенных групп клеток, что существенно повысит контролируемость и предсказуемость получаемых результатов Результаты проекта вошли в курс лекций "Внутриклеточная сигнализация", читаемый в магистратуре Регенеративная медицины и в спецкурс "Биомедицина и внутриклеточная сигнализация", читаемый на 6 курсе отделения фармация факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, а также в спецкурс "Молекулярная эндокринология", читаемый на кафедре биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Кроме того, результаты, полученные в рамках выполнения этого гранта, были представлены школьникам 8-10 медицинских классов в рамках курса дополнительного образования в школе №1420 г. Москвы.
В процессе выполнения проекта мы оценили свойства различных субпопуляции МСК, которые по разным данным, могли претендовать на роль паракринных регуляторов функциональной активности МСК. Мы нашли две малые субпопуляции МСК, которые регулируют функциональную активность остальных МСК за счет продукции паракринных факторов. Обе эти субпопуляции клеток, как мы показали в процессе выполнения гранта, регулируют гормональную чувствительность МСК. Первая субпопуляция - это МСК, постоянно экспрессирующие на своей поверхности инсулиновый рецептор. Эти клетки активируют адипогенную дифференцировку других МСК путем повышения их чувствительности к инсулину - гормону-индуктору адипогенного направления дифференцировки. Представленность этих регуляторных клеток сильно варьирует от ткани к ткани, но выявляются некоторые закономерности: чем выше пластичность ткани относительно адипогенной дифференцировки, тем выше представленность этих клеток в ткани. Так, наибольшую представленность этих регуляторных клеток мы обнаружили в популяции МСК, выделенных из жировых депо молочных желез. В МСК из подкожной жировой ткани этих клеток больше. чем в МСК из висцерального жира. Это хорошо соотносится с тем, что ключевой функцией висцерального жира является не запасание жира в ответ на положительный энергетический баланс в организме, а защита внутренних органов. Соответственно, в висцеральном жире адипогенез происходит в норме только для текущего обновления ткани. Наименьшая представленность этих клеток в надкостнице, в которой в норме не происходит дифференцировки в адипогенном направлении. Мы показали паракринную природу взаимодействия этих регуляторных клеток с другими МСК, изучили состав их секретома. По спектру экспрессируемых мРНК мы выяснили, что эти регуляторные клетки относятся к группам фибробластов и муральных клеток, но не покоящихся МСК, находящихся в базальном состоянии. Мы показали, что эти регуляторные клетки не влияют на принципиальную способность к адипогенной дифференцировке других клеток, но паракринно индуцируют их чувствительность к инсулину. Основная масса клеток популяции МСК не несет на своей поверхности инсулинового рецептора, но способны к адипогенной дифференцировке, если индуциирвать ее в обход инсулинового рецептора прямым воздействием на мастер-регулятор этого направления дифференцировки PPARg. Кроме того, клинически используемый агонист ГПП1 рецепторов лираглутид частично имитирует действие ИР+ клеток: повышает вероятность адипогенной дифференцировки ИР- клеток. Вторая регуляторная субпопуляция, которую мы обнаружили и описали в процессе выполнения гранта, это МСК, экспрессирующие на своей поверхности бета3-адренорецепторы. Эти клетки воспринимают действующий на популяцию МСК норадреналин (или адреналин) и паракринным образом повышают чувствительность других клеток (сенситизируют) к тому же норадреналину. Однако другие клетки, чувствительность которых повышается, реагируют на этот гормон уже не через бета-адренорецепторы/цАМФ, а через альфа1А-адренорецепторы/кальциевый сигнальный каскад. Это явление сенситизации, как мы показали на предыдущих этапах выполнения данного гранта, повышает контрактильные свойства МСК и индуцирует их дифференцировку в направлении контрактильных муральных клеток/перицитов. Мы показали паракринную природу взаимодействия этих регуляторных клеток с другими МСК, изучили состав их секретома. По спектру экспрессируемых мРНК мы выяснили, что эти регуляторные клетки относятся к группам фибробластов, муральных клеток и небольшой группы клеток, отличающихся повышенной экспрессией генов окислительного фосфорилирования, дыхательной цепи и в целом аэробного метаболизма, но не покоящихся МСК, находящихся в базальном состоянии. При деплеции этих клеток популяция МСК теряет способность сенситизироваться в ответ на действие норадреналина. Эта способность возвращается при контактном или бесконтактном сокультивировании регуляторных бета3-адренорецептор-положительных клеток с остальными клетками популяции МСК.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 30 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Механизмы межклеточной коммуникации в поддержании гомеостаза и регуляции обновления жировой ткани |
