Морфология, развитие, таксономическое разнообразие и распространение Siboglinidae - индикаторов подводных месторождений углеводородов.НИР

Morphology, development, taxonomical diversity and distribution of Siboglinidae as indicators of underwater hydrocarbon deposits

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 28 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. Морфология, развитие, таксономическое разнообразие и распространение Siboglinidae - индикаторов подводных месторождений углеводородов
Результаты этапа:
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Морфология, развитие, таксономическое разнообразие и распространение Siboglinidae - индикаторов подводных месторождений углеводородов
Результаты этапа: В ходе работ 2022 г. в соответствии с ранее заявленным планом проведены таксономические исследования бескишечных симбиотрофных аннелид семейства Siboglinidae. Было проведено описанное 3 –х новых для науки видов семейства Siboglinidae. В ходе работ были обнаружены и описаны новые для науки виды Lamellibrachia judigobini sp. nov. и Escarpia tritentaculata sp. nov. Новые виды были описаны по материалам, собранным в ходе экспедиций на научно исследовательских судах «Atlantis» и «James Coock» и переданных коллективу коллегами из Великобритании для исследования. Материал был собран в Атлантическом океане на гидротермальном поле Фон Дамм (Von Damm Vent Field) в районе Срединно- Кайманского поднятия в районе с координатами 18,375167°N - 81,79767°W на глубине 2300-2490 м c использованием манипуляторов Jason-2 и Isis 153 Remotely-Operated Vehicles. Всего было собрано 5 образцов червей и 6 образцов почти полных трубок нового вида из рода Lamellibrachia и 6 червей и 20 трубок из рода Escapia. Фрагменты каждого собранного экземпляра были разделены между двумя типами консервации и хранились либо в 80% этаноле либо в 10% формалине. Все работы по описанию, молекулярно-биологическим исследованиям и таксономии были проведены на биологическом факультете им. М.В. Ломоносова. Полученные экземпляры были сфотографированы с помощью Canon EOS 1D-X (Canon Inc., Токио, Япония) камеры с использованием объектива Canon 150 мм. Перед дальнейшей обработкой фрагменты, предназначенные для исследований с применением электронных микроскопов, были постфиксированы в 1% тетроксиде осмия, обезвожены, высушены в критической точке и напылены смесью тяжелых металлов с целью изучения поверхностной морфологии. Исследования были проведены на сканирующих электронных микроскопах JEOL JSM (JEOL Ltd., Токио, Япония) в Лаборатории электронной микроскопии МГУ. Для проведения молекулярно-генетических работ отобраны. Выделение ДНК было проведено с помощью набора Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit, следуя инструкциям производителя. Были амплифицированы последовательности COI, 16S, 18S и интрона hbB2. Для создания смеси для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использована ДНК-полимераза Red Taq. Реакции ПЦР была проводена в термоциклере с использованием следующего температурного профиля для COI, 16S и 18S: 94°C / 5 мин, (94°C/45 с, 55°C/45 с, 72°C/2 мин) 35 циклов, 72°C/10 мин; и для HbB2i: 94°C/5 мин, (94°C/1 мин, 50°C/1,5 мин, 72°C/2,5 мин) 30 циклов, 72°C/7 мин. Продукты ПЦР были визуализированы на 1% агарозных гелях после электрофореза, очищены и затем были секвенированы с использованием анализатора ДНК ABI 3730XL (Applied Biosystems). Полученные последовательности COI, 16S и 18S были сопоставлены с существующими последовательностями вестиментифер, доступными в Genbank, с использованием программного обеспечения Geneious, с особым вниманием к представителям родов Lamellibrachia и Escarpia. В качестве внешних групп использованы представители других родов Siboglinidae и близких семейств Annelida. Был проведен анализ последовательностей COI, 16S и 18S в MrBayes v.3.2.6 с использованием JModelTest v.2.1.10 для каждого выравнивания генов подобрана модель в соответствии с информационным критерием Акаике. Для видов рода Lamellibrachia произведено выравнивание COI для расчета нескорректированных попарных расстояний при помощи PAUP v.4.0a с последовательностями Genbank. Для представителей рода Escarpia произведено сопоставления COI и интрона hbB2i, построены