Влияние G-квадруплексных структур ДНК на функционирование систем репарации при канцерогенезе на примере промоторной области гена TERTНИР

The effect of G-quadruplex DNA structures on the functioning of repair systems in carcinogenesis by the example of TERT gene promoter region

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 26 апреля 2021 г.-15 декабря 2021 г. Влияние G-квадруплексных структур ДНК на функционирование систем репарации при канцерогенезе на примере промоторной области гена TERT
Результаты этапа: 1. Показано, что в промоторах гена TERT различных млекопитающих находятся 3 консервативные последовательности, способные к образованию G4-квадруплекса. В промоторе гена TERT человека выявлены 9 онкоассоциированных мутаций по информации из базы данных COSMIC. Три из онкоассоциированных мутаций находятся в одном из двух G-богатых районов промотора TERT, четыре - в другом, и только две такие мутации расположены вне G-богатых районов анализируемого промотора. Соматические мутации промотора гена TERT, ассоциированные с РМП, также находятся в G4-мотиве. В промоторах других семи онкогенов ни одна из онкоассоциированных мутаций из базы данных COSMIC не локализована в G-богатых районах TERT-промотора. 2. Сконструированы и синтезированы компоненты линейных одно- и двухцепочечных модельных систем, содержащих 68-звенные G-богатые участки нативного или мутированного промотора гена TERT, а также фрагменты ДНК, используемые в качестве контролей. Результаты, полученные методами химического пробинга (с ДМС в качестве модифицирующего реагента) и УФ-спектроскопии, подтверждают структуру из трех тандемно расположенных G4, которая образуется 12 G-трактами TERT-промотора человека в составе 96-98-звенных одноцепочечных моделей. 3. Показано образование транскриптов с G-богатой (нематричной) цепи промоторной области гена TERT рядом с местом сосредоточения канцерогенных мутаций, что может являться фактором стабилизации квадруплексных структур. 4. Установлено влияние структурных особенностей G-квадруплексов на эффективность удаления повреждений, локализованных внутри или в непосредственной близости от них, под действием ключевых белков систем эксцизионной репарации – MutS и MutL (система репарации «мисматчей», MMR) и урацил-ДНК-гликозилазы (система эксцизионной репарации оснований, BER). 5. Исследован гидролиз модельных ДНК, содержащих дезоксиуридин в структуре единичного параллельного внутримолекулярного G-квадруплекса и в трехквадруплексной структуре, образуемой G-богатой цепью TERT-промотора, двумя урацил-ДНК-гликозилазами: UNG2 человека и УДГ из E. coli
2 24 апреля 2022 г.-15 декабря 2022 г. Влияние G-квадруплексных структур ДНК на функционирование систем репарации при канцерогенезе на примере промоторной области гена TERT
Результаты этапа: 1. Решение основной биоинформатической задачи проекта: 1.1. Унификация алгоритма поиска G-мотивов. В последовательностях промоторов генов TERT млекопитающих выполнен поиск G4-мотивов (далее G4), с использованием трех программ с различающимися алгоритмами: G4Hunter (пакет python), QGRS mapper (веб-сервис) и pqsfinder (веб-сервис). Результаты поиска с помощью трех алгоритмов во многих случаях не совпадают. С помощью построения пангеномов совокупностей промоторов генов TERT рассматриваемой группы организмов программой NPG-explorer (https://github.com/npge/npge) были проанализированы квадруплексы, координаты которых выдавались разными программами. Так, pqsfinder и G4Hunter обнаруживают G-квадруплексы, которые имеют в своем составе G-тракты из двух нуклеотидов. Такие G-квадруплексы мы не рассматривали, так как они недостаточно стабильны. Кроме того, алгоритм pqsfinder ищет несовершенные G-квадруплексы (с некомплементарными парами или «мисматчами» и выпетливаниями), а алгоритм G4Hunter, учитывая долю G или C в последовательности и неравномерность распределения G/С между комплементарными цепями, не фиксирует количество G в G-тракте и нуклеотидов в петле. В результате в этом году был выбран поиск по паттерну G3+L1-30G3+L1-30G3+L1-30G3+ с помощью веб-сервиса QGRS mapper (GxNy1GxNy2GxNy3Gx,, где x – число гуаниновых тетрад в G-квадруплексе, y – длина петли). На Рис. 1 представлена гистограмма расположения G-квадруплексов в промоторной области относительно старта транскрипции. 1.2. Выявление консервативных G4 в промоторах гена TERT у 158 млекопитающих, определение частоты встречаемости и характер мутаций в них. Для анализа были использованы промоторные области размером 1001 пар нуклеотидов (п.н.) генов TERT у 158 млекопитающих из отрядов: грызуны (30), хищные (29), приматы (29), парнокопытные (26), рукокрылые (17), непарнокопытные (4), двурезцовые сумчатые (3), насекомоядные (3), афросорициды (2), зайцеобразные (2), однопроходные (2), панголины (2), броненосцы (1), хищные сумчатые (1), опоссумы (1), прыгунчики (1), неполнозубые (1), хоботные (1), тупайи (1), сирены (1), трубкозубые (1) геном. Число рассматриваемых геномов указано в скобках. Найдены G4 в промоторах гена TERT у 149 млекопитающих в кодирующей и комплементарной цепях. G4 не обнаружены в промоторах гена TERT у 9 видов, из которых 4 вида грызунов, 2 вида приматов, 2 вида рукокрылых, и рассмотренный вид хищные сумчатых. Из полученных данных следует, что большинство G4 расположены в ближней части промоторной области гена TERT (до 400 п.н.) в некодирующей цепи. Для выявления консервативных G4-мотивов был построен так называемый «нуклеотидный пангеном» (НПГ) промоторных областей размером 1001 п.н. перед стартом транскрипции гена TERT в геномах 149 млекопитающих с помощью программы NPG-explorer (https://github.com/npge/npge). Для приматов построен НПГ из промоторов 27 генов TERT, в которых присутствовали G4. Всего в НПГ найдено 149 G4. Пример группы консервативных G-квадруплексов и нуклеотидных замен в них см. на Рис. 2. Проанализированы типы нуклеотидых замен по группам. В промоторах генов TERT хищников число G4 максимально по сравнению с генами TERT приматов и парнокопытных. Наиболее частые однонуклеотидные замены в G4 на кодирующей цепи TERT-промотора у приматов в целом G>C (G>А у человекообразных обезьян), а у парнокопытных и хищников C>T. Следует отметить, что замены G>А и С>Т в промоторе гена TERT встречаются у млекопитающих при некоторых видах рака. Общность G4 в различных группах говорит о возможной функциональности G4 в промотере гена TERT. На следующем этапе работы необходимо было проверить наличие G4 в промоторах онкогенов человека. В рассмотрение были взяты промоторы 8 онкогенов TERT, EGFR, MYC, KRAS, TP53, ERBB2, BCL2, SRC. В 7 из них, кроме промотора TP53, были найдены G4. Всего квадруплексов на обеих цепях 7 онкогенов оказалось 21. В качестве генов, не связанных с возникновением онкологических заболеваний, рассматривались 5 генов домашнего хозяйства – ACTB, GADPH, B2M, PGK1, HPRT1. В промоторах 4 из них, кроме промотора гена B2M, также были найдены G4 (в сумме на обеих цепях 16). На Рис. 3 представлен анализ расположения G-квадруплексов относительно точки инициации транскрипции. В большинстве случаев G-квадруплексы и у онкогенов, и у генов домашнего хозяйства находятся на расстоянии 200-299 нуклеотидов от старта транскрипции. 