Результаты этапа: Был произведен набор доноров, удовлетворяющих критериям выборки в три экспериментальных группы: 1) Доноры с нормальным индексом массы тела и отсутствием сахарного диабета 2 типа и преддиабета - контрольная группа; 2) Метаболически здоровые доноры, обладающие повышенным индексом массы тела, но не демонстрирующие нарушения углеводного обмена и сахарного диабета 2 типа - группа Метаболически здоровое ожирение; 3) Доноры, обладающие повышенным индексом массы тела и установленной инсулинорезистентностью и сахарным диабетом 2 типа - группа Патологическое ожирение. Основные характеристики доноров, набранных нами и вошедших в данное исследование, приведены в Табл. 1. МСК, выделенные из жировой ткани этих доноров, заморожены, благодаря чему мы сможем использовать их на протяжении данной работы. МСК доноров трех экспериментальных групп были охарактеризованы по их способности осуществлять гетерологическую сенситизацию адренорецепторов, которая лежит в основе регуляции гормональной чувствительности МСК и выбора их направления дифференцировки. Как мы ранее показали, повышение чувствительности МСК к действию норадереналина (гетерологическую сенситизацию) могут индуцировать два гормона-регулятора адипогенной дифференцировки норадреналин и серотонин. Мы проверили, существует ли корреляция уровня гетерологической сенситизации, индуцируемой этими гормонами, и индекса массы тела (ИМТ) донора МСК. Как показано на Рис 1, такой корреляции не выявляется. С другой стороны, инсулинорезистентные доноры проявляют существенно пониженную способность к гетерологической сенситизации как в ответ на норадрналин, так и на серотонин (Рис. 2). Среднее значение уровня гетерологической сенситизации у клеток метаболически здоровых доноров составляет порядка 2, тогда как для МСК инсулинорезистентных доноров этот показатель не превышает значения 1,5. С другой стороны, уровень гетерлогической сенситизации сильно варьирует от донора к донору, как видно из Рис. 1. Значения уровня гетерологической сенситизации некоторых здоровых доноров, как с высоким ИМТ, так и с низким, соответствует таковому для инсулинорезистентных доноров, что может свидетельствовать о том, что МСК пациентов, больных сахарным диабетом 2 типа, проявляют гетерологическую сенситизацию на уровне, сравнимом с МСК, выделенных из здоровых пациентов. В рамках выполнения этой задачи гранта мы выяснили молекулярные механизмы развития гетерологической сенситизации в популяции метаболически здоровых доноров, страдающих ожирением. Эта часть работы вошла в статью, находящуюся в настоящее время в журнале на рецензировании. Результаты представлены на Рис 3-4. Как мы выяснили, гетерологическая сенситизация в ответ на норадреналин и серотонин индуцируется Gs/цАМФ-ассоциированными рецепторами, бета3-адренорецепторами и HTR6-серотониновыми, соответственно. При этом норадреналин индуцирует повышение уровня альфа1А-адренорецепторов посредством протеинкиназа А-зависимых цитоплазматических механизмов, тогда как серотонин активирует экспрессию гена рецептора CREB-зависимым путем. Далее мы сравнили МСК, выделенных из доноров трех групп, по их способности к адипогенной дифференцировке. Мы показали, что клетки, полученные от доноров с инсулинорезистентностью, демонстрируют значительно сниженный адипогенный потенциал. По прошествии 21 дня адипогенной дифференцировки в популяции МСК, полученных из метаболически здоровых доноров, регистрируется большое количество клеток, несущих жировые капли, окрашивающиеся красителем Nile Red (Рис.5 А, Б). С другой стороны, МСК из жировой ткани доноров с инсулинорезистентностью демонстрируют значительно меньшее количество клеток, накопивших жировые капли. Более того, многие клетки, содержащие жировые капли, демонстрируют фенотип, значительно отличающийся от классического фенотипа адипоцитов (Рис.5 В, Д). Высокий индекс массы тела и наличие состояния инсулинорезистентности кумулятивно снижают эффективность адипогенной дифференцировки МСК (Рис 5Е). Сходные результаты наблюдаются и при анализе динамики экспрессии генов маркеров адипогенеза в процессе дифференцировки клеток, полученных от метаболически здоровых и от инсулинорезистентных доноров. Несмотря на сходные уровни