Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса геновНИР

Positive-stranded RNA virus helicases fused to retrotransposon proteins due to the horizontal gene transfer

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 10 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов
Результаты этапа:
2 3 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов
Результаты этапа: 1) Недавно мы описали новую группу ретротранспозонов насекомых, относящихся к LINE-транспозонам семейства R1. Открытая рамка считывания 2 (ORF2) кодирует дополнительный С-концевой домен похожий на NTPase/хеликазные домены плюс-РНК вирусов (надсемейство 1 хеликаз - SF1H), которые находятся в составе репликативного белка. Такие SF1H-домены были обнаружены только в порядке Чешуекрылых. Интересно, что геном Plutella xylostella (Plutellidae) содержит самое большое количество (несколько десятков) SF1H-содержащих элементов. Это показывает, что у конкретных чешуекрылых произошел транспозиционной взрыв таких элементов. Была предложена гипотеза, согласно которой эта новая функция, приобретенная ретротранспозонами в результате горизонтального переноса генов, может способствовать их частичному выходу из-под контроля, осуществляемого системой РНК- сайленсинга. Неожиданное обнаружение вирусо-подобных хеликаз у белков ретротранспозонов насекомых, которые включены в единый полипротеин, ставит вопросы об эволюционном происхождении таких белков. Во-первых, было ли событие горизонтального переноса генов, кодирующих SF1H последовательности, связано с переносом непосредственно от вирусов растений в ретроэлементы насекомых, или от неизвестных вирусов насекомых, кодировавших SF1H домены тобамовирусного типа? Во-вторых, мог ли быть перенос SF1H в хромосом насекомых происходить в других местах нежели ORF2 TRAS ретротранспозонов? Огромный рост числа доступных последовательностей вирусов беспозвоночных в базах данных за последний год позволил нам решить эти вопросы, используя новые базы данных. Для поиска нами использовались базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), http://blast.lepbase.org/, TGI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), (http://www.insect-genome.com, http://www.iae.fafu.edu.cn/DBM/, http://monarchbase.umassmed.edu/, http://flybase.org/). BLAST анализ аминокислотных последовательностей SF1H из девяти TRAS элементов ряда видов Чешуекрылых показал, что эти последовательности имеют весьма высокий уровень гомологии (37-44%) с доменами репликативных хеликаз в ORF1 белках Хубэй виргавирусов 1 и 2, изолированных от комаров в Китае. Некоторые другие вирусы беспозвоночных (Синьчжоу вирус 1 нематод и Лодейро вирус пауков) также проявляют значительное сходство их репликативных полипептидов с TRAS SF1H доменами, в то время как тобамовирусы и некоторые другие виргавирусы растений проявляют меньшее сходство (34-35%). В общем, построение филогенетических древ четко показало, что все TRAS SF1H домены наиболее близки кластеризуются в одну ветвь с хеликазными доменами некоторых вирусов насекомых. Была предсказана генная организация РНК этих вирусов, которая в целом оказалась сходной с тобамовирусами растений. Таким образом, наш предыдущий вывод о тесной взаимосвязи TRAS ORF2 SF1H с репликативными хеликазами растительных тобамовирусов (Лазарева и др., 2015) объясняется лишь неполнотой данных о вирусных последовательностях, имевшихся в то время. Используя домены репликативных SF1H недавно секвенированных вирусов беспозвоночных в качестве якоря, мы провели более тщательный биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей в базах данных в попытке обнаружить последовательности, кодирующие полипептиды, включающие домены SF1H у насекомых за пределами отряда Чешуекрылые. Мы использовали TBLASTN анализ, используя вирусный SF1H, обратную транскриптазу (RT) и эндонуклеазный домены в качестве якорных последовательностей. Используя этот подход, у цикады Nilaparvata lugens (Полужесткокрылые: Delphacidae), геном которой был опубликован, мы выявили десятки последовательностей, где SF1H-содержащий домен расположен в ORF1 ретротранспозона, кодирующего ORF2, где RT и эндонуклеаза типичны для ретротранспозонов, относящихся к надсемейству Jockey. Еще одним выявленным насекомым с доменом SF1H в зоне ORF1 ретротранспозона Jockey Homalodisca vitripennis (Полужесткокрылые, Cicadellidae). Эти последовательности также представляют собой элемент Jockey. Используя этот же подход, мы выявили кодирование SF1H доменов в ORF1 у ряда дополнительных видов в порядках Полужесткокрылых и Прямокрылых. В частности, геномы насекомых из рода Ceutophilius, представляющих один из наиболее древних отрядов насекомых, также