1.3. Сравнение частоты появления точечных мутаций в G4 с частотой мутаций в участках с похожим GC-составом, но не склонных к формированию G4. В G4, найденных в промоторах выбранных онкогенов и генов домашнего хозяйства квадруплексах, проводили поиск единичных однонуклеотидных замен (SNV) с помощью базы данных dbSNP. В каждом G4 определяли плотность мутаций. В качестве контроля рассматривали участки промоторов с GC-составом, близким к 80%, онкогена TP53, гена домашнего хозяйства B2M, в которых также не было найдено G4-мотивов. В качестве контроля также брались межквадруплексные участки в промоторах, в которых GC-состав больше или равен 80%. Установлено, что наиболее частая плотность SNV в G4-мотивах промоторов составляет 50-60%, в то время как в межквадруплексных участках и контрольных генах наиболее частая плотность SNV ниже и составляет 30-40%. Проведен поиск G4 в телах онкогенов, а также в межквадруплексных участках в телах онкогенов. В рассмотрение брали онкогены – TERT, KRAS, EGFR, MYC. Находящиеся в них G4 имели G-score по QGRS mapper > 70, что говорит о том, что данные последовательности формируют стабильные квадруплексы. Наиболее частая плотность SNV в G4 тел онкогенов составляет 40-50%, в то время как для промоторных областей онкогенов наиболее частая плотность составляет 50-60% (Рис. 4). 1.4. Анализ «мутационных подписей» в G4. Мутационными подписями называют комбинацию вероятностей возникновения мутаций в конкретном положении в зависимости от окружающего его нуклеотидного контекста. (Alexandrov et al., Nature, 2020). Описанные в статье Александрова мутационные подписи основаны на реальных данных из базы данных PCAWG (Pan-Cancer Analysis of Whole Genome Project, https://dcc.icgc.org/pcawg), дополненных информацией из других баз данных (представлены на сайте COSMIC https://cancer.sanger.ac.uk/signatures/). Каждая мутация рассматривается в трехнуклеотидном контексте (нуклеотид слева от точечной замены, нуклеотид справа). Используя описанный подход мы проанализировали G4 онкогенов, предсказанные в п.1.3. Показано, что в промоторах онкогенов чаще всего встречается замена С>T, на 2 месте - C>G, на 3 месте - C>A, на 4 месте - T>C, на 5 и 6 - T>G и T>A, соответственно. Этот результат коррелирует с данными COSMIC, где по сравнению с остальными типами замен в сигнатуре высокая встречаемость замен C>T у 22 сигнатур, C>A у 19 сигнатур, T>C у 15 сигнатур, T>A у 8 сигнатур, T>G у 6 сигнатур, C>G у 4 сигнатур. Большое число замен C>G в наших результатах объясняется тем, что рассматривались только G4 онкогенов, которые имеют высокий GC-состав. Мы установили, что мутация C>T в нуклеотидной последовательности CG на первой позиции характерна для промоторов онкогенов: TERT, EGFR, MYC, KRAS, ERBB2, BCL2. Она встречается 27 раз (учитываются и кодирующие, и некодирующие цепи). 1.5. В 2022 г. база данных Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes project была заблокирована на территории РФ. Нами разработана альтернативная стратегия исследования влияния мутаций на экспрессию в конкретном типе опухоли. Данные по геному накапливаются, исходя из анализа публикаций, данные по экспрессии генов берутся из базы данных GEO (Gene Expression Omnibus). Эта работа будет продолжена в 2023 г. 1.6. Для определения частоты появления соматических мутаций в G4 областей генома, предшествующих онкогенам и генам, не связанным с возникновением онкологических заболеваний рассматривали 7 онкогенов, в которых присутствовали G4 – TERT, EGFR, MYC, KRAS, ERBB2, BCL2, SRC, и 5 генов домашнего хозяйства – ACTB, GADPH, B2M, PGK1, HPRT1. Наиболее частая плотность однонуклеотидных замен в G4 промоторных областей онкогенов и генов домашнего хозяйства составляет 50-60%. Однако у онкогенов существуют G4 с плотностью мутаций 60-70%, а у генов домашнего хозяйства такие мотивы отсутствуют. Таким образом, плотность мутаций в G4 онкогенов в целом выше, чем плотность мутаций в G4 генов, которые не ассоциированы с онкологическими заболеваниями. 2. Разработка репортерной системы in vivo на основе клеток E. coli для исследования G4-структуры TERT-промотора . Для получения репортерной системы использована опубликованная конструкция pRFPCER, содержащая гены двух флуоресцентных белков: одного - репортерного (RFP), а второго – контрольного, Сerulean (CER) (Osterman et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2012; Osterman et al., NAR, 2013; Polikanov et al., Mol. Cell, 2014), транскрипция которых находится под контролем двух отдельных промоторов T5. Это гарантирует независимость синтеза двух белков друг от друга. Мы встроили G-богатый участок промоторной области гена hTERT в район между вторым T5-промотором и геном CER, в то время как эффективность синтеза белка с гена RFP будет служила внутренним контролем общего уровня синтеза белков в клетке (Рис. 5). Область промотора TERT для встраивания размером 41 п.н., содержала участок, несущий онкогенные мутации в положениях -124 и -146 от старта транскрипции TERT. Кроме нативного двуцепочечного фрагмента клонировали последовательности с нуклеотидными заменами G124A и G146A в G-богатой цепи, а также с двойной заменой G124A/G146A. Вектор pRFPCER линеаризовали с помощью эндонуклеаз рестрикции SacII и NdeI. Двуцепочечные фрагменты промотора TERT формировали из синтетических 5’-фосфорилированных олигонуклеотидов длиной 41 и 45 п.н. так, что они имели «липкие» концы, необходимые для включения в линеаризованный вектор. Клонирование проводили по классическому протоколу с клетками E. coli XL1-Blue. Из выросших колоний выделяли плазмидную ДНК с помощью набора (Plasmid Miniprep, Евроген, Россия). Корректность полученных конструкций подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием. В результате были получены плазмиды на основе pRFPCER, содержащие последовательность промотора гена TERT - природную или с нуклеотидными заменами (pWT, pG124A, pG146A и pG124A/G146A). Для проверки флуоресцентных свойств систем клетки E. coli К12 трансформировали полученными репортерными конструкциями и значения флуоресценции в максимуме для белка CER (длины волн поглощения/испускания 430/475) нормировали на флуоресценцию RFP в максимуме (длины волн поглощения/испускания 550/570). В случае pWT показано уменьшение в 3 раза относительного сигнала флуоресценции CER, по сравнению с контрольной конструкцией без вставки. Для pG146A наблюдалось уменьшение сигнала флуоресценции CER по сравнению с плазмидой без вставки в 2 раза, а в случае pG124A сигнал флуоресценции CER отличается от такового для pRFPCER незначительно (менее чем в 1,3 раза). Клетки с pG124A/G146A демонстрировали сравнимый сигнал флуоресценции CER с плазмидой без вставки (Рис. 6). Понижение