экспрессии адипонектина и PPARg в обоих группах до индукции дифференцировки, в процессе адипогенеза уровень их экспрессии в клетках от здорового донора повышается значительно сильнее, чем в клетках от инсулинорезистентного (Рис.6). Мы также сравнили скорость адипогенной дифференцировки МСК доноров, выделенных из пациентов различных метаболических групп. Мы измеряли скорость накопления клеток с жировыми каплями в выбранных полях зрения в динамике. Мы обнаружили (Рис 7), что МСК из донора, страдающего ожирением с метаболически-здоровым фенотипом, дифференцируются медленнее, чем МСК здорового худого донора, тогда как МСК инсулинорезистентного донора вообще практически не дифференцируются, что соответствует результатам, полученным другими методами. Мы описали субпопуляцию МСК по экспрессии на их поверхности CD142 и ABCG1. Оказалось, что МСК человека не проявляют гетерогенности по поверхностным маркерам CD142 и ABCG1, практически 100% клеток популяции МСК человека экспрессируют эти белки на своей поверхности (см Рис 8-9). Экспрессия CD142 и ABCG1 не зависела от того, к какой метаболической группе относится донор-источник МСК: экспрессия CD142 и ABCG1 в популяции МСК была одинаковая как у метаболически здоровых худых и полных доноров, так и у страдающих инсулинорезистентностью. Стоит заметить, что тип регуляторных клеток A-reg был описан только на мышах. Предпринятые параллельно с нами попытки выявить эти клетки в составе жировой ткани человека также не привели к удовлетворительным результатам (Ferrero, et al., Trends in Cell Biology 2020). Таким образом, мы посчитали нецелесообразным производить дальнейшее изучение субпопуляции, характеризующейся экспрессией CD142 и ABCG1, поскольку эти маркеры в клетках человека не показывают специфичности. Мы описали субпопуляцию МСК по экспрессии на их поверхности MTDH и AdipoR2. Данные потенциальные маркеры регуляторной субпопуляции мы выявили путем самостоятельной обработки данных single-cell RNAseq (scRNAseq) стромально-васкулярной фракции жировой ткани мышей, в которых было индуцировано образование бежевых адипоцитов в белой жировой ткани. Мы обработали массивы, выложенные в открытый доступ при помощи программных пакетов Cell Ranger и Loop Browser 5.0. В результате индуции побурения жировой ткани образуется субпопуляция клеток, характеризующихся экспрессией метадгерина (Mtdh) и адипонектинового рецептора 2 типа (AdipoR2) (Рис 10) и несколькими фенотипическими особенностями. Во-первых, эти клетки экспрессируют целый ряд мРНК белков, характерных для адипоцитов: адипонектин (Adipoq), перилипин (Plin), белок, связывающий жирные кислоты 4 типа (Fabp4) (Рис 11). Учитывая, что адипоциты были удалены из суспензии клеток перед их пропусканием через прибор scRNAseq, можно заключить, что это преадипоциты, появившиеся при индукции побурения. Во-вторых, клетки этой субпопуляции характеризуются повышенной экспрессией мРНК белков катаболического пути: глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназа (Gapdh), пируватдегидрогеназы, цитрат-синтазы (Cs) (Рис 12). Это может означать, что эти клетки активно катаболизируют глюкозу, что может быть связано как с тем, что эти клетки активно синтезируют жирные кислоты для накопления триглицеридов, так и то, что эти клетки активно делятся и синтезируют мембранные липиды и секретируемые белки, что может быть связано с их секреторной функцией. При этом эти клетки не отличаются повышенной экспрессией мРНК других белков, которые, как мы предполагаем, могут отличать регуляторные субпопуляции: нестина (Nes), Т-кадгерина (Cdh13), инсулинового рецептора (InsR) (Рис 13). Мы провели цитометрический анализ субпопуляции, экспрессирующей MTDH и AdipoR2. Если MTDH выявлялся на поверхности достаточно большой доли клеток, то AdipoR2 – не во всех клетках и на небольшой доле популяции (Рис 14). Двойная окраска на два маркера позволила нам выделить небольшую фракцию клеток, которые мы описали по их способности к развитию гетерологической сенситизации и адипогенной дифференцировке. Анализ способности клеток, экспрессирующих MTDH и AdipoR2, проявлять гетерологическую сенситизацию показал, что у метаболически здоровых худых доноров разделение популяции МСК на клетки, экспрессирующие MTDH и AdipoR2 и негативные по этим маркерам привело к исчезновению явления гетерологической сенситизации в обоих типах клеток. В то же время, для донора, страдающего ожирением без сахарного диабета 2 типа, клетки MTDH+/AdipoR2+ сохранили способность к гетерологической сенситизации, тогда как клетки, деплетированные по этим поверхностным