ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов вместе с РНК-полимеразами обеспечивают специфический синтез комплементарных цепей на матрицах вирусных РНК. Помимо основной функции, расплетания дуплексов РНК, хеликазный домен репликаз тобамовирусов растений имеет функцию супрессора РНК-сайленсинга. Успехи в быстром секвенировании РНК- и ДНК-геномов, достигнутые молекулярной биологией и вирусологией, недавно позволили нам с помощью биоинформатического анализа выявить принципиально новый тип горизонтального переноса генов вирусных хеликаз. Было показано, что гены вирусных хеликаз способны встраиваться не только в другие вирусные геномы, но и в ретротранспозоны. В геномах насекомых хеликазы, родственные репликативным хеликазам тобамовирусов растений, кодируются ретротранспозонами в виде дополнительного домена одного из их белков. Предварительный экспериментальный анализ показал, что доместицированные транспозонами насекомых хеликазы могут принимать участие в супрессии сайленсинга генов. Целью данного проекта является идентификация новых типов ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы, подобные тобамовирусным, а также анализ экспрессии хеликаз и их возможных функций.
Helicases of plus-RNA viruses, together with RNA polymerases, ensures specific synthesis of complementary chains on the viral RNA. In addition to the basic functions, unwinding of RNA duplexes, helicase domain of replicases of plant tobamoviruses has the function of the suppressor of RNA silencing. Advances in rapid sequencing of RNA and DNA genomes, achieved by molecular biology and virology, has recently allowed us, using bioinformatics analysis to identify fundamentally new type of horizontal gene transfer of viral helicase. It has been shown that viral genes helices can be placed not only in other viral genomes, but also in retrotransposons. In the genomes of insects, helicases related to replicative helicases of tobamoviruses, are encoded by retrotransposons as additional domain in one of their polyproteins. Preliminary experimental analysis showed that the transposon-encoded insect helicases may participate in suppression of gene silencing. The aim of this project is to identify new types of insect retrotransposons that encode helicase like tobamoviruses and expression analysis of helices and their possible functions.
1) Поиск новых ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы тобамовирусного типа Будет проведен биоинформатический поиск ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы тобамовирусного типа, в имеющихся базах данных нуклеотидных последовательностей, включающих последовательности геномных ДНК и транскриптомы насекомых. Для поиска будут использоваться базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), TGI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), SGN (http://sgn.cornell.edu/), the PLAZA website (http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/), Phytozome (http://www.phytozome.net) и другие (http://www.insect-genome.com, http://www.iae.fafu.edu.cn/DBM/, http://monarchbase.umassmed.edu/, http://flybase.org/). Для сравнения с базами данных будут использованы последовательности хеликазных доменов различных вирусов семейства Virgaviridae. Для выявленных последовательностей, имеющих сходство с хеликазами, будет проведен дальнейший детальный анализ с целью идентификации фланкирующих последовательностей и определения структуры ретротранспозона, несущего хеликазный домен. Для каждого нового типа генетических элементов будет проводиться филогенетический анализ, а также исследоваться его представленность в геномах насекомых различных таксономических групп. 2) Клонирование ретротранспозонов, кодирующих хеликазы В предварительных экспериментах нами был клонирован хеликазный домен одного из LINE-подобных элементов Plutella xylostella. Для дальнейших экспериментов будет клонирована полноразмерная последовательность данного ретротранспозона. Предполагается амплифицировать полноразмерный ретротранспозон с использованием специфических олигонуклеотидных прймеров и препарата процессивной термофильной полимеразы с редактирующей активностью и клонировать полученный продукт в плазмидный вектор. Аналогичным образом будут клонированы новые вырианты ретротранспозонов, несущих хеликазный домен тобамовирусного типа, обнаруженные с помощью биоинформатического анализа. Для дальнейшего функционального анализа будет проведен мутагенез клонированных ретротранспозонов насекомых. Будут получены делеционные варианты ретротранспозонов с удаленным хеликазным доменом, а также точечные мутанты, несущие мутации в активном центре хеликазного домена. 3) экспрессия хеликазных доменов ретротранспозонов насекомых в бактериальных клетках Фрагменты ретротранспозонов, кодирующие хеликазные домены, будут клонированы в составе векторов для экспрессии в клетках Escherichia coli таким образом, что их кодирующая последовательность будет слита с последовательностью, кодирующей шесть гистидиловых остатков, что дает возможность проводить аффинную очистку рекомбинантных белков из лизатов бактериальных клеток. Препараты хеликазных доменов будет выделены из полученных штаммов-продуцентов с помощью хроматографии на Ni-NTA-агарозе и использованы для дальнейшего анализа их биохимических свойств. 