сигнала флуоресценции можно объяснить образованием G4 в плазмидной конструкции in vivo. Введение замен G>А в определенные положения дестабилизируют G4, причем, согласно полученным данным, степень дестабилизации сильнее в случае G124A по сравнению с G146A. В случае же двойной замены (pG124A/G146A) квадруплексная структура не образуется. Полученные данные подтверждают формирование G4 в последовательности в составе сверхспирализованной ДНК. Для подтверждения влияния G4 на синтез белка CER в клетках E. coli использовали низкомолекулярные лиганды BRACO19, TMPyP4, PhenDC3, известные как стабилизаторы G4-структуры. Для проведения этого эксперимента использовали штамм E. coli BW25113 c повышенной проницаемостью клеточной стенки бактерий для низкомолекулярных соединений (Osterman et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2012). Показано, что добавление возрастающих концентраций лиганда TMPyP4 приводит к общему уменьшению синтеза обоих флуоресцентных белков. В случае лигандов BRACO19 и PhenDC3 наблюдалось незначительные разнонаправленные эффекты. 3. Изучение особенностей транскрипции с G-цепи промотора гена TERT (продолжение работ, начатых в 2021 г.). 3.1. Определение первичной структуры РНК, синтезирующейся с G-цепи в области TERT-промотора. В 2021 г. нами изучена транскрипция промотора гена TERT, где промотерная область используется в качестве матрицывнутри координат 1295497-1296908 (GRCh38.p13), так как образование транскриптов может являться фактором стабилизации квадруплексных структур. Для определения первичной структуры новой РНКпроводили обратную транскрипцию, сопряженную с ПЦР (ОТ-ПЦР) со специфическими праймерами к тестируемому региону генома (1295493-1296914, Chr 5, GRCh38.p14). Секвенирование продуктов реакциипоказало, что нуклеотидная последовательность продуктов ОТ-ПЦР совпадает с целевым районом генома. Далее былипроведены исследования по определению концов методами 5’-RACE и 3’-RACE. Для 5’-RACE была использована модифицированная система компании NEB (США) с особой обратной транскриптазой (ОТ), способной к переключению матрицы, и амплификацией Q5-полимеразой. Ген-специфические праймеры (Таблица 1) позволили получить ПЦР-продукт,клонировать его в вектор pMiniT 2.0 и секвенировать. Определеннаянуклеотидная последовательность не совпала с промоторным районом гена TERT, что возможно в случае слабо представленности исследуемого транскрипта согласно данным производителя. Для определения 3’-конца использовали систему 3’-RACE Thermo Fisher Scientific (США) с дополнительным полиаденилированием с помощью набора Poly(A)-tailing hermo Fisher Scientific (США) тотальной РНК, выделенной из клеток линии рака легкого A549 (РНК была максимально представлена по данным ОТ-ПЦР). В результате были получены 3 продукта. Это не позволило определить уникальный конец транскрипта. В 2021 г. вышла работа Hafezi и соавт. (Biomedicines, 2021), где показана транскрипция с исследуемого нами региона генома и определен только 5’-конец. РНК, названа TAPAS (TERT Antisense Promoter ASsociated RNA). Конец определили с помощью набора микрочипов (Tiling array), что подтверждает низкий уровень экспрессии РНК TAPAS, так как классические RACE-системы не работают на слабо представленной РНК.. 3.2. Проверку возможности транскрипции с G-цепи промотора TERT в других клеточных линиях человека в клеточной линии, иммортализованной по теломераза-независимому механизму, проводили на суммарной РНК, выделенной из клеток линии человека VA13. Это фибробласты легкого, иммортализированные SV40 с неактивной теломеразой (Cerone et al., Hum. Mol. Genet., 2001). Методом ОТ-ПЦР показали, что РНК TAPAS присутствует в этой линии и слабо представлена. Это аргумент в пользу того, что РНК TAPAS не является активатором промотора гена TERT. 3.3. Создание системы подавления транскрипции РНК TAPAS. Для снижения уровня экспрессии РНК TAPAS in vivo было предложено использовать метод РНК-интерференции в формате малых шпилечных РНК (shPHK). Для проведения нокдауна гена РНК TAPAS мы выбрали лентивирусную систему векторов LeGO (Addgene, США). Такая система обеспечивает постоянную экспрессию малых шпилечных РНК, что приводит к конститутивному нокдауну. При анализе последовательности вектора LeGO-G оказалось, что существует очень немного вариантов клонирования в него последовательности (42-62 п.н.), обеспечивающей экспрессию shRNA. Клонирование по сайтам ЭР HpaI и XhoI не дало положительных клонов. Другая схема подразумевала клонирование по сайтам ЭР HpaI и NotI. Третья схема являлась по сути ПЦР с вектора в качестве матрицы с праймерами, содержащими адаптерные последовательности с 5’-концов, позволяющие сформировать после самолигирования плазмиду с целевой вставкой из ПЦР-продукта. Оба последних варианта встраивания целевых последовательностей оказались рабочими, но с разной степенью эффективности (по данным секвенирования были получены 18 положительных клонов из 32 для первой схемы и 2 из 16 для второй). В результате были собраны целевые конструкции для нокдауна гена РНК TAPAS. Достоверный анализ эффективности нокдауна и эффекта на экспрессию гена TERT с помощью классической ОТ-ПЦР провести не удалось вследствие низкой представленности РНК TAPAS. 4. Оценка топологии и термодинамической стабильности G4 структур в сконструированных линейных ДНК-моделях с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД). Для изучения влияния G4 структуры на процессы репарации точечных повреждений ДНК нами в 2021 г. была разработана линейная модельная система, в которой внутримолекулярные квадруплексные структуры TERT-промотора были закреплены в двуспиральном ДНК-контексте. С помощью анализа температурной зависимости УФ-поглощения при 260 нм было показано, что дуплексные участки (15 п.н.), фланкирующие G4-мотив TERT-промотора, имеют Тпл 55ºС, удерживая всю конструкцию в термодинамически стабильном состоянии. В 2022 г. мы охарактеризовали устойчивость мультиквадруплексной структуры, образуемой TERT-промотором в дуплексном окружении, методом КД. Для этого после «отжига» в специально разработанных условиях были записаны спектры КД при разных температурах в 8 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 20 мМ КСl, и прослежена температурная зависимость амплитуды положительной полосы при 264 нм. Измерения проводились на дихрографе Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., UK), снабженном температурным контроллером Peltier. Было показано, что Тпл TERT-квадруплекса составляет 55-57ºС, слегка варьируя в зависимости от характера сочленения дуплексной и квадруплексной структур. То есть, особенностью сконструированной модельной системы является практически совпадение термической стабильности дуплексного и квадруплексного доменов. Используя полученные с помощью метода КД данные, были рассчитаны значения энтальпия и энтропия образования мультиквадруплексных структур TERT-промотора, а также свободная энергия его внутримолекулярной сборки (при 298 К). Независимо от того, является ли мультиквадруплекс TERT частью одноцепочечной или дуплексной системы, его спектр КД имеет положительную полосу при 264 нм, что свидетельствует о параллельной топологии образующегося квадруплексного тандема. 