маркерам, лишились этой способности (Рис 15). Анализ способности клеток, экспрессирующих MTDH и AdipoR2, к адипогенной дифференцировке показал, что популяция МСК, нокаутная по этим клеткам, дифференцируется с такой же эффективностью, как и тотальная популяция. При этом MTDH+/AdipoR2+ клетки не дифференцируются в адипогенном направлении (Рис 16). Стоит заметить, что MTDH+/AdipoR2+ клетки демонстрируют существенно пониженный пролиферативный потенциал и не дорастают до монослоя. А эффективность адипогенной дифференцировки критически зависит от плотности посадки клеток. В связи с этим, причиной сниженной эффективности адипогенной дифференцировки MTDH+/AdipoR2+ клеток может служить как их неспособность к дифференцировке, так и невозможность достижения требующегося для дифференцировки монослоя клеток. Мы описали субпопуляцию МСК по экспрессии на их поверхности инсулинового рецептора. Цитометрический анализ пермеабилизованной популяции МСК на предмет тотальной экспрессии инсулинового рецептора показал, что инсулиновый рецептор в качестве белка присутствует практически во всех клетках популяции МСК (Рис 17). При этом на поверхности клеток при анализе живых непермеабилизованных клеток инсулиновый рецептор окрашивается только у 1-8% МСК (Рис 18). МСК, выделенные из метаболически здорового худого донора, содержат наибольшую фракцию IR+ клеток – 8%. МСК, выделенные из метаболически здорового донора с ожирением, содержат меньшее количество таких клеток – 2-4%. МСК, выделенные из донора с ожирением и сахарным диабетом, содержат только 1% таких клеток. При культивировании клеток субпопуляций IR+ и IR- мы обнаружили, что они значительно отличаются по скорости пролиферации: клетки популяции IR- ведут себя сходно с тотальной популяцией МСК и требуют субкультивирования каждые 2–3 дня. С другой стороны, клетки популяции IR+ обладают значительно более медленной скоростью роста и дорастают до плотности субкультивирования лишь за 7–8 дней. Клетки популяций IR+ и IR- были проанализированы на экспрессию маркеров МСК. Как показано на Рис 19, обе субпопуляции экспрессируют маркеры МСК CD73, CD90 и CD105 на уровне, сравнимом с тотальной популяцией МСК. Все гистограммы цитометрии равномерно сдвинуты вправо, что свидетельствует о том, что все клетки окрашены антителами. Анализ способности клеток, экспрессирующих инсулиновый рецептор, проявлять гетерологическую сенситизацию показал, что при разделении популяции МСК на IR+-клетки и клетки, деплетированные на МСК, содержащие на своей поверхности инсулиновый рецептор (IR- клетки) обе популяции теряют способность к развитию гетерологической сенситизации (Рис 20). Анализ способности клеток, экспрессирующих инсулиновый рецептор, к адипогенной дифференцировке показал, что субпопуляция IR- и субпопуляция IR+ не способны к адипогенной дифференцировке по отдельности. Мы провели анализ способности к отдельных субпопуляций МСК к адипогенной дифференцировке. Полученные методом проточной цитометрии/сортировки клеточные субпопуляции IR+ и IR- были высажены на культуральные планшеты и обрабатывались индукторами адипогенеза в течение 21 дня. Мы обнаружили, что клетки популяции «IR-» - обедненные по клеткам, несущим на поверхности рецептор к инсулину значительно хуже дифференциируются в адипогенном направлении по сравнению с тотальной субпопуляцией МСК (Рис.21). При этом в популяции «IR+» по прошествии 21 дня индукции не обнаруживается признаков адипогенной дифференцировки, несмотря на наличие на поверхности этих клеток рецептора к инсулину – ключевому регулятору адипогенеза. Тот факт, что разделение тотального пула МСК жировой ткани на субпопуляции приводит к значительному снижению эффективности индукции адипогенеза, позволяет предположить, что взаимодействие между этими двумя популяциями определяет правильное протекание адипогенной дифференцировки МСК. Примечательно, что клетки популяции «IR-» все-таки демонстрируют частичную способность к адипогенезу после сортировки. Об этом может свидетельствовать наличие небольшого процента клеток с жировыми каплями и некоторое повышение экспрессии генов-маркеров адипогенеза (Рис 22). В то же время клетки популяции «IR+», по-видимому, не способны к дифференцировке – они не накапливают жировые капли, и экспрессия генов адипогенеза в них не изменяется относительно контроля. Мы провели Вестерн-блоттинг анализ экспрессии Т-кадгерина на отдельных субпопуляциях МСК, сортированных по представленности на поверхности клеток инсулинового рецептора. Как следует из литературных данных, Т-кадгерин может стимулировать образование