Микробные сообщества биотехнологически значимых микроводорослейНИР

Microbial consortia of biotechnologically important microalgae

Соисполнители НИР

МГУ имени М.В.Ломоносова Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант Президента РФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 23 апреля 2021 г.-31 декабря 2021 г. Микробные сообщества биотехнологически значимых микроводорослей
Результаты этапа: Для выполнения работ по гранту в 2021 году были выбраны следующие культуры микроводорослей (МВ), обладающие биотехнологическим потенциалом, (1) Coelastrella rubescens NAMSU R1, (2) Bracteacoccus aggregatus NAMSU BM5/15, (3) Tetradesmus sp. NAMSU SBB-20, (4) Coelastrella oocystiformis NAMSU C1, (5) Lobosphaera incisa CALU 925. Причем штаммы NAMSU R1 (получен с коры дерева, д. Расторгуево, Московская область, Россия), NAMSU SBB-20 (литораль Белого моря, Бухта Благополучия, Большой Соловецкий остров, Россия), NAMSU C1 (с побережья залива Джордиан озера Гурон, Канада) были выделены в культуру из природных местообитаний и введены в культуру в рамках выполнения работ по проекту. Идентификацию микроводорослей проводили на основании анализа последовательности фрагмента ядерного рибосомального кластера генов, включающего внутренние транскрибируемые спейсеры и ген 5,8 S рРНК как описано ранее (Chekanov et al., 2020). Для новых штаммов МВ введение в культуру проводили согласно ранее описанной методике (Chekanov et al., 2020) на среде BG-11 (Stanier et al., 1971). Для штаммов B. aggregatus BM5/15 и L. incisa CALU 925 биотехнологический потенциал, а именно накопление каротиноидов и/или полиненасыщенных жирных кислот описано ранее (Chekanov et al., 2021; Шибзухова и др., 2017). Данные штаммы также культивировали на среде BG-11. © ФГБНУ НИИ РИНКЦЭ МК-1952.2021.1.4 1Для получения аксеничных культур МВ, то есть состоящих только из клеток одного штамма МВ, применяли несколько этапов очистки. На первом этапе использовали разведение и посев на чашки Петри с твердой средой BG-11 (1,5 % по объему агара), в случае наличия бактерий после проведения первого этапа применяли обработку ультразвуком и центрифугирование в градиенте сахарозы с последующим высевом на чашки Петри с твердой средой BG-11. В случае, если это не приводило к полному удалению бактерий применяли очистку с применением комбинации антибиотиков. Методики были взяты из пособия Темралеевой c соавт. (2014 г.) с некоторыми модификациями. Проверку чистоты культуры проводили с помощью светлопольной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и 16S рРНК метабаркодинга. В результате очистки были получены культуры МВ со сниженным количеством бактерий (то есть проведены начальные этапы разработанной стратегии по получению аксеничных культур) для следующих штаммов: (1) C. rubescens NAMSU R1, (2) B. aggregatus NAMSU BM5/15, (3) Tetradesmus sp. NAMSU SBB-20. На рисунке 1 показано снижение числа клеток бактерий на поверхности (в фикосфере) штамма C. rubescens NAMSU R1 после очистки (рис. 1). Данные метабаркодинга подтвердили снижение биоразнообразия бактерий в микробиоме микроводорослей (рис. 2). Оценка биотехнологического потенциала полученных аксеничных культур была проведена на предмет накопления ими каротиноидов. Для штамма B. aggregatus BM5/15 показано комбинированное содержание астаксантина и β-каротина в стрессовых условиях (Chekanov et al., 2021). Накопление каротиноидов двумя другими аксеничными культурами было проведено на разными способами модифицированной среде BG- 11 (стандартная, без источников азота (N), без источников фосфора (P)) и при двух интенсивностях света: 50 (неяркий свет) и 150 (яркий свет) мкмоль квантов ФАР (фотосинтетически активной радиации)/м²/с. Были исследованы 6 вариантов комбинаций данных параметров. Индукцию каротиногенеза проводили в течение 21 сут., оценку накопления каротиноидов проводили визуально по появлению характерной красно-оранжевой окраски клеток культуры через 14 (Рис. 3, а – е, Рис. 4 а – е) и через 21 сут. (Рис. 3, ж – м, Рис. 4 ж – м). Для штамма C. rubescens NAMSU R1 показано приобретение наибольшее интенсивной оранжево-красной окраски на ярком свету и на среде в отсутствии источников азота (HL, –N), максимальное содержание в клетках каротиноидов составляло 