4) Исследование биохимических свойств хеликазных доменов ретротанспозонов насекомых С учетом данных, имеющихся для родственных хеликаз вирусов растений, предполагается проведение нескольких типов экспериментов. Во-первых, будет проведено исследование РНК-связывающей способности хеликазных доменов ретротранспозонов насекомых методом сдвига в геле. Планируется использование различных РНК-субстратов, таких как одноцепочечная РНК и двуцепочечная РНК. Помимо этого, с учетом их предполагаемой роли в супрессии РНК-сайленсинга, будет проанализирована способность данных хеликаз взаимодействовать с РНК-компонентами системы РНК-интерференции, такими как предшественники микроРНК и малыми РНК. Во-вторых, будет изучена способность гидролизоывать рибонуклеотид-трифосфаты. В третьх, планируется исследовать РНК-хеликазную активность данных рекомбинантных белков. В-четвертых, будут использованы измерения лазерного динамического светорассеяния для анализа способности белков образовывать димеры и олигомеры более высокого порядка. 5) Исследование функциональных свойств хеликазных доменов в растениях Растения широко используются в качестве модельной системы исследования способности различных вирусный белков, в том числе кодируемых вирусами животных и грибов, супрессировать РНК сайленсинг. Помимо этого, представляется существенным определить, сохраняется ли проявляющаяся в растениях супрессорная активность, известная для тобамовирусных репликативных хеликаз, у родственных им хеликазных доменов, кодируемых ретротранспозонами насекомых. В предварительных экспериментах способность супрессировать РНК-сайленсинг нами было показана для хеликазного домена LINE-подобного ретротранспозона P. xylostella. В рамках данного проекта предполагается исследовать супрессорную активность хеликазных доменов других ретротранспозонов. Для этого будет использовано два подхода. Во-первых, будет использована экспериментальная система, в которой с помощью агроинфильтрации в листьях Nicotiana benthamiana достигается ко-экспрессия репортерного гена GFP с геном, продуктом транскрипции которого является двуцепочечная РНК, соответствующая фрагменту гена GFP и инициирующая его сайленсинг. При ко-экспрессии с этими конструкциями гена белка-супрессора восстанавливается уровень экспрессии GFP и его мРНК (Johansen and Carrington, Plant Physiol. 126, 930–938, 2001). Во-вторых, будет использована экспериментальная система, основанная на использовании модифицированного генома вируса морщинистости турнепса (ВМТ), в случае которого природным супрессором РНК-сайленсинга является вирусный капсидный белок. В N. benthamiana межклеточный транспорт рекомбинантного вируса ВМТ-GFP, в геноме которого ген капсидного белка замещен на ген GFP, блокирован, но может быть комплементирован целым рядом известных гетерологичных вирусных супрессоров РС, что позволяет использовать данную конструкцию для выявления супрессорной функции белков, для которых она не была описана ранее (Powers et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 879-890, 2008). Помимо этого, с учетом описанного влияния супрессоров РНК-сайленсинга на развитие вирусной инфекции в растениях, мы предполагаем изучить скорость и фенотип системной инфекции Х-вируса картофеля, экспрессирующего хеликазный домен ретротранспозона, в сравнении с таковыми для вируса дикого типа. 6) Исследование экспрессии и функций хеликазных доменов ретротранспозонов в клетках насекомых Исследование транскрипционной активности ретротранспозов насекомых предполагается проводить с использование двух моделей, P. xylostella (личинок и имаго) и культуры клеток Spodoptera frugiperda. Геном данного вида несет, как и геном P. xylostella, по крайней мере один LINE-подобный ретротранспозон, кодирующий хеликазу тобомовирусного типа (наши предварительные неопубликованные данные). С помощью количественной ПЦР в клетках P. xylostella и S. frugiperda предполагается изучить уровень накопления мРНК ретротранспозонов, кодирующих хеликазные домены. Будет изучена субклеточная локализация белков ретротранспозонов, включающих домен хеликазы, слитых с GFP. Для этого ген, кодирующий такой слитный белок, будет клонирован в плазмидном векторе под контролем промотера, активного в клетках насекомых (Bleckmann et. al., PLOS One 10, e0132898, 2015). Клетки S. frugiperda после трансфекции полученной конструкцией будут анализироваться с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с применением белков-маркеров субклеточных структур, имеющихся в нашем распоряжении. Функциональные активность хеликазных доменов, кодируемых ретротранспозонами, будет исследована с применение двух подходов. В-первых, будет исследована способность хеликазного домена, или всего белка ретротранспозона, включающего хеликазный домен, супрессировать сайленсинг в клетках насекомых. Для этого будет применена ко-трансфекция клеток S. frugiperda конструкциями, обеспечивающими экспрессию гена GFP и его сайленсинг, с конструкцией, несущей исследуемый белок. Во-вторых, будет изучено влияние экспрессии хеликазного домена в составе ретротранспозона на его способность к транспозиции. Для этого будет проводиться трансфекция клеток S. frugiperda вектором, несущим полноразмерный LINE-подобный элемент P. xylostella. Эффективность переноса данного ретротранспозона в геномную ДНК S. frugiperda будет оцениваться в сравнении с контрольной трансфекцией, для которой будет использована аналогичная конструкция, несущая либо делецию хеликазного домена, либо точечную мутацию в активном центре хеликазы.