внеклеточных везикул, стимулируя паракринную секреторную активность регуляторных клеток. Проанализировав субпопуляции IR+ и IR- на предмет представленности Т-кадгерина мы не обнаружили разницы в экспрессии этого белка (Рис 23), что может свидетельствовать об отсутствии прямой связи между экспрессией этого белка и секреторной активностью клеток. Это предположение будет проверено в следующем году, когда мы проанализируем секреторную активность IR+ и IR-субпопуляций МСК. С перспективой проведения основной массы экспериментов в следующем году была разработана методика бесконтактного сокультивирования субпопуляций IR+ и IR- в процессе адипогенной дифференцировки для оценки вклада паракринных факторов в регуляцию этого процесса. Как показано на Рис. 24, бесконтактное сокультивирование клеток IR-, которые сами по себе не вступают в адипогенную дифференцировку в коктейле дифференцировочных факторов, с субпопуляцией IR+ привело к повышению эффективности их дифференцировки если судить по числу образующихся клеток с жировыми каплями | ||
2 | 10 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Выяснение механизмов работы регуляторных субпопуляций |
Результаты этапа: Анализ возможных маркерных белков, по которым можно выделить клетки, способные регулировать адипоцитарную дифференцировку МСК, показал, что таким белком может являться инсулиновый рецептор. Как мы показали на первом этапе выполнения гранта, большинство МСК содержат инсулиновый рецептор во внутриклеточных компартментах. При этом не более 5% МСК несут этот белок на своей поверхности. На втором этапе выполнения гранта мы анализировали, какое влияние ИР+ клетки оказывают на адипогенную дифференцировку МСК и за счет чего эта регуляция осуществляется. С помощью проточной цитометрии, совмещённой с клеточным сортингом, мы смогли получить отдельно ИР+ и ИР- субпопуляции МСК. Как видно на Рис. 1-2, у популяции ИР- в значительной степени снижена способность к адипогенной дифференцировке. При этом растворимые факторы, продуцируемые популяцией ИР+, восстанавливают способность популяции ИР- к адипоцитарной дифференцировке. Таким образом, мы показали, что в популяции МСК присутствует субпопуляция клеток, несущих на своей поверхности инсулиновый рецептор (ИР+ клетки). Паракринная активность этих клеток оказалась необходимой для ответа ИР- МСК на воздействие факторов, индуцирующих адипоцитарную дифференцировку. При сокультивировании популяций МСК, полученных от здоровых доноров и доноров с инсулинорезистентностью мы обнаружили, что растворимые факторы, продуцируемые популяцией МСК от донора с ИР обладают выраженным антиадипогенным действием. Как видно из Рис.3-5 в присутствии МСК, полученных из жировой ткани доноров с инсулинорезистентностью, клетки здорового донора в значительной степени теряют способность к адипогенной дифференцировке. При этом сокультивация практически не влияет на фенотип клеток с ИР, которые обладают значительно нарушенной адипогенной дифференцировкой. В наших экспериментах клетки, полученные от доноров с инсулинорезистентностью, демонстрировали крайне низкий потенциал к адипогенной дифференцировке. Подобная ситуация может объясняться либо нарушением функционирования регуляторной ИР+ субпопуляции, либо повышением активности антиадипогенных сигнальных популяций, либо утерей клетками способности к адипогенезу. Наши данные по сокультивированию тотальных популяций МСК, свидетельствуют о возможном усилении продукции антиадипогенных растворимых факторов в МСК доноров с инсулинорезистентностью. В то же время вклад других процессов также требует проверки. Как показано на Рис. 6-7, при сокультивировании ИР- субпопуляции, полученной от доноров с инсулинорезистентностью с клетками популяции ИР+ с установленным проадипогенным действием, полученными от здоровых доноров мы не увидели восстановления адипогенеза в экспериментальных условиях. Это может свидетельствовать о том, что наблюдаемое уменьшение количества ИР+ клеток при развитии инсулинорезистентности (о чем мы сообщали на предыдущем этапе выполнения проекта) является не основной причиной нарушения адипогенеза, связанного с инсулинорезистентностью. Несмотря на значительно сниженное количество ИР+ клеток в популяции МСК, полученных от инсулинорезистентных доноров, в наших экспериментах их функциональная активность оказалась практически не отличающейся от ИР+ клеток, полученных от здоровых (Рис. 8). Это позволяет предположить, что развитие инсулинорезистентности хотя бы отчасти связано с уменьшением количества ИР+ клеток, но не с нарушением их активности. Популяции ИР+ клеток, полученные из здоровых и инсулинорезистентных доноров демонстрируют сходную активность при сокультивировании с тотальными субпопуляциями МСК. В случае сокультивирования с тотальной субпопуляцией, полученной от донора с инсулинорезистентностью, не происходит усиления адипогенеза (Рис. 9-12). В случае сокультивирования с тотальной популяцией МСК, полученной от здорового донора, и ИР+ клетки от инсулинорезистентного, и ИР+ клетки от здорового донора демонстрируют проадипогенное действие. Мы дополнительно проанализировали влияние секретома МСК на чувствительность к основному адипогенному индуктору гормону инсулину. Мы сравнили чувствительность клеток к инсулину у молодых МСК и МСК, выделеных из пожилых доноров. Мы показали, что при старении МСК существенно снижают свою чувствительность к инсулину, у них развивается инсулинорезистентность. Стоит обратить внимание, что, как мы показали (Рис. 13), инсулинорезистентность при старении МСК развивается в результате повышения базального уровня активности инсулин-зависимых сигнальных каскадов Akt-зависимого и МАРК/Ерк1/2-зависимого, а не вследствие подавления инсулин-зависимого фосфорилирования этих сигнальных каскадов. Как показано на Рис. 14, секретом сенесцентных клеток повышает базальный уровень активации сигнальных каскадов Akt-зависимого и МАРК/Ерк1/2-зависимого в молодых МСК, тем самым снижая изменение уровня их фосфорилирования в ответ на инсулин. Изучение протеома секретома ИР+ субпопуляции Для выяснения молекулярных механизмов паракринного действия ИР+ клеток на адипогенную дифференцировку остальных МСК мы провели протеомный анализ секретома этих клеток в сравнении с ИР- клетками, которые не оказывают стимулирующего воздействия на адипогенную дифференцировку. В результате биоинформатической и статистической обработки результатов были получены следующие данные. Построен график volcano plot, визуализирующий сравнение протеомов секретомов ИР+ и ИР- клеток (Рис.15). Справа выше линии графика расположены белки, уровень которых значимо выше в образцах ИР+ по сравнению с образцами ИР-. Слева выше линии графика расположены белки, уровень которых значимо выше в образцах ИР- по сравнению с образцами ИР+. Сплошная линия отражает FDR (False discovery rate, Ожидаемая доля ложных отклонений). Применение метода Z-score (стандартизованная оценка) позволило на основе полученной матрицы построить тепловые карты уровня белков для всех образцов ИР+ и ИР- (Рис.16). Это позволило более наглядно проиллюстрировать различную секрецию белков анализируемыми субпопуляциями МСК. ИР+ клетки демонстрируют существенное снижение большого количества белков, выявляемых в ИР- субпопуляции. Это может быть объяснено тем, что ИР- популяция клеток представляет собой тотальную популяцию МСК за вычетом ИР+ клеток. Соответственно, она содержит множество различных субпопуляций гетерогенной культуры МСК. Можно предположить, что каждая из функционально обособленных субпопуляций продуцирует характерный для себя набор белков, которые в смешанной культуре ИР- клеток выявляются в смеси. Таким образом, проанализировав все дифференциально секретируемые белки, особое внимание мы уделили белкам, повышенным в ИР+ субпопуляции МСК. С помощью сервиса g:Profiler и баз данных в его составе мы провели функциональную аннотацию белков, повышенных в образцах ИР- (Рис. 17) и ИР+ (Рис. 18). Проведя анализ белкового профиля факторов, секретируемых ИР+ популяцией МСК, мы выбрали 16 белков, уникальных для секрета клеток популяции IR+, и которые могут иметь отношение к паракринной активности клеток. Среди этих белков особенно стоит отметить 3 белка, тесно связанных с контролем адипогенеза и чувствительности к инсулину: 1 – Белок Legumain (LGMN), также известный как аспарагиновая эндопептидаза, является цистеиновой протеазой, основной функцией которой долгое время считалось обеспечение ремоделирования матрикса. Тем не менее, в последнее время появляется все больше данных, что белок LGMN также является важным регулятором адипогенеза. Блокада протеолитической активности этого белка приводит к снижению способности МСК к адипогенной дифференцировке. (Jafari A, et al., Stem Cell Reports. 2017). 2 – Белок Neudesin (NENF) – нейроторфический фактор неудезин – это секретируемый белок, относящийся к семейству белков мембрано-асоциированных рецепторов прогестерона (MAPR). Недавно было показано, что данный белок активно экспрессируется в ходе адипогенеза, нокаут NENF вызывает снижение эффективности адипогенеза (Su X, et al., Animals (Basel). 