сети гаплотипов в popART v.1.7 с использованием TCS. Новый вид L. judigobini sp. nov. отличается генетически и морфологически от других видов Lamellibrachia. Ареал нового вида простирается по всему Мексиканскому заливу, у побережья Тринидада и Тобаго и Барбадоса в районах просачиваний на глубинах от 964 до 3304 м. Исследование показывает историческую биогеографическую связь L. judigobini sp. nov. с восточной частью Тихого океана, а E. tritentaculata sp. nov - с восточной Атлантикой. На основе имеющегося в нашем распоряжении материала френулятных сибоглинид собранных во время 68-го рейса НИС АМК Института Океанологии РАН им. П.П.Ширшова на станции с координатами 76,89°-76,91°N – 127,7°-127,9°E на глубине 63 метра в море Лаптевых выполнено описание нового для науки вида Oligobrachia similis sp. nov. Совокупность морфологических признаков O. similis позволяет отнести ее к новому виду рода Oligobrachia, что также подтверждается филогенетическо-молекулярным анализом на основе генов COI, 18S, 16S, 28S. Нами были получены 8 новых последовательностей из 4 различных генов (СOI, 16S, 18S, 28S). Выравнивание последовательностей включало 2483 позиций (632 п.н.- COI; 275 п.н.- 28 S; 467 п.н. - 16S и 1109 п.н. - 18 S). Топология результирующих деревьев, построенных на основе Байесовского метода (BI) и методом максимального правдоподобия (ML) конгруэнтны. Все френулятные погонофоры образовали монофилетическую кладу (апостериорная вероятность из байесовского анализа (PP) = 1; бутстрэп поддержка (ML) = 100). Описанный вид O. similis группируется в кладу вместе с Oligobrachia haakonmosbiensis Smirnov, 2000 с высокой поддержкой (PP = 1; ML = 100). Исследованы процессы регионализации в эмбриональном развитии сибоглинид и формирование нервной системы сибоглинид от стадий метатрохофоры и нектосомы, до взрослых структур у Siboglinum fiordicum и Oligobrachia haakonmosbiensis с применением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и выявления иммунореактивности к иммуногистохимическим нейронным красителям, а также прямого окрашивания мышечными и ядерными красителями и визуализации зон пролиферации на разных стадиях развития. Показано, что первый сегмент нектосомы представляет собой переднюю часть взрослой особи погонофоры, второй сегмент нектосомы представляет собой туловище взрослой погонофоры, половой участок и трофосомальный. Во втором сегменте нектосомы закладываются сидячие крючковидные щетинки, входящие в состав будущей аннулы, или пояска, разделяющего туловище на две части, половую и трофосомальную. Третья септа также как и вторые септы закладываются мезодермально, и не выражены в эктодерме. Таким образом, при формировании сегментов личинки мезодермальная закладка сегментов опережает эктодермальную закладку, а опережающее формирование сегментов на заднем конце личинки связано с подвижностью заднего конца тела личинки необходимой для выхода наружу из материнской трубки со схлопнувшимися стенками и последующего зарывания личинки в осадок. Исследовано анатомическое и гистологичеcкое строение трофосомы гигантского представителя сибоглинид – вестиментиферы Riftia pachyptila. Экземпляры R. pachyptila, использованные для исследования, были собраны в гидротермальном бассейне Гуаймос в Калифорнийском заливе Тихого океана (210 с.ш., 1110 з.д.). Установлено, что трофосома представляет собой совокупность тяжей, осью каждого из которых является кровеносный сосуд. Это позволяет утверждать, что трофосома связана в своем происхождении с кровеносной системой. Эволюционным предшественником трофосомы является кровеносная сеть, связывающая вентральный и дорсальный сосуды в туловищном отделе. Клетки целомической выстилки на поверхности, разрастаясь, дают начало паренхиматозной ткани трофосомы. По данным ультраструктурных исследований между клетками-бактериоцитами сохраняются контакты по типу zonulae adhaerens и септатные десмосомы, что типично для эпителиальной ткани, в том числе и для мезодермального эпителия целомической выстилки. Исследования по развитию трофосомы вестиментифер показывает, что она развивается из двух зачатков: целомической выстилки со стороны стенки тела и целомической выстилки на поверхности рудиментарного кишечника. Для исследования строения, развития и состава