содержат элемент Jockey, кодирующий в ORF1 домен SF1H. Ранее мы сообщали, что последовательности TRAS ORF2, кодирующие дополнительный домен SF1H активно экспрессируются на разных этапах онтогенеза в различных тканях чешуекрылых Plutella xylostella. Мы дополнительно изучили базы данных транскриптомов насекомых, чтобы оценить выражение TRAS ORF2 с закодированными SF1H домены в большом количестве видов насекомых. Оказалось, что SF1H последовательности выражаются в большинстве исследованных видов чешуекрылых кроме шелкопряда (Bombycidae). Эти виды включают в себя чешуекрылых насекомых из самых древних суперсемейств Aglossata и Heterobathmiina, а также Glossata (infraorders Dacnonypha и Myoglossata). У Полужесткокрылых экспрессия доменов вирусной SF1H была выявлена среди представителей семейств Delphacidae, Cicadellidae, Rhaphidophoridae и Acrididae. Возможные гипотезы о функциональной значимости приобретения вирусных SF1H последовательностей геномами насекомых включают: (I) обеспечение селективного преимущества ретротранспозонов как эгоистических генетических элементов; (II) использование последовательностей кодирующих SF1H в качестве инструмента для анти-вирусной защиты насекомых; (III) активное выражение SF1H как возможная предпосылка для появления растительноядности. Мы предпочитаем более сложный взгляд на приобретение и сохранение функциональных последовательностей, кодирующмх SF1H в ретротранспозонах многих современных насекомых. Как предлагается, древние группы насекомых вместе с другими беспозвоночными представляли собой крупный резервуар вирусного генетического разнообразия в течение миллиарда лет и, таким образом, занимали центральное место в эволюции вирусных РНК. Соответственно, анти-вирусная защита, вероятно, была очень важна для выживания и успешного естественного отбора в процессе эволюции насекомых, что может объяснить сохранение SF1H-кодирующих последовательностей в геномах насекомых. В качестве независимого сценария начальной эволюционной фиксации SF1H в геномах насекомых мы считаем, что приобретенные последовательности вирусных SF1H могли обеспечить селективные преимущества ретротранспозонов как эгоистических генетических элементов. В дальнейшем в эволюции насекомых, независимо от исходного сценария фиксации SF1H в геномах насекомых, приобретенная система для подавления сайленсинга на основе SF1H могла бы служить для поддержания растительноядного образа жизни. 2) Фрагменты ретротранспозонов TRAS, содержащие более 90% последовательности их полных копий были клонированы в составе бактериальных векторов при использовании геномной ДНК клеток насекомых Sf9 из Spodoptera frugiperda. На данном этапе попытки клонировать полные копии транспозонов были неудачны, что возможно связано с особеностями первичной структуры промоторных районов транспозонов. В ходе последующего мутагенеза были клонированы в составе векторов насекомых три вида делеционных мутантов: (i) мутант, содержащий полноразмерную ORF2, включая кодирующую последовательность хеликазы и 3'-нетранслируемый район; (ii) делеционный вариант, содержащий полный ген хеликазы и 3'-нетранслируемый район; (iii) вариант, включающий 3'-нетранслируемый район. Эти делеционные варианты будут использованы в заключительный год проекта для исследования влияния хеликазных последовательностей на эффективность транспозиции TRAS элементов. 3) Изучена субклеточная локализация хеликаз ретротранспозонов, слитых с GFP, в гетерологичной растительной системе. Для этих экспериментов было получено два типа конструкций. Во-первых, были получены слитные гены, кодирующие белки, в которых последовательность GFP была слита с N-концом хеликазы. Во-вторых, клонированные гены хеликаз были модифицированы таким образом, чтобы удалить терминирующий кодон и внести на его место сайт рестрикции, позволяющий сшить эти гены с геном GFP через 3’-конец. В результате были получены гены, кодирующие белки, в которых последовательность GFP была слита с С-концом хеликазы. На их основе были получены аналогичные конструкции GFP-HEL и HEL-GFP. Для получения плазмидных векторных конструкций, кодирующих хеликазы, была поставлена ПЦР на матрице ДНК Plutella xylostella (см. предыдущий отчет по проекту). Для амплификации были использованы праймеры Xyl-P_plant и Xyl-M_plant. ПЦР-продукт был клонирован в вектор pBSC II SK (+). Все полученные конструкции pBSC-XYL были секвенированы в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН в Центре коллективного пользования «Геном». Гены слитных белков были затем перенесены в модифицированный бинарный вектор pLH9000, и полученными векторными конструкциями трансформировали клетки A. tumefaciens. Полученные