2019) 3 – Ацил-КоА-связывающий белок/Ингибитор связывания диазепама (DBI) обладает двумя основными функциями: внутри клетки связывает и обеспечивает транспорт среднецепочечных жирных кислот в комплексе с коферментом А, а как секретируемый белок он связывается с рядом GPCR (в частности, ГАМК рецептором класса А) и обеспечивает паракринное и аутокринное действие (Joseph A, et al., Cell Death Dis. 2021). Для DBI известно его участие в контроле адипогенеза. Например, даунрегуляция данного белка при помощи РНК-интерференции ведет к резкому снижению способности преадипоцитов к адипогенной дифференцировке (Mandrup S. et al., J Biol Chem. 1998). Для того чтобы попытаться охарактеризовать клетки регуляторной ИР+ субпопуляции, мы проанализировали массивы данных анализа транскриптома одиночных клеток (single-cell RNAseq) на предмет распределения мРНК обнаруженных белков в популяции МСК. Согласно данным протеомного анализа у ИР+ МСК повышена таких белков как COL1A2, DBI, MMP1, CHI3L1, HBB, DAG1, PLBD2, CNDP2, LGMN, C2, HBA1, HBA2, MDH1, A2M, LOXL1, B3GNT9 и NENF. Мы проанализировали распределение экспрессии генов этих белков в массивах данных scRNAseq популяции МСК. Большая часть белков по данным scRNAseq экспрессируется равномерно во всех клетках (Рис. 19). Однако экспрессия генов LGMN, A2M, C2 и PLBD2 повышена в кластере 5 (Рис. 20). Можно предположить, что клетки популяции IR+ МСК по своему транскрипционному фенотипу попадают преимущественно в 5 кластер. Клетки этого кластера составляют 1% от тотальной популяции МСК, что коррелирует с содержанием IR+ МСК. Ключевыми характеристическими генами-маркерами, которые значимо повышены в 5 кластере тотальной популяции МСК, являются FUCA1, CXCL8, SOD2, CCL2, APOE, CTSD, SPP1. Для того чтобы аннотировать ИР+ МСК к мы использовали g:Profiler и scType. МСК, составляющие кластер 5, имеют признаки клеток моноцитарно-макрофагального ряда. Предположение о том, что ИР+ клетки экспрессируют маркерные гены макрофагов, требует проверки, которая будет проведена на следующем этапе выполнения гранта. Мы проанализировали вклад паракринных взаимодействий в развитие феномена гетерологической сенситизации МСК. Мы обнаружили, что замена кондиционированной среды на свежую после инкубации клеток с норадреналином приводит к исчезновению прироста доли клеток, отвечающих на норадреналин (Рис. 21). Это может свидетельствовать, что в реализации эффекта гетерологической сенситизации важную роль играет аутокринное или паракринное взаимодействие клеток. С помощью бесконтактного сокультивирования мы проверили это предположение. Мы обнаружили, что при бесконтактном сокультивировании с клетками, преинкубированными с норадреналином, происходит увеличение доли клеток, отвечающих на норадреналин в контрольных МСК (Рис. 22). Таким образом, паракринное воздействие клеток предварительно преинкубированных с норадреналином играет ключевую роль в реализации феномена гетерологической сенситизации в популяции МСК. В рамках решения 5 задачи гранта мы провели протеомный анализ секретома МСК после их преинкубации с норадреналином. Клетки предварительно депривировались, затем преинкубировались с норадреналином (10-6М) в течение часа в бессывороточной среде, после чего секретом клеток собирался в течение суток. Далее белок максимально возможно концентрировался (70 мл кондиционированной среды с 7 100 мм чашек Петри концентрировалось до 100мкл раствора для каждого образца) и анализировался масс-спектрометрически. Анализ изменения секретома в клетках, преинкубированных с норадреналином, был проведен дважды в трипликатах, однако в обоих случаях уровень белка был слишком низкий для достоверного анализа. Как показано на Рис. 23, всего лишь три белка показали отличия в концентрации, но физиологического смысла в наличии этих белков в секретоме нет. Для того чтобы выяснить, какие факторы действуют в секретоме МСК при реализации феномена гетерологической сенситизации, мы воспользовались альтернативным методом. Мы проанализировали ранее измеренный в нашей лаборатории спектр микроРНК, содержащихся в секретоме МСК, после воздействия на клетки различных гормонов. Мы выбрали образцы контрольный и после воздействия норадреналина. Для миРНК, достоверно повышенных в секретоме после обработки норадреналином, мы выявили общие мишени. Как видно на Рис. 24, преинкубация клеток с норадреналином приводит к повышению миРНК, мишенями которых являются система убиквитинилирования, МАР-киназная система и участники CREB-зависимого транскрипционного комплекса. Как мы показали на прошлом этапе выполнения гранта, норадреналин вызывает повышение уровня