Белки-хеликазы суперсемейств I и II (SF1H и SF2H) многих плюс-РНК-содержащих вирусов участвуют, наряду с РНК-полимеразой, в репликации вирусных геномов. Плюс-РНК-содержащие вирусы контролируется путем разрушения вирусных РНК, направляемого специфическими малыми РНК. Геномы вирусов кодируют супрессоры РНК-сайленсинга, подавляющие защитный ответ хозяина, основанный на РНК-интерференции, что делает возможной эффективную репликацию вируса. С другой стороны, до настоящего времени не были описаны супрессоры РНК-сайленсинга, кодируемые мобильными генетическими элементами. Недавно в геномах некоторых видов насекомых мы обнаружили ретротранспозоны, один из белков которых несет дополнительный структурный домен, сходный с хеликазным доменом репликаз вирусов растений, для которого показана функция супрессора РНК-сайленсинга. Была предложена гипотеза, согласно которой эта новая функция, приобретенная ретротранспозонами в результате горизонтального переноса генов, может способствовать выходу их частичному выходу из-под контроля, осуществляемого системой РНК-сайленсинга. Целью данного проекта является анализ экспрессии и функций хеликаз, кодируемых ретротранспозонами насекомых. В рамках проекта предполагается решить следующие задачи: поиск новых ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы тобамовирусного типа; клонирование ретротранспозонов, кодирующих хеликазы; экспрессия хеликазных доменов ретротранспозонов насекомых в бактериальных клетках; исследование биохимических свойств хеликазных доменов ретротанспозонов насекомых; исследование функциональных свойств хеликазных доменов в растениях; исследование экспрессии и функций хеликазных доменов ретротранспозонов в клетках насекомых.
1) Анализ баз данных и идентификация поиск новых ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы тобамовирусного типа; 2) Получение плазмидных векторных конструкций, несущих клонированные копии полноразмерных ретротранспозонов насекомых, кодирующих хеликазы; 3) Получение бактериального клона-продуцента хеликазного домена ретротранспозона, получение и очистка препаративных количеств рекомбинантного белка; 4) Изучение РНК-связывающей активности рекомбинантной хеликазы in vitro методом сдвига в геле с использованием ряда РНК-субстратов; 5) Конструирование рекомбинантного генома Х-вируса картофеля, несущегог ген хеликазного домена одного ретротранспозонов P. xylostella, исследование влияния экспрессии хеликазного домена на развитие вирусной инфекции в растениях; 6) Анализ экспресии ретротранспозонов, несущих хеликазные домены, в клетках P. xylostella и S. frugiperda методом количественной ПЦР. Все полученные результаты будут оригинальными.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 10 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов |
Результаты этапа: | ||
2 | 3 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов |
Результаты этапа: 1) Недавно мы описали новую группу ретротранспозонов насекомых, относящихся к LINE-транспозонам семейства R1. Открытая рамка считывания 2 (ORF2) кодирует дополнительный С-концевой домен похожий на NTPase/хеликазные домены плюс-РНК вирусов (надсемейство 1 хеликаз - SF1H), которые находятся в составе репликативного белка. Такие SF1H-домены были обнаружены только в порядке Чешуекрылых. Интересно, что геном Plutella xylostella (Plutellidae) содержит самое большое количество (несколько десятков) SF1H-содержащих элементов. Это показывает