симбионтов представителей другого подсемейства (Frenulata) был проведен отбор проб симбиотрофной ткани (трофосомы) погонофор Oligobrachia haakonmosbiensis и Siboglinum fiordicum и осадка для исследования разнообразия бактерий-симбионтов (70 образцов) и проведения метагеномного анализа (6 образцов). Анализ последовательностей 16SрРНК симбионтов O. haakonmosbiensis CPL-клады из метановых сипов показало наличие только одного штамма сероокисляющих бактерий. Ранее было показано что у Vestimentifera и Osedax может быть несколько видов симбионтов, как сульфид-окислителей так и сульфат-редукторов, что помогает им в поддержании постоянного уровня метаболизма. Наши данные профилирования показали наличие только сероокисляющих бактерий в трофосоме O. haakonmosbiensis. Наши результаты совпадают с результатами филогенетического анализа симбионтов O. haakonmosbiensis из метановых высачиваний грязевого вулкана Хаакон Мосби, который показал наличие сероокисляющих бактерий в этом виде погонофоры, а также отсутствие диагностических генов метанотрофии, кодирующие метанмонооксигеназы (pmoA, mmoX) и метанол дегидрогеназу (mxaF). По результатам профилирования образцы трофосом и осадка в месте обитания сибоглинид отобраны для метагеномного анализа. Исследованы три генома эндосимбионтов O. haakonmosbiensis с метанового сипа Буор-Хая моря Лаптевых при помощи автоаннотации KEGG, а также вручную в онлайн-сервисе RAST при помощи инструмента BLAST референсных последовательностей необходимых генов против данных геномов эндосимбинтов. В качестве референсных последовательностей использованы последовательности генов из других микробов, для которых однозначно показана функция после проведения необходимых биохимических исследований. Найденные последовательности сравнены при помощи BLAST против баз данных Uniprot/Swissprot для дополнительного подтверждения правильности предсказаний. Оценен спектр генов для окисления восстановленных серных соединений в исследуемых микробах, а также серный метаболизм. Трофосома у O. haakonmosbiensis и S. fiordicum занимает целомическую полость задней части преаннулярного отдела и всего постаннулярного отдела туловищного сегмента вплоть до первой септы опистосомы. Трофосомальная ткань O. haakonmosbiensis и S. fiordicum образована двумя слоями эпителия, между базальными пластинками которых проходят трофосомальные сосуды, что соответствует ранее описанной структуре трофосомы других. Бактериоциты чаще всего имеют неправильную вытянутую форму, соседние клетки соединены межклеточными контактами. Измерения бактериоцитов и диаметров тела червей в разных участках показали, что процентное соотношение бактериоцита к диаметру участка у O. haakonmosbiensis составляет от приблизительно 1 до 9 %, тогда как у S. fiordicum от 1,24 до 20,5 %. Бактериоциты S. fiordicum всегда непосредственно прилегают к дорсальному и вентральному сосуду (т. е. не отделены от них клетками эпителия). В отличие от клеток внешнего эпителия в бактериоцитах заметно меньше содержание митохондрии и ЭПР. Но в них присутствует много гранул гликогена и везикул. Были встречены в большом количестве многослойные гранулы и лизосомо-подобные. Многослойные гранулы чаще всего окружены вакуолярной мембраной. При анализе подобных гранул Siboglinum atlanticum было обнаружено, что гранулы состоят из кальция и фосфора (Southward, 1982). Лизосомо-подобные гранулы вероятно могут отвечать за деградацию старых бактерий. В некоторых участках были найдены звездчатые гранулы, которые ранее были описаны для трофосомы Osedax (Katz et al., 2011). Бактериоциты, как правило, располагаются в один ряд вдоль трофосомального кровеносного сосуда. В отличие от вестиментифер у френулят и склеролинид не встречается как таковой полиморфизм симбионтов. У обоих видов нами были обнаружены палочковидные бактерии, единичные коккоидные бактерии были обнаружены в самом заднем участке трофосомы O. haakonmosbiensis, но они, как и кокки Sclerolinum contortum находятся уже на грани деградации и не являются активными хемосинтезирующими бактериями. Максимальное количество обнаруженных бактерий у O. haakonmosbiensis составляло 79 на срез одной клетки, у S. fiordicum – более 300 на срез одной клетки. Оба изученных вида содержали тиотрофных бактерий. Природа