экспрессии альфа1А-адренергических рецепторов, в основном, за счет модуляции цитоплазматических мишеней. Подавление системы убиквитинилирования может приводить к увеличению времени жизни зрелого белка, что при неизменном или повышенном уровне трансляции ведет к быстрому росту его уровня. Кроме того, мишенью миРНК является рибосомная киназа RPS6KA6, которая потенциально может регулировать трансляцию рецептора. Вторая группа мишеней - это факторы, связанные с CREB (cAMP response element binding protein). Как мы показали на предыдущем этапе выполнения гранта, ключевым эффектором действия цАМФ-зависимого сигнального каскада в том случае, если он приводит к активации транскрипции а1А-адренорецептора, является CREB-зависимая система. Третьей группой, на которую потенциально могут воздействовать миРНК, являются сигнальные белки. Во-первых, это целая группа МАР-киназ, во-вторых, это участники фосфоинозитид/кальций-зависимого сигнального каскада. Таким образом, мы выявили ряд потенциальных мишеней миРНК, повышающихся в секретоме МСК после их преинкубации с норадреналином. Участие конкретных миРНК и изменение их целевых молекул нужно проверять отдельно. В рамках решения 6 задачи гранта мы провели контактное сокультивирование регуляторных субпопуляций МСК. Контактное сокультивирование клеток популяции ИР- и ИР+, полученных от здорового донора, демонстрирует результаты, сходные с полученными в экспериментах по неконтактному сокультивированию популяций. Как показано на Рис. 25, Рис. 26 и Рис. 29-34, отдельно клетки популяции ИР- демонстрируют значительно сниженный адипогенный потенциал. Контактное сокультивирование клеток ИР- с клетками ИР+ в конечной концентрации 5% от общей популяции приводит к восстановлению адипогенного потенциала. При этом 10%-ая конечная концентрация ИР- приводит к еще большему повышению эффективности адипогенеза. При 20%-ой концентрации ИР+ в тотальной популяции происходит некоторое снижение эффективности дифференцировки, что вероятно связанно с неспособностью самих клеток ИР+ к адипогенной дифференцировке. Мы обнаружили, что при контактном сокультивировании тотальной популяции МСК от доноров с инсулинорезистентностью с клетками IR+ от здорового донора, происходит дозо-зависимое улучшение адипогенеза (Рис. 27-34). В данных условиях, в отличие от неконтактного сокультивирования, ИР+ клетки здорового донора оказались способны улучшать адпиогенную дифференцировку МСК инсулинорезистентного донора. Данный феномен, вероятно, может объясняться значительной ролью контактных взаимодействий для восстановления адипогенеза МСК инсулинорезистентных пациентов. Проверка участия адипонектин-Т-кадгерин-индуцированной продукции внеклеточных везикул в регуляцию адипогенеза МСК показала, что высокомолекулярный адипонектин не оказывает влияния на адипогенную дифференцировку МСК (Рис. 35). Таким образом, за второй год выполнения гранта мы выяснили, что обнаруженные нами ранее регуляторные субпопуляции МСК оказывают свой регуляторный эффект при помощи паракринных взаимодействий с остальными клетками популяции. Регуляторная субпопуляция МСК, постоянно экспрессирующая на своей поверхности инсулиновый рецептор (ИР+ клетки), паракринным манером активирует адипогенную дифференцировку других клеток популяции МСК (ИР- клетки). Сами по себе ни ИР+ клетки, ни ИР- клетки не способны дифференцироваться в адипогенном направлении в присутствии компонентов адипогенного коктейля факторов. МСК, выделенные из донора с инсулинорезистентностью, также содержат клетки регуляторной субпопуляции ИР+, хотя и в меньшем количестве, чем МСК здорового донора. Их регуляторные клетки не отличаются по своей функциональной активности от клеток здорового донора. Мы также выявили белки-кандидаты на роль ключевых регуляторов адипогенной дифференцировки, которые синтезируются ИР+ клетками. Вторая регуляторная субпопуляция, обнаруженная нами — это клетки, вызывающие сенситизацию популяции МСК к действию норадреналина за счет повышения экспрессии альфа1А-адренорецепторов. В прошедшем периоде выполнения гранта мы показали паракринную природу сенситизации клеток к норадреналину, однако чистую регуляторную субпопуляцию, ответственную за это, еще не выделили, это войдет в задачи следующего этапа выполнения гранта. Мы выявили миРНК, содержащиеся в секретоме МСК после их преинкубации с норадреналином, а также их потенциальные мишени. | ||
3 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Выяснение дифференцировочных механизмов коммитирования стволовых клеток |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".