21,34 мг/л. При этом для штамма Tetradesmus sp. NAMSU SBB-20 показано наибольшее накопление интенсивной оранжево-красной окраски на ярком свету и на среде в отсутствии источников фосфора (HL, –P), однако расчет содержания каротиноидов не выявил достоверных различий между вариантами HL, –P (15,8 мг/л каротинодиов) и HL, –N (16,35 мг/л каротинодиов). Расчет содержания пигментов проводили согласно (Chekanov, Solovchenko, 2015). Данные условия, а именно яркий свет и дефицит источников азота в среде, были признаны оптимальными для накопления каротиноидов для данных штаммов. Штаммы C. rubescens NAMSU R1, B. aggregatus NAMSU BM5/15 и Tetradesmus sp. NAMSU SBB-20 были выбраны для дальнейших исследований, а именно для создания смешанных альго-бактериальных культур в 2022 г. В соответствии с календарным планом НИР. Получение культур бактерий из штаммов микроводорослей проводили на агаризованных средах BG-11, BG-11+А (BG-11, содержащая ацетат Na, 2% по массе) и среде с разными органическими источниками углерода – УС-10 (разбавленная в 10 раз среда УС по Лысак (2003)). Было получено 16 штаммов бактерий, идентифицированных до уровня рода: Microbacterium, Pseudonocardia, Rhodococcus, Aeromicrobium, Paenibacillus, Methylorubrum, Pedobacter, Caulobacter, Paracoccus, Arsenicitalea, Dietzia, Pseudonocardia. Для бактерий данных родов известна способность оказывать стимулирующее воздействие на растительные организмы, то есть они относятся к PGPB (бактерии, способствующие росту растений, англ. plant growth promoting bacteria). Данные штаммы также охарактеризованы по морфологическим признакам. Таким образом, по результатам исследований, проведенных в рамках выполнения работ по гранту в 2021 году получены аксеничные культуры трех штаммов микроводорослей, описан их биотехнологический потенциал; получено и охарактеризовано 16 штаммов бактерий из микробиома данных микроводорослей. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ Лысак Л. В., Скворцова И. Н., Добровольская Т. Г. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. – М.: МАКС пресс, 2003. – 120 с. Темралеева А. Д., Минчева, Е. В., Букин, Ю. С., & Андреева, А. М. Современные методы выделения, культивирования и идентификации зеленых водорослей (Chlorophyta). – 2014. Шибзухова К. А. Гаврилова, О. В., Чивкунова, О. Б., Сидоров, Р. А., Соловченко, А. Е., & Лобакова, Е. С. Оценка биотехнологического потенциала и уточнение таксономического статуса микроводорослей рода Parietochloris (Trebouxiophyceae) коллекции CALU //Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. – 2017. – №. 3. Chekanov K., Fedorenko, T., Kublanovskaya, A., Litvinov, D., & Lobakova, E. Diversity of carotenogenic microalgae in the White Sea polar region //FEMS microbiology ecology. – 2020. – Т. 96. – №. 1. – С. fiz183. Chekanov K., Litvinov, D., Fedorenko, T., Chivkunova, O., & Lobakova, E. Combined Production of Astaxanthin and β-Carotene in a New Strain of the Microalga Bracteacoccus aggregatus BM5/15 (IPPAS C-2045) Cultivated in Photobioreactor //Biology. – 2021. – Т. 10. – №. 7. – С. 643. Chekanov K. A., Solovchenko A. E. Possibilities and limitations of non-destructive monitoring of the unicellular green microalgae (Chlorophyta) in the course of balanced growth //Russian journal of plant physiology. – 2015. – Т. 62. – №. 2. – С. 270-278. Stanier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriol. Rev. – 1971. – Vol. 35, N 2. – P. 171.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Микробные сообщества биотехнологически значимых микроводорослей
Результаты этапа: I. Описание таксономического состава микробиома культур и выявление основных групп сопутствующих микроорганизмов Для проведения работ по гранту за 2022 год были использованы культуры, изученные на первом году исследований: Coelastrella rubescens NAMSU R1, Bracteacoccus aggregatus NAMSU BM5/15, а также штамм SBB-20, более детальная таксономическая идентификация которого показала его принадлежность к виду Halochlorella rubescens (данные опубликованы в статье, поддержанной данным грантом (Зайцева и др., 2023)). Для описания таксономического состава микробиома данных культур применяли метод 16S рРНК метабаркодинга на платформе Illumina с использованием праймеров из статьи (Bates et al., 2011). Данные высокопроизводительного секвенирования (NGS) были проанализированы и визуализированы с помощью разработанного в рамках выполнения работ по данному гранту подхода, основанного на наборе программ, и опубликованы в статье (Зайцев и др., 2023), поддержанной грантом. Для построения диаграммы Circos использовали онлайн-сервис (http://mkweb.bcgsc.ca) Таксономический анализ микробиома штамма C. rubescens R1 показал присутствие бактерий следующих родов: Brevundimonas, Larkinella, Devosia, Arsenicitalea, Paracoccus, Caulobacter, Microbacterium, Aeromicrobium, Mesorhizobium и представителей семейств Microbacteriaceae, Xantobacteraceae, Comamonadaceae, Rhizobiaceae. C помощью методов очистки была получена культура данного штамма, микробиом которой был представлен практически исключительно бактериями семейства Microbacteriaceae (более 99% коротких чтений NGS). Микробиом культуры штамма B. aggregatus BM5/15 содержал бактерий следующих родов: Larkinella, Devosia, Brevundimonas, Pedobater, Reyranella, Pseudonocardia, Iamia, Candidatus Amoebophilus, Pseudorhodoplanes и семейств Comamonadaceae, Rhizobiaceae. Получена аксеничная культура микроводоросли B. aggregatus BM5/15, содержание бактериальных чтений в NGS данных которой составляло не более 0,1%. Анализ таксономического состава микробиома штамма H. rubescens SBB-20 выявил следующих бактерий: Devosia, Microbacterium, а также незначительное количество Acinetobacter, Rhizobium, Brevundimonas, представителей Microbacteriaceae, Comamonadaceae, Rhizobiaceae. При сравнении микробиомов культур в очищенном состоянии (исключая BM5/15, для которого ввиду полной аксеничности культуры были взяты данные состава микробиома до очистки) было показано наличие следующих общих групп бактерий: роды Devosia, Microbacterium и представители семейств Comamonadaceae и Rhizobiaceae. На рис. 1 показана относительная представленность указанных такосонов в микпробиомах водорослевых культур по данным NGS. Роды Devosia и Microbacterium являются основными сопутствующими микроорганизмами изученных культур фотоавтотрофов. Других микроорганизмов, таких как археи, грибы, другие микроводоросли, в микробиоме культур обнаружено не было. II. Создание альго-бактериальных ассоциаций и оценка их биотехнологического потенциала. Для проведения сокультивирования были выбраны штаммы микроводорослей C. rubescens NAMSU R1 и H. rubescens NAMSU SBB-20, а также три штамма бактерий, полученных из микробиома изученных штаммов микроводорослей в первый год работ по гранту: Pedobacter sp. BR(2)2, Rhodococcus sp. BGA(1)1 и Arsenicitalea sp. CR(2)5.1. Характеристика штаммов бактерий приведена в таблице 1. Сокультивирование проводили в 24-х луночном планшете при освещении 50 мкмоль квантов ФАР/м2/с. При сокультивировании проводили оценку параметров флуоресценции хлорофилла а для определения состояния фотосинтетического аппарата клеток культуры (по Solovchenko et al. 2022) на РАМ-флуориметре FluorCam 800 (PSI, Czech Republic), а также показателей оптической плотности на микропланшетном ридере INFINITE 200 PRO (TECAN, Швейцария. Отбор точек проводили на 0, 1, 3, 6, 10 и 13 сутки. В начале и конце эксперимента проводили анализ пигментов в экстрактах ДМСО согласно формулам, приведенным в статье (Solovchenko, Merzlyak, 2010). Анализ параметров флуоресценции выявил следующие закономерности. Максимальный квантовый выход для культур C. rubescens NAMSU R1 с бактериями сначала был выше, чем в контроле, затем к концу эксперимента стал сопоставимым с контролем (рис. 2а), что указывает на отсутствие негативного влияния бактерий на состояние фотосинтетического аппарата клеток C. rubescens. Максимальный квантовый выход для культур H. rubescens с бактериями был выше, чем в контроле, на протяжении всего эксперимента. Это позволяет сделать вывод о том, что бактерии положительно влияют на данную микроводоросль (рис 2б). Параметр NPQ, отражающий нефотохимическое тушение, возрастал для сокультур бактерий с микроводорослью C. rubescens к концу эксперимента, а для культур H. rubescens – снижался, что может быть связано с тем, что культуры C. rubescens в присутствии бактерий находились в состоянии стресса (рис. 3). Оценка изменения оптической плотности сокультур, проведенная