5. Исследование узнавания неканонических структур системами репарации «мисматчей» (MMR) и эксцизионной репарации оснований (BER). 5.1. Синтез ДНК-моделей G-богатой цепи TERT-промотора человека с точечными повреждениями остатков G и характеристика их вторичной структуры методом КД. Известно, что точечные замены C на T или А в положениях -124 и -146, а также двойная замена С>А в положении -138,139 относительно стартового кодона в кодирующей цепи промотора гена TERT человека встречаются с высокой частотой при таких видах рака, как глиобластома, меланома и рак мочевого пузыря (Yanfang et al., Front. Endocrinol., 2020; Rengyun et al., Endocr. Relat. Cancer, 2016; Friederike et al., Melanoma Res., 2014, ; So Young et al., BMC Med. Genomics, 2022; Xiao et al., Lung Cancer, 2014; Zvereva et al., IJMS, 2020). Нами предложена гипотеза, заключающаяся в том, что появление указанных неудаляемых тканеспецифических мутаций связано с нарушением репарации геномных повреждений в G-богатых областях, комплементарных кодирующей цепи и способных в определенных условиях к формированию трех тандемных параллельных G4. Одним из наиболее распространенных окислительных повреждений dG является 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (oxo-dG), мутагенный потенциал которого определяется способностью ДНК-полимераз встраивать A напротив этого окислительного повреждения (Van Loon et al., DNA Repair, 2010). Повреждения, которые образуются в результате окисления гуанина в геномной ДНК человека, исправляются системой BER, ключевыми ферментами которой являются OGG1 (8-оксогуанин ДНК-гликозилаза) и APE1 (AP-эндонуклеаза) (Chatterjee et al., Inv. Mol. Mutagen., 2017). Механизм репарации заключается в том, что поврежденное основание распознается специфичной к нему ДНК-гликозилазой, гидролизующей N-гликозидную связь между поврежденным основанием и углеводофосфатным остовом (Zharkov et al., Cell. Mol. Life Sci., 2008). Образовавшийся АР-сайт является субстратом для АР-эндонуклеазы, которая вносит одноцепочечный разрыв в ДНК. В случае невозможности эффективного функционирования АР-эндонуклеазы ДНК-полимеразы могут с разной вероятностью встраивать напротив АР-сайта остатки A, T или C. Для исследования влияния мультиквадруплексной структуры в промоторной области гена TERT человека на эффективность удаления повреждений, локализованных внутри G-богатого фрагмента промотора, под действием белков системы BER нами были сконструированы ДНК-модели. Они представляют собой 96-звенные фрагменты матричной G-богатой цепи промотора гена, в каждом из которых остаток G в позициях 124, 146, 138, 139 или 138+139 (район ценральной G4 единицы в трехквадруплексном тандеме TERT-промотора) был заменен на охо-dG (oxoG124, oxoG146, oxoG138, oxoG139 и oxoG138,139, соответственно) или аналог АР-сайта - 2-метокси-3-окситетрагидрофуран, THF - (АР124, АР146, АР138, АРG139 и АР138,139, соответственно). Необходимые фрагменты ДНК были синтезированы в НПК «Синтол» с использованием коммерческих амидофосфитов модифицированных нуклеозидов фирмы Glen Research (США) и содержали флуоресцентную метку TAMRA на 3'-конце. В качестве контролей использовали следующие 96-звенные ДНК-модели: мономодифицированный олигонуклеотид, в первичной структуре которого отсутствовал G4-мотив (oxoG-рэндом или АР-рэндом), а также немодифицированный олигонуклеотид, способный складываться в мультиквадруплексную структуру TERT-промотора (96TERT-wt). Методом КД-спектроскопии было показано, что независимо от точечных замен остатка dG топология мультиквадруплексной системы TERT-промотора остается параллельной. Кривые плавления охо-dG-содержащих производных показывают заметно меньшую кооперативность перехода G4-клубок, а значения их Тпл примерно на 5ºС ниже такового для немодифицированного аналога; при этом положение модификации мало влияет на кооперативность и термическую стабильность охо-dG-содержащих 96-звенных олигонуклеотидов. Для АР-сайт-содержащих производных наблюдаются другие закономерности. Отсутствие гуанина, очевидно, оказывает еще более разрушительное действие на целостность G4, чем его окисление, т.к. полностью теряется один из G-квартетов. В нашей серии АР-содержащих фрагментов ДНК наблюдается уменьшение кооперативности конформационного перехода и уменьшение значений Тпл (от 3 до 7ºС относительно Тпл контроля) в зависимости от позиции модификации в центральном G4 мультиквадруплексной структуры TERT-промотора. 5.2. Анализ эффективности удаления точечных окислительных повреждений, локализованных в 96-звенной G-богатой матричной цепи промотора гена TERT, белками системы BER. Генно-инженерный белок OGG1 человека был выделен в лаборатории проф. Д.О. Жаркова (ИХБФМ СО РАН). Используя ДНК-модели: oxoG124, oxoG146, oxoG138, oxoG139 и oxoG138,139, мы проанализировали эффективность удаления oxo-dG из рассматриваемого района TERT-промотора ферментом OGG1. Предварительно проводили «отжиг» ДНК в условиях, способствующих формированию G4 структур (120 мМ KCl). Наибольшая эффективность гидролиза белком OGG1 наблюдалась для oxoG-рэндом (около 75%). Контрольная ДНК 96TERT-wt не расщеплялась ферментом. Эффективность удаления окислительного повреждения во фрагменте промотора TERT зависела от ее положения в G-трактах и изменялась в ряду: oxoG138,139 > oxoG138 ≈ oxoG139 > oxoG124 > oxoG146. В случае oxoG138,139 степень расщепления составляла около 70%, а в случае oxoG138 и oxoG139 - около 50%. Существенное снижение активности OGG1 было зафиксировано для oxoG124 и oxoG146: 16% и 11%, соответственно. Второй важнейший белок системы BER – AP-эндонуклеаза, которая включается в репарацию после образования AP-сайта, например, в ходе удаления окисленного гуанина белком OGG1. В геноме человека обнаружен фермент APE1 (APEX1 или REF1), на который приходится более 95% AP-эндонуклеазной активности в клетках (Wilson et al., Mutation Research, 2001, 485, 283). В присутствии ионов магния APE1 инициирует разрыв фосфодиэфирной связи с 5’-стороны от AP-сайта (Whitaker et al., DNA Repair, 2018, 71, 93). В первую очередь, мы исследовали кинетику гидролиза 96-звенных моделей TERT-промотора, в каждой из которых гуанин в позициях 124, 146, 138, 139 и 138+139 был заменен на THF - стабильный аналог АР-сайта (АР124, АР146, АР138, АРG139 и АР138,139, соответственно), в условиях формирования квадруплекса. В качестве контроля использовали АР-рэндом и 96TERT-wt. Для этих экспериментов использовали коммерческий препарат APE1 (New England BioLabs, США). Положение АР-сайта в G4-содержащей ДНК значительно влияло на эффективность расщепления субстрата белком APE1: степень гидролиза была максимальна в случае АР-рэндом (более 80%), а минимальна – для АР124. Степень