таким образом культуры агробактерий использовали для инфильтрации листьев N. benthamiana. Субклеточную локализацию белков изучали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на 3-ий день после инфильтрации. Было обнаружено, что оба слитные белка, являющиеся производными хеликазы транспозона Plutella xylostella (GFP-HEL и HEL-GFP), локализуются в клетке сходным образом. Для обоих слитных белков наблюдалась сходная диффузная локализация в цитоплазме и ядре, напоминающая локализацию GFP и других флуоресцирующих белков в клетках растений (см. файл Fig. 1 в приложении). Однако, в этом случае флуоресценция не обнаруживается в ядрышке, тогда как слитные белки, включающие хеликазы SF1 вирусов растений, часто локализовались и в нуклеоплазме, и в ядрышке. 4) Изучена субклеточная локализация хеликаз ретротранспозонов, слитых с GFP, в системе клеток насекомых. Для этих экспериментов было получено два типа конструкций (см. выше). На их основе были получены аналогичные конструкции GFP-HEL и HEL-GFP. Для получения плазмидных векторных конструкций для насекомых, кодирующие был использован исходный вектор pBSC II SK (+) (см. выше). Гены слитных белков-хеликаз были затем перенесены в модифицированный вектор для насекомых pOET, и полученными векторными конструкциями (pOET_HEL-GFP-N и pOET_HEL-GFP-N трансформировали клетки Sf9. Для этого ДНК модифицированого бакуловируса (flashBAC) ко-трансфицировали с pOET_HEL-GFP-N и pOET_HEL-GFP-N в соотношении 1:5 (по весовому соотношению) в 12-луночном культуральном планшете в суспензию Sf9 клеток в TNM-FH буфере (2,5 x 105 cells /mL), используя Lipofectin (Invitrogen). На 4ый день после трансфекции по 400мкл культур переносили в культуральные флаконы (T25), содержащие по 5 ml свежей суспензии Sf9 клеток (~ 1.5x106 cells/флакон). Дали клеткам прикрепиться в течение ~4 часов и инкубировали при 27°C еще 4 дня. После этого проводили флуоресцентную микроскопию. Для обоих слитных белков наблюдалась сходная диффузная локализация в цитоплазме и ядре, напоминающая локализацию GFP и других флуоресцирующих белков в клетках (см. файл Fig. 1 в приложении). 5) Для исследования физико-химических свойств хеликазных доменов ретротанспозонов насекомых Plutella xylostella и Spodoptera frugiperda обе клонированные хеликазы выделяли из клеток E.coli. Для этого соответствующие гены были клонированы в экспрессионный вектор pQE30, в результате чего происходило слияние N-конца гена-интереса с 6 гистидинами, которые в дальнейшем позволили с помощью аффинной хроматографии выделить интересующий нас белок. Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli штамма BL21 (F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS)). 50 мл ночной культуры разбавляли питательным бульоном 2YT (бакто-триптон 16 г/л («Panreac», Испания), дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л («Helicon», Россия)), содержащим ампициллин («MP Biomedicals», Франция) в концентрации 100 мкг/мл, до объема 500 мл и выращивали при 37°С в течение одного часа. К бактериальной суспензии добавляли индуктор экспрессии белков – ИПТГ («Thermo scientific», США) до конечной концентрации 1мМ. Индукцию проводили в течение трех часов. Далее клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3470g в течение десяти минут. Осадок использовали для дальнейшей хроматографической очистки белков. Хроматографию (гис)6-белков проводили согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы «QIAGEN» с некоторыми изменениями. Осадок клеток ресуспендировали в трех объемах буфера А (6М гуанидингидрохлорид («Helicon», Россия), 0,1 М NaH2PO4, 0,01 М трис-HCl рН 8,0) с добавлением ингибитора протеаз PMSF («Helicon», Россия) в концентрации 5мМ. Клетки лизировали при комнатной температуре в течение одного часа при качании 100 оборотов/мин. Клеточные лизаты центрифугировали 10 минут при 16100g. Супернатант добавляли в колонку, содержащую Ni-НТА агарозу («QIAGEN», Германия). Связывание (гис)6-белков с Ni-НТА агарозой осуществляли при комнатной температуре и умеренном перемешивании. Через час инкубации давали стечь клеточному лизату и промывали осадок Ni-НТА последовательно по 10 мл буфером А, затем буфером B (8 М мочевина, 0,1 М NaH2PO4 , 0,01 М трис-HCl рН 8,0 («Helicon», Россия)), буфером С (аналогичного состава, рН 6,3). Затем связанные с Ni-НТА (Гис)6- белки элюировали буфером Е (аналогичного состава, рН 4,5), собирая четыре фракции по 1 мл. Состав полученных фракций анализировали методом электрофореза в ПААГ с ДСН. Препараты белков непосредственно перед использованием диализовали в диализном мешке, вначале против тридистиллированной воды (в объеме ~ 1 литр), проводя смены воды каждые 15-20 минут в