хемосинтетической активности O. haakonmosbiensis долгое время является дискуссией. Количество бактерий, в цитоплазме которых присутствовала сера увеличивалось в направлении к задней области трофосомы червя, что вероятно может быть связано с нехваткой кислорода у симбионтов в задней части трофосомы, частичным окислением сульфида и откладкой серы как промежуточного запасного продукта. Деградация клеток трофосомы у S. fiordicum начинается несколько раньше, чем у O. haakonmosbiensis, а именно, еще в средней зоне трофосомы. В соответствии с планом работ составлен синопсис видов сибоглинид в морях Российской Федерации (Баренцево море, Карское море, Восточно-Сибирское море, Берингово море, Охотское море и Японское море) и прилегающих к ним частях мирового океана. Синопсис составлен на основе литературных источников и данных о сборах, проведенных в экспедициях последних лет. Данный перечень отображает фаунистический состав группы, представленный в морях России, а также отражает батиметрическое и географическое распространение каждого из представленных видов. Перечень видов с краткими описаниями находок дополнен таблицей распределения находок и картами распространения находок по указанным акваториям. Карты распространения были построены при использовании программного обеспечения Surfer (GoldenSoftware) по таблицам координат находок сибоглинид предварительно собранным в файлы Microsoft Excel. Данный синопсис может быть использован не только для профессиональными зоологами, но также актуален и для исследователей смежных специальностей, ведущих гидробиологические, геологические и газохимические исследования в морях Российской Федерации, в том числе, и в особенности, - в арктических морях России. Фауна сибоглинид морей России представлена 36 видами из которых несколько еще находятся в стадии описания и вероятно их число будет в дальнейшем увеличено, всего известна 341 находка сибоглинид. Подавляющее большинство находок приходится на френулятных сибоглинид (погонофор) (327) и незначительное число находок приходится на представителей рода Sclerolinum (14 находок); вестиментиферы и Osedax в морях России не представлены. Виды френулятных сибоглинид можно подразделить на две фаунистические группировки: Арктико-Атлантическая и Тихоокеанская группы видов. Важно отметить, что эти группировки видов не пересекаются между собой, т.о. ни один вид из Тихоокеанского бассейна не был отмечен в Арктических морях. Виды представленные в Арктике являются либо уникальными, эндемичными для данного района, либо некоторые из них встречаются в также в бассейне Атлантического океана. Важно отметить, что лишь малая часть видов являются массовыми и многие известны локально по единичным находкам. В отношении ряда случаев это действительно связано с точечным ареалом, но более вероятно, что это отражает относительно слабую изученность некоторых окраинных морей России. В феврале 2022 года осуществлена экспедиция в Северном море на Морской биологической станции Эспегренд (Университет Бергена, Норвегия). Сбор особей Siboglinum fiordicum и осадка, в котором обитают черви, проводился в Северном море в районе пролива Юпсесунд (Ypsesund) (60°33'38" N, 5°0'20" E) неподалеку от морской биологический станции Эспегренд (Университет Бергена, Норвегия) при помощи дночерпателя Van Veen 0,25 м2 с глубины 33-35 м 7-15 февраля 2022 года. На базе морского стационара был проведен отбор трофосом и осадка для профилирования 16SРНК и метагеномного анализа, а именно образцы воды. Исследовано разнообразие бактерий–симбионтов и проведена оценка изменения генома симбионтов при проникновении в ткани хозяина и перехода от свободноживущего состояния к симбиозу, способность эндосимбионтов переключаться с автотрофного к гетеротрофному метаболизму и/или они являются миксотрофными организмами. В октябре 2022 года в экспедиции на НИС «Академик Мстислав Келдыш» в районе метановых сипов на склоне шельфа отобраны пробы на полигоне Буор-Хая в море Лаптевых, проведены исследования по геохимии местообитания френулятной погонофоры Oligobrachia haakonmosbiensis, а также по метагеномному анализу для обнаружения бактерий, которые могут быть потенциальными симбионтами этой погонофоры.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".