гидролиза остальных субстратов с АР-сайтом варьировала от 70 до 38%, убывая в ряду: АР138 > АР138,139 > АР146 > АР139. Описанная тенденция сохранялась по крайней мере во временном интервале от 2 до 60 мин. Таким образом, мутагенный потенциал в случае двойного повреждения в положениях 138 и 139 обусловлен в основном повреждением в положении 139, что подтверждается результатами выщепления окисленного гуанина ферментом OGG1 (см. выше). Олигонуклеотид 96TERT-wt без модификации не гидролизовался АРE1. Следующим этапом стало исследование связывания APE1 с теми же ДНК-субстратами. Предварительно проверили наличие ДНК-связывающей активности APE1 методом «торможения в геле» в неденатурирующих условиях. Затем проводили анализ, основанный на измерении интерференции слоя биомолекул. Он позволяет исследовать комплексообразование белков с ДНК в реальном времени и определять физико-химические параметры взаимодействия с высокой точностью (Pastor et al., FEBS J., 2016). Для анализа использовали прибор BLItz (ForteBio, США) и биосенсор с иммобилизованной на нем Ni-NTA-агарозой (Sartorius, Германия). В этих экспериментах использовали генно-инженерный белок APE1 человека, выделенный в лаборатории проф. Д.О. Жаркова (ИХБФМ СО РАН), содержащий последовательность из 6 остатков His на N-конце. По своим гидролитическим свойствам он идентичен коммерческому препарату АРЕ1. Комплексообразование ДНК с ферментом проводили в присутствии Ca2+ в течение 300 с (стадия ассоциации). Стадию диссоциации проводили с помощью реакционного буфера в течение 600 с. Значения эффективности связывания белка APE1 с субстратами АР124, АР146, АР138, АРG139 и АР138,139 значительным образом не отличаются и характеризуются константами диссоциации KD около 3 нМ. KD комплексов APE1 с контрольными олигонуклеотидами АР-рэндом и 96TERT-wt оказалась на порядок выше. По всей видимости, APE1 обладает большим сродством как к АР-сайту внутри G4, по сравнению с АР-сайтом вне квадруплексной структуры, так и к самой G4-структуре, не содержащей апуриновый сайт. Очевидной корреляции между эффективностью гидролиза тестируемых ДНК-субстратов белком APE1 и их сродством к APE1 не отмечено. Поскольку, при слабом связывании с белком, расщепление контрольного АР-рэндом протекает наиболее эффективно по сравнению с другими ДНК, очевидно, что G4-структура затрудняет гидролиз ДНК. С другой стороны, значимой разницы в константах диссоциации комплексов APE1 с ДНК-моделями, в каждой из которых G в позициях 124, 146, 138, 139 и 138+139 был заменен на THF, не наблюдалось, в то время как эффективность их расщепления значительно отличалась. Возможно, это связано с локальным изменением конформации G4 в зависимости от позиции АР-сайта. 5.3. Влияние G4, образованного последовательностью d(GGGT)4 в сконструированной плазмидной конструкции, на функционирование репарационного комплекса белков MMR из E. coli – есMutH-есMutL-есMutS, а также на эндонуклеазную функцию MutL из N. gonorrhoeae (ngMutL). Ранее нами была проверена активация MMR на модельных линейных фрагментах ДНК, содержащих единичный параллельный G4, образованный последовательностью d(GGGT)4, который был стабилизирован в дуплексном окружении (Pavlova et al., IJMS, 2020 ). Полученные результатытребовали подтверждения на плазмидных ковалентно замкнутых ДНК, использование которых позволяет избежать неспецифического взаимодействия белка MutS с концами ДНК-дуплекса (Acharya et al., Mol. Cell 2003), что может искажать процесс активации MMR. В 2021 г. нами была получена плазмидная конструкция (G4-pUC), содержащая G4-структуру, образованную d(GGGT)4, которая стабилизировалась в дуплексном контексте за счет отсутствия в противоположной цепи последовательности, комплементарной G4-мотиву. В качестве контрольных были получены плазмидные ДНК, содержащие неструктурированную петлю d(GT)8 (loop-pUC), вместо G4, G/T-«мисматч» (G/T-pUC) и каноническую G/C-пару (G/C-pUC). Образование G4-структуры в G4-pUC было подтверждено методами «остановки Taq-полимеразы» (см. отчет 2021 г.), а в отчетном году еще и «пробингом» диметилсульфатом (ДМС). Химическую модификацию ДНК проводили в соответствии с методикой, опубликованной ранее (Sun et al., NAR., 2011). Продукты реакции разделяли в 10%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Результаты гель-электрофореза представлены на Рис. 7. Показано, что для плазмиды G4-pUC в условиях, способствующих формированию G4 (100 мМ KСl), наблюдается уменьшение интенсивности флуоресценции зон (в 1,5 раза) в районе 76-91 н.о. по сравнению с loop-pUC, что свидетельствует об образовании G4-структуры, в которой N7 положения гуанинов, вовлеченных в образование Хугстиновских Н-связей, защищены от модификации ДМС. Повышенная интенсивность зон выше и ниже G4-мотива свидетельствует об экспонировании Хугстиновской стороны оснований химическому реагенту из-за измененной конформации нуклеотидных остатков на границе квадруплексной и дуплексной форм. Далее мы изучили влияние G4 на способность комплекса есMutH-есMutL-есMutS вносить одноцепочечный разрыв (активировать MMR), используя все сконструированные ДНК-плазмиды (10 нМ). Их инкубировали с белками есMutS (250 нМ), есMutL (250 нМ) и есMutH (100 нМ) в течение 1 ч при 37ºС. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле, содержащим бромид этидия. Эффективность гидролиза определяли по накоплению плазмиды с одноцепочечным разрывом. Продемонстрировано, что степень гидролиза плазмид, содержащих неструктурированную петлю и G4, практически не отличается от контрольной плазмиды G/C-pUC с канонической G/C-парой (менее 10%), в то время как G/T-содержащая плазмида гидролизовалась активным комплексом есMutH-есMutL-есMutS более чем на 60% (Рис. 8). Полученные результаты свидетельствуют о том, что система ММR не распознаёт G4-структуру как «ошибку», что подтверждает наши данные, полученные на линейном ДНК-дуплексе. Также перечисленные выше плазмидные субстраты использовались для проверки их способности активировать белок ngMutL. Известно, что ngMutL способен вносить одноцепочечный разрыв в плазмидные ДНК даже в отсутствие MutS (Namadurai et al., PLoS One, 2010). Показано, что эффективность гидролиза плазмидной ДНК, содержащей G4, такая же, как и в случае контрольной плазмиды G/C-pUC. Таким образом, мы впервые проверили способность белков MMR распознавать одиночный G4, стабилизированный в плазмидной ДНК, и доказали, что G4 не является субстратом для системы репарации неканонических пар E. coli и N. gonorrhoeae. 5.4. Связывание белков ngMutS и ngMut с модельными системами, содержащими G4-структуру в промоторной области гена TERT. Для исследования влияния мультиквадруплексной структуры TERT-промотора человека (96TERT-wt), на функционирование MMR мы выбрали наиболее важные белки этой системы - MutS и MutL. В ходе сравнения аминокислотных последовательностей ecMutS, MSH6 и MSH2 H. sapiens (hMSH6 и hMSH2) нами было выявлено 28% идентичных остатков в последовательностях этих белков (Pavlova et al., Biomedicines, 2022). Сравнение 3D-структур ecMutS (PDB: 1E3M) и hMSH6/hMSH2 (PDB: 2OF8) демонстрирует высокую консервативность функционально важных мотивов MutS, таких как АТФазный домен и домен распознавания «мисматча». Степень идентичности аминокислотных последовательностей N-концевых доменов ecMutL и ngMutL равна 53%, наблюдается структурная схожесть АТФазных и ДНК-связывающих доменов этих белков (Савицкая и др., Биохимия, 2022). Для всех трех белков - MLH1 H. sapiens, ecMutL и N-концевого ngMutL, были обнаружены высоко консервативные мотивы, ответственные за связывание ДНК, а также гидролиз и связывание АТФ (Pavlova et al., Biomedicines, 2022). Аминокислотные последовательности С-концевого домена ngMutL и PMS2 H. apiens идентичны на 22%, а структуры их эндонуклеазных центров консервативны. В связи с гетеродимерным строением MutSα и MutLα для их выделения и последующего использования в работе требуется многоэтапная очистка, так как другие ДНК-связывающие белки могут совыделяться вместе с субъединицами белков MMR. Мы считаем, что их бактериальные гомологи могут быть использованы для предварительного анализа взаимодействия между G4-TERT и MutSα и MutLα человека. В 2021 г. мы установили, что фрагмент промотора гена TERT, способный формировать мультиквадруплексные структуры, более эффективно связывает белки MutS и MutL E. coli по сравнению с «природным» лигандом - ДНК с «мисматчем» или без него (Pavlova et al., Biomedicines, 2022). Предположив, что влияние G4 в ДНК на инициацию MMR в других организмах может отличаться от такового в E. coli, нашей задачей было исследовать взаимодействие ngMutS и ngMutL с модельными системами, представляющими собой фрагмент промоторной области гена TERT человека нативной структуры (96TERT-wt) или содержащий замены G на А в позициях 124, 146, 138+139. В качестве контролей использовали одноцепочечную G4-ДНК (95G4), содержащую единичный параллельный G4, и 96-звенную двуцепочечную ДНК (ds96), не способную формировать G4. Все использованные нами ДНК содержали флуоресцентную метку TAMRA. Выделенный нами ngMutS в соответствии с методикой, опубликованной ранее (Nirwal et al., NAR., 2018), проявлял низкую ДНК-связывающую активность. Несмотря на многочисленные попытки оптимизации условий выделения препарата и условий инкубации ngMutS с ДНК, ДНК-связывающая активность фермента не была зафиксирована. Эффективность комплексообразования ngMutL с ДНК анализировали методом «торможения в геле». В выбранных нами условиях сродство ngMutL к 96TERT-wt с тремя тандемными G4 оказалось в 2,5 раза выше (кажущаяся константа диссоциации (Kdapp) 49±3 нМ), чем к ds96 (Kd 124±5 нМ), но не отличалось существенно от сродства к одноцепочечной ДНК с единичным внутримолекулярным G4, образованном последовательностью d(GGGT)4 (Kdapp 41±1). Полученные данные согласуются с ранее проведенным исследованием связывания есMutL с 96TERT-wt и 95G4, что можно объяснить преимущественным влиянием присутствия структуры G4 в ДНК, а не количеством квадруплексов. Так же как и в случае есMutL, существенного различия в значениях Kdapp комплексов ngMutL с G4-TERT, содержащими нуклеотидные замены, и последовательностью дикого типа не наблюдалось, что подтверждает формирование структур, близких к нативной, для «мутантных» ДНК. С другой стороны, значения Kdapp комплексов G4-TERT с ngMutL примерно в 3,5 раза меньше, чем с есMutL. Чтобы выяснить влияние тандемной трехквадруплексной структуры в промоторе hTERT на эндонуклеазную активность ngMutL, мы сравнили гидролиз ds96, 96TERT-wt, а также двуцепочечную ДНК 96TERT-wt/96, сформированную после гибридизации 96TERT-wt с полностью комплементарным олигонуклеотидом (в этом случае равновесие G4-дуплекс полностью сдвинуто в сторону двуспиральной ДНК). Эффективность реакции гидролиза анализировали методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Расщепление двуцепочечных ДНК под действием ngMutL было неспецифичным и эффективным (около 70% укороченных продуктов). С другой стороны, гидролиз 96TERT-wt был слабо выраженным (около 10%). В ходе анализа электрофореграмм было обнаружено расщепление ДНК в позициях между первым и вторым, а также вторым и третьим G4, но не внутри квадруплексных структур. Наличие нуклеотидных замен в G4-TERT и их позиция не оказывали существенного влияния на эндонуклеазную активность ngMutL. Тем не менее, гидролиз G4-TERT с двойной заменой G на А в позициях 138+139 сопровождался появлением дополнительного продукта расщепления вблизи G139A, что можно объяснить частичной дестабилизаций G4 в области замены. Таким образом, мы установили, что фрагмент промотора гена TERT, способный формировать мультиквадруплексные структуры, более эффективно связывается с белком ngMutL по сравнению с двуцепочечной ДНК, но не является эффективным субстратом для фермента как никующей эндонуклеазы. Замены G124A, G146A и G138А/G139A в последовательности участка промотора гена TERT человека не оказывают значительного влияния на взаимодействие модельных ДНК с ngMutL. 5.5. Низкомолекулярные G4-стабилизирующие лиганды: влияние на «дыхание» дуплексов, структуру фрагмента TERT-промотора и образование комплексов с ним белками MutS и MutL E. сoli. Мы применили G4-узнающие лиганды BRACO19, TMPyP4, PhenDC3 для изучения их влияния на динамическое равновесие, которое реализуется in vivo между двойной спиралью геномной ДНК и G4-структурой. В качестве модели был использован ДНК-дуплекс 96TERT-wt/96, образованный гибридизацией 96-звенного олигонуклеотида с G4-мотивом TERT-промотора дикого типа с полностью комплементарной ему цепью. Для изучения «дыхания» ДНК-дуплекса, то есть его локального раскрытия, способствующего конформационной перестройке в неканоническую структуру, была использована методика Sun et al. (NAR, 2005 ). Результаты эксперимента, проведенного в присутствии BRACO19 или TMPyP2, а также избытка G-богатой цепи, не показали видимого смещения равновесия дуплекса к G4 даже при высоких концентрациях G4-лигандов. Использование других G4-специфичных соединений, относящихся к классу вторичных растительных метаболитов - тимохинона, сангвинарина и кверцетина, также не показали сдвига равновесия дуплекс – G4. В то же время, G4-стабилизирующая активность BRACO19 была показана методом остановки Taq-полимеразы в плазмиде pUC19 со встроенным двуспиральным промоторным участком hTERT, как дикого типа, так и содержащим замены G124A и G124A/G146A в G-трактах. В отсутствие K+ и BRACO19 наблюдали образование протяженных продуктов полимеразной реакции, что свидетельствовало о беспрепятственном прохождении полимеразой Taq участка с G4-мотивами TERT-промотора для всех изученных плазмид. В присутствии 100 мМ KCl движение полимеразы дальше начала G4-мотива блокируется полностью (в случае вставки 96TERT-wt/96) или частично (в случае вставок с заменами G124A и G124A/G146A в G-богатой цепи дуплекса). При добавлении BRACO19 для плазмид наблюдалась полная остановка Taq-полимеразы, что свидетельствует об образовании одинаково устойчивых G4-структур. Выше мы показали, что белки MutS и MutL из системы MMR E. coli и N. gonorrhoeae эффективно связывают мультиквадруплекс TERT-промотора с последовательностями дикого типа и с точечными заменами G>A. Оставалось неясным, как присутствие G4-стабилизирующих лиганов влияет на это взаимодействие. Возможно, что индуцированная лигандами стабилизация G4 будет способствовать увеличению сродства белков MMR к ДНК, cодержащим G4-мотивы. С другой стороны, G4-лиганды могут экранировать важные для взаимодействия MutS/MutL сайты в квадруплексах. Влияние лигандов BRACO19, TMPyP4 и PhenDC3 на комплексообразование белков ecMutS, ecMutL и ngMutL с мультиквадруплексной системой промотора гена TERT дикого типа и содержащего замены G>A было изучено методом «торможения в геле». Соотношение лиганд-ДНК варьировалось с 2:1 до 20:1. Показано, что небольшой избыток лиганда не влияет на эффективность связывания ecMutS, ecMutL и ngMutL с различными вариантами G-богатого фрагмента промотора гена TERT, в то время как 20-кратный избыток G4-лиганда снижает эффективность образования комплексов белков с рассматриваемыми ДНК в 1,5-2 раза; значимой разницы между мутантными последовательностями ДНК не обнаружено. Таким образом, G4-лиганды конкурируют с белками MMR за сайты связывания, что подтверждает взаимодействие ecMutS, ecMutL и ngMutL именно с G4-структурой. Хотя вторичные растительные метаболиты как G4-лиганды имеют меньший потенциал стабилизации G4-структур и более низкое сродство к ним, чем TMPyP4 и PhenDC3 (Ribaudo et al., J. Nat. Prod. Res., 2020), они обладают антиоксидантными свойствами и противоопухолевой активностью. Поэтому мы дополнительно изучили эффективность связывания соединений этого класса с промоторным G4 на примере параллельного квадруплекса промотора с-Мус. Методами УФ-спектроскопии и КД были охарактеризованы G4-стабилизирующие свойства этих лигандов и показано преимущественное связывание сангвинарина, кверцетина и тимохинона с G4, а не с ДНК-дуплексной мишенью. Количественно фактор селективности для наиболее перспективных растительных метаболитов был оценен методом конкурентного вытеснения флуоресцентного индикатора и составил 9,6 и 224 для сангвинарина и кверцетина, соответственно; тимохинон показал абсолютную селективность к G4. С помощью люциферазного репортерного анализа и ОТ-ПЦР показано, что отобранные растительные метаболиты ингибируют экспрессию с-Мус в линиях злокачественных клеток через G4-опосредованный механизм, причем максимальный эффект проявляет кверцитин, обладающий оптимальной комбинацией эффективности связывания с G4 и селективности (Zenkov et al. IJMS 2022). 5.6. Изучение взаимодействия белков MutS, MutL и MutH из Е. сoli с ДНК-дуплексами, содержащими в N2-положении производные гетероарилов Гетероциклические ароматические амины (HAA), находящиеся в табачном дыме, являются мутагенными агентами , модифицируя N2-аминогруппу гуанинов, которыми обогащен промотор гена TERT. Можно предположить, что такие модифицированные нуклеотиды «отвлекают на себя» белки систем репарации и способствуют закреплению мутаций. В качестве модельных ДНК мы использовали синтезированные и предоставленные ранее (проф. Сейо, Япония) 17-звенные ДНК-дуплексы, содержащие в N2-положении гуанина остатки пиридина, пиридазина, пиримидина или пиразина, а также конформационно закреплёный 3,5-дигидро-11H-пиридо[2',3':4,5]имидазо[1,2-a]пурин-11-он (PIP) — аддукт PIP и гуанина, в котором дополнительный цикл предотвращает вращение внесенной модификации относительно плоскости гуанина (Рис. 9). В рамках проекта изучено взаимодействие есMutS с ДНК-дуплексами, включавшими одну из перечисленных выше модификаций гуанина в составе канонической пары (HAA-G/C) или G/T-«мисматча» (HAA-G/T) (Рис. 9). Показано, что есMutS на порядок эффективнее связывается с модифицированными дуплексами по сравнению с немодифицированной «мисматч»-содержащей двутяжевой ДНК. В экспериментах по конкурентному вытеснению «мисматч»-содержащего 76-звенного дуплекса модифицированными ДНК из белково-нуклеинового комплекса, образованного есMutS (40 нМ) и 76-звенным дуплексом (5 нМ), к реакционной смеси добавляли модифицированные ДНК (0-500 нМ). Константы ингибирования, Ki, для всех исследованных HAА-ДНК, как содержащих, так и не содержащих «мисматч», составили 50–100 нМ. Полученные значения в 2-4 раза ниже таковых для контрольного немодифицированного дуплекса с G/T-«мисматчем» (Ki 210 ± 15 нМ). Комплексы есMutS с ДНК, содержащей только канонические пары оснований, не зафиксированы. Высокое сродство как к HAA-G/C, так и к HAA-G/T-ДНК может свидетельствовать о непосредственном взаимодействии ДНК-связывающего центра белка с гетероароматической модификацией в G, что подтверждается моделированием комплекса.. На следующем этапе было изучено взаимодействие HAA-ДНК с есMutL. есMutL не образует комплексов с 17-звенным ДНК-дуплексом (Монахова и др., Биоорганическая химия, 2019). Поэтому мы использовали дуплексы длиной 76 п.н., которые были сконструированы путем «отжига» трех различных олигонуклеотидов (включая HAA-ДНК) на 76-звенной матрице (Рис. 9). Эффективность белково-нуклеинового взаимодействия определяли прямым связыванием. Показано, что сродство есMutL к HAA-ДНК не зависит от наличия и типа модификации; значения Kdapp варьируют в диапазоне 280-390 нМ. Для ответа на вопрос, могут ли ароматические аддукты с G в ДНК активировать систему репарации MMR E. сoli, использовали сконструированные 76-звенные ДНК, содержащие монометилированный участок узнавания эндонуклеазы есMutH: 5'-Gm6ATC-3'/3'-CTAG-5', внутри которого этот фермент вносит одноцепочечный разрыв (Рис. 9). Известно, что эндонуклеазную активность есMutH стимулирует активный комплекс есMutS-есMutL (Ahrends, NAR., 2006). Поэтому степень активации MMR контролировали по образованию 18-звенного продукта гидролиза 76-звенных HAA-ДНК (25 нМ) при добавлении 10х-избытка всех трех белков системы MMR . Показано, что гидролиз 76-звенных дуплексов с HAA в составе G/C-пары протекает эффективнее в 1,5-2 раза по сравнению с немодифицированным ДНК-дуплексом, имеющим все канонические пары оснований (Рис. 10). Эти данные свидетельствует о специфичном взаимодействии белков репарации с гетероароматической структурой. В свою очередь, дуплексы 76HAA-G/T гидролизуются эффективнее, чем дуплексы 76HAA-G/C, причем эффективность гидролиза зависит от типа модификации в составе G/T-пары. Так, PIP-ДНК ингибирует действие MMR. HAA-ДНК, содержащие Gpy, Gpyda и G4-pym, гидролизуются примерно так же, как контрольная G/T-содержащая ДНК (50–60%). Дуплексы с Gpyra и G2-pym в составе некомплементарной пары являются лучшими субстратами для комплекса есMutS-есMutL-есMutH (степень гидролиза составляет 90%) (Рис. 10). Таким образом, нами впервые продемонстрировано, что HAA-модификации в ДНК могут активировать процесс репарации «мисматчей».