течение 2 часов. При последней смене добавляли вместо воды буфер (1мМ HEPES pH 6,0). После диализа для осаждения неспецифических агрегатов белка препарат центрифугировали в течение 10 минут при 6000 g. Концентрацию белков определяли по поглощению при 280 нм, для чего измеряли спектры в области 230–360 нм в кварцевых кюветах c длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 фирмы Shimadzu scientific Instruments, Inc. (Япония). Для экспериментального изучения вторичной структуры белков были измерены спектры кругового дихроизма (КД). Измерения проводились в коротковолновой области ультрафиолетового диапазона в интервале длин волн от 185 до 260 нм. Спектры двух исследованных полноразмерных хеликаз имели форму и положение максимумов, характерные для белков со значительным содержанием α-спиралей при малом содержании β-структур: такие спектры имеют отрицательный максимум в районе 208 нм, плечо в районе 222 нм и большой положительный пик в районе 190 нм. Однако несмотря на одинаковую форму спектров, количество α-спиральных элементов в составе двух белков заметно отличались. Cогласно эмпирической формуле Гринфилда-Фасмана, мы оценили содержание α-спиралей для двух хеликаз ретротранспозонов насекомых. Получилось, что этот белок у Plutella xylostella содержит примерно 43% α-спиральных элементов, тогда как хеликазный домен Spodoptera frugiperda имеет в своем составе несколько большее процентное содержание α-спиралей – 49%. Известно, что SF1 РНК-хеликазы вирусов состоят из минимум трех структурных доменов. Для экспериментального подтверждения этого предположения хеликазные белки насекомых были проанализированы с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Известно, что плавление однодоменных белков с выраженной третичной структурой происходит по принципу «все или ничего», то есть при нагревании не происходит денатурации отдельных частей белковой молекулы, а вся глобула одновременно утрачивает свою структуру, причем процесс этот сопровождается выделением тепла. Прибор для исследования ДСК фиксирует избыточную теплоемкость при постоянном давлении, и на основании анализа этой характеристики можно судить как о термодинамических характеристиках белка, так и о его третичной структуре. Спектр ДСК хеликаз действительно имеет вид, характерный для мультидоменных белков. Деконволюция термограммы полноразмерной хеликазы Plutella xylostella позволяет выделить в её составе три пика: наиболее легкоплавкий компонент имеет температуру плавления равную 38°C и обладает слабокооперативным характером, свойственным белкам со значительным содержанием природно неупорядоченных элементов, а два более тугоплавких компонента обладают температурой плавления 44°C и 53°C, соответственно. Чтобы идентифицировать калориметрические домены полноразмерного белка и соотнести их со структурными, были проведены измерения кривых плавления двух обеих хеликаз насекомых. Термограммы обоих белков имели три четко выраженных пика избыточной теплоемкости: таким образом, белок у обоих насекомых имеет в своем составе три гипотетических домена: наиболее термостабильный N-концевой домен, центральный домен, способный образовывать четко выраженную третичную структуру, и С-концевой домен со значительной внутренней неупорядоченностью. Помимо изучения доменной организации и вторичной структуры белка-хеликазы нами была исследована методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) способность его к гомологичным белок-белковым взаимодействиям. Этот метод используется для оценки размеров, как индивидуальных молекул белка, так и белковых комплексов в растворах (Nemykh et al 2008). Полученные методом ДЛС результаты обычно представляют как число частиц определенного размера, где размер частицы является ее гидродинамическим диаметром, апроксимированным к параметрам глобулярной частицы. Средние размеры комплексов, формируемых хеликазой Plutella xylostella при 25°C, составляют около 21 нм. Немного более мелкие олигомеры (17 нм) формирует хеликаза Spodoptera frugiperda. При измерении гидродинамического диаметра денатурованного белка, находящегося в растворе 4М мочевины, значение диаметра снижается, что говорит о разрушении комплекса в денатурирующих условиях. Причем уменьшение размеров происходит только у обоих хеликаз. Таким образом, полноразмерный хеликазный домен ретротранспозонов насекомых в нативных условиях обладает способностью к гомологичным белок-белковым взаимодействиям в результате чего образуются олигомеры размером 17-21 нм. Все результаты получены впервые в мире, т.к. феномен наличия в ретротранспозонах хеликазных доменов не был ранее известен.
3 8 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".