как для микроводоросли (по значениям D680), так и для бактерий в составе сокультуры (D600/D680) показала следующее. За время эксперимента наблюдался рост микроводоросли H. rubescens, в то время как рост С. rubescens не был отмечен (рис. 4а). Рост бактерий, тем временем, наблюдался для сокультур с микроводорослью С. rubescens и не был отмечен для культуры H. rubescens (рис. 4б). Полученные данные могут свидетельствовать о том, что в сокультурах бактерий и С. rubescens прокариоты обгоняют по скорости роста микроводоросль и, возможно, тем самым не позволяют ей расти. Следовательно, сокультуры всех трех бактерий с H. rubescens NAMSU SBB-20 показали рост микроводоросли, в отличие от сокультур с C. rubescens, что позволяет выбрать полученные ассоциации с первой микроводорослью как перспективные для дальнейшего изучения и биотехнологического применения. Соотношение микроводорослей и бактерий 1:1 являлось более подходящим ввиду большего увеличения оптической плотности сокультуры при D680, что свидетельствует о росте микроводоросли. Для монокультуры микроводоросли H. rubescens NAMSU SBB-20 показано максимальное увеличение оптической плотности в 4,39 раза, для сокультуры в соотношении 1:1 с Pedobacter sp. BR(2)2 – в 7,73 раз, для сокультуры с Arsenicitalea sp. CR(2)5.1 - 4,62, для сокультуры с Rhodococcus sp. – в 3,31 раз (рис. 5а).Анализ изменения пигментов у сокультур H. rubescens с бактериями показал увеличение содержания каротиноидов у сокультур с бактериями Rhodococcus sp. BGA(1)1 и Arsenicitalea sp. CR(2)5.1 по сравнению монокультурой микроводоросли даже на стадии вегетативного роста. Концентрации данных пигментов в сокультурах составили 2,14 и 1,99 мг/л, а также 1,96 и 1,84 мг/л для Rhodococcus sp. BGA(1)1 и Arsenicitalea sp. CR(2)5.1, соответственно (данные приведены последовательно для соотношения 1:1 и 1:0,5). Монокультура в конце эксперимента содержала каротиноиды в биомассе своих клеток в концентрации 1,72 мг/л (рис. 5б). Следовательно, две указанные сокультуры имеют биотехнологический потенциал, выражающийся в увеличении скорости роста микроводоросли и возрастании накопления каротиноидов. Таким образом, в рамках выполнения работ по гранту за 2022 год был описан таксономический состав микробиома трех штаммов микроводорослей C. rubescens NAMSU R1, B. aggregatus NAMSU BM5/15, H. rubescens NAMSU SBB-20. Выявлено, что общими бактериями в трех микробиомах являлись: Devosia, Microbacterium и представители семейств Comamonadaceae и Rhizobiaceae. Получены сокультуры для штаммов микроводорослей C. rubescens NAMSU R1 и H. rubescens NAMSU SBB-20 и трех штаммов бактерий. Показано улучшение ростовых характеристик и увеличение накопления каротиноидов для сокультур H. rubescens NAMSU SBB-20 с бактериями Rhodococcus sp. BGA(1)1 и Arsenicitalea sp. CR(2)5.1 по сравнению с монокультурой. Полученные две альго-бактериальные ассоциации обладают биотехнологическим потенциалом в качестве продуцентов каротиноидов. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ Зайцев П.А., Кузин А.И., Шурыгин Б.М., Скрипникова Е.В., Карпухина С.А., Зайцева А.А., Соловченко А.Е. Оценка влияния удобрений на микробиом яблони методом днк-метабаркодинга. – Российские нанотехнологии». – 2023. Зайцева А.А., Бахарева Д. А., Зайцев П. А., Лобакова Е. С. Характеристика нового галотолерантного арктического штамма каротиногенной микроводоросли Halochlorella rubescens NAMSU SBB-20. –Физиология растений. – 2023. – Т. 70. – № 3. Bates S. T., Berg-Lyons D., Caporaso J. G., Walters W. A., Knight R., Fierer N. Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil //The ISME journal. – 2011. – V. 5. – №. 5. – P. 908 Лысак Л. В., Скворцова И. Н., Добровольская Т. Г. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. –М.: МАКС пресс, 2003. – 120 с. Stanier R. Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) // Bacteriol. Rev.– 1971. – Vol. 35, N 2. – P. 171. Solovchenko, A. E., Vasilieva, S. G., Zaitsev, P., Lukyanov, A. A., Skripnikova, E. V., & Antal, T. K. (2022). Approaches to rapid screening of pharmaceutical xenobiotic effects on microalgae via monitoring of photosynthetic apparatus condition. Journal of Applied Phycology, 34(1), 353-361.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".