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Влияние G-квадруплексных структур ДНК на функционирование систем репарации при канцерогенезе на примере промоторной области гена TERT
Результаты этапа: Было показано, что G4 мотивы промоторов TERT в классе млекопитающих эволюционно консервативны, и, следовательно, биологически значимы, а плотность мутаций в промоторах TERT у приматов значимо выше, чем в контрольных участках. Мы сравнили геномные данные по G-квадруплексам, полученные Chambers et al. Nat. Biotechnol., 2015) в присутствии K+ и с помощью программы QGRS Mapper, для 18 генов с разной функциональностью. Проведенный анализ показал неплохую связь расчетных и экспериментальных данных, а также проиллюстрировал ограничения предсказательной способности QGRS Мapper и необходимость создания альтернативных программ. Плотность мутаций в G4 мотивах (рассчитанных при помощи QGRS-Conserve и полученных экспериментально в Chambers et al., Nat. Biotechnol., 2015), значимо выше, чем плотность мутаций вне рассчитанных и экспериментальных G4 мотивов, при этом невозможно оценить разницу в плотностях мутаций в расчетных и экспериментальных G4 мотивах. Проведен анализ обогащения G4 в геноме человека соматическими мутациями, ассоциированными с онкологическими заболеваниями в промоторах онкогенов, доступных в базе данных COSMIC, в сравнении с другими регионами генома, способными и не способными формировать G4-структуры. Выбран 21 ген с разной функциональностью (14 онкогенов и 7 контрольных рибосомных генов). Было показано отсутствие явной связи между обогащением соматическими мутациями G4-структур в онкогенах и в контрольных генах, а также обогащением соматическими мутациями G4-структур и регионов вне G4-структур в любом исследуемом гене. Была оценена функциональная значимость мутаций с помощью алгоритма FATHMM-XF и показано, что она не связана с их расположением в гене. Можно утверждать о значимой разнице плотностей мутаций в онкогенах (выборка из 14 онкогенов) в G4-мотивах и GC-богатых областях. Было изучено взаимодействие ферментов BER человека (UNG, OGG1, NEIL1, NEIL2 и APE1) с модельными ДНК, содержащими: 1) TERT-промотор, 2) параллельный G4, образованный последовательностью (GGGT)4, в сравнении с контрольными ДНК, не формирующими G4-структуры. С помощью биоинформатических подходов и информации о геномах пациентов с различными видами рака, доступной в базе данных IGCC, нам удалось заключить, что корреляция между возникновением мутаций в последовательности TERT и в генах OGG1 и APE1 человека отсутствует. Мы показали, что эффективность удаления oxo-dG и АР-сайтов значительным образом зависит от нуклеотидного окружения повреждения и вторичной структуры ДНК, внутри которой находится повреждение, соответственно. APE1-индуцированное расщепление модифицированных ДНК в значительной мере коррелировало со стабильностью G4 TERT. Двуцепочечные ДНК с модификациями G>F в матричной цепи, формирование дуплексов в которых было подтверждено с помощью УФ плавления и спектроскопии кругового дихроизма, расщеплялись ферментом APE1 одинаково эффективно. С другой стороны, двуцепочечные ДНК с модификациями C>F в позициях 146 и 138,139 С-богатой кодирующей цепи TERT, дестабилизирующие дуплекс и способные стабилизировать G4 в противоположной цепи, репарировались значительно менее эффективно. Аналогичные эффекты мы наблюдали при исследовании влияния стабилизации G4 матричной цепью TERT в двуцепочечных ДНК, содержащих модификации dU в комплементарной PQS С-богатой цепи, на эффективность работы UNG человека. Как и в случае с AP-сайтом, удаление dU в положении С146 затруднено значительно по сравнению с контрольной ДНК. Результат был подтвержден в исследованиях расщепления тех же субстратов ферментом UDG E.coli. Показанная нами способность UNG человека связывать параллельный G4, образованный последовательностью (GGGT)4, может быть причиной выведения фермента из акта репарации. Анализируя совместное действие UNG и APE1 на двухцепочечных субстратах TERT, содержащих dU в 124 и 146 положениях С-богатой цепи, мы наблюдали увеличение скорости реакции удаления повреждения. С одной стороны, данная стимуляция может быть ассоциирована с тем, что после удаления dU UNG c местом повреждения связывается APE1, смещая UNG. Это позволяет UNG связать другой еще нерепарированный субстрат и осуществить удаление повреждения. С другой стороны, в условиях формирования G4 TERT, APE1 связывается с вторичной структурой, не позволяя сделать того же UNG. Это приводит к осуществлению UNG прямой функции репарации. Методом КД было установлено дестабилизирующее влияние модификации oxo-dG на стабилизацию G4 ДНК на примере 41-звенных модельных фрагментов мотива (GGGT)4. Продемонстрировано, что эффективность удаления oxo-dG ферментом OGG1 зависит от его местоположения в квадруплексной структуре. Для oxo-dG, входящих в состав средней тетрады, эффективность гидролиза относительно соседних G оказалась выше, за исключением oxo-dG в положении 19. Кроме того, низкие значение эффективности удаления окислительного повреждения для одноцепочечных ДНК, формирующих G4, свидетельствуют о том, что квадруплексный структуры препятствуют эффективному действию OGG1. На 96-звенных двухцепочечных модельных фрагментах промотора гена TERT, содержащих oxo-dG в положениях 124, 138, 139, 138/139, 146, было продемонстрировано совместное действие ключевых ферментов BER - OGG1 и APE1. Обнаружено, что при добавлении APE1 эффективность удаления oxo-dG увеличивается для всех субстратов, кроме контрольного дуплекса. Мы также выяснили, что белок APE1 может проявлять большую эффективность для некоторых положений, а именно 139, 138/139 и 146, чем ДНК-гликозилаза OGG1. Данный факт помешал нам сделать точный вывод о стимуляции в этих позициях. Продемонстрировано влияние окислительных повреждений 5-гидрокси-2'-дезоксицитидина (oC) и 5-гидрокси-2'-дезоксиуридина (oU) на работу ферментов системы BER - NEIL1 и NEIL2 на примере фрагментов С-богатой цепи промотора гена TERT с заменой С на oC или oU. УФ-спектроскопия показала, что эти олигонуклеотиды в условиях низкого pH образуют i-мотив. NEIL1 и NEIL2 успешно удаляют окислительные повреждения, причем mNEIL1 более эффективен на контрольной последовательности R, не способной к образованию вторичных структур, а mNEIL2 - наоборот. Олигонуклеотиды с остатками oU репарируются лучше, чем с oC ферментом mNEIL1. Удаление поврежденных оснований mNEIL2 протекало примерно c одинаковой эффективностью. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что закрепление мутаций в промоторе гена TERT может быть результатом: i) снижения эффективности работы BER в случае возникновения окислительных повреждений в G-богатой цепи TERT промотора; ii) в случае возникновения окислительных повреждений в С-богатой цепи (положения 146 и 138,139) и iii) не может быть результатом дисфункции APE1 и OGG1 в результате полиморфизма. Система репарации нуклеотидов (NER) узнает и исправляет широкий спектр объемных повреждений в ДНК, возникающих при воздействии различных видов излучения и химически активных соединений. В процессе NER задействовано более 30 ферментов и белковых факторов, образующих в месте повреждения ДНК разнообразные по составу и структуре комплексы. Одними из основных белковых факторов системы репарации являются XPC-RAD23B и XPA. Нами впервые показана способность этих белков взаимодействовать с ДНК, содержащей G-квадруплекс. Продемонстрировано, что эффективность такого взаимодействия ниже, чем для специфических для белков ДНК-лигандов, однако, выше, чем в случае контрольных ДНК. Таким образом, можно предположить, что G4 узнается белками NER как объемное повреждение в ДНК. TAPAS Разработана система детекции РНК TAPAS в основе которой лежит метод цПЦР, реализованный в варианте Taqman. Данная система подразумевает абсолютное количественное определение РНК TAPAS без нормировки на гены домашнего хозяйства. Разработка данной системы именно в таком варианте требовалось ввиду крайне низкой представленности РНК TAPAS, из-за которой использование метода ОТ-ПЦР в реальном времени, а также любых методов количественного определения нуклеиновых кислот с испоьзованием интеркалирующих красителей приводило к недостоверным и ненадёжным результатам. Данная система была успешно применена для анализа содержания РНК TAPAS в клеточных линия. Данные цПЦР подтверждают полученные нами ранее результаты об повышенной экспрессии данной РНК в клеточной линии A549 (аденокарцинома лёгкого). К сожалению, даже в этой линии РНК TAPAS регистрируется с трудом и только с использованием высокоточной и высокочувствительной обратной трансриптазы, которая не может быть использована для быстрой амплификации концов кДНК ни одной из коммерчески доступных систем. Низкая представленность данного транскрипта также не позволяет получить достоверные результаты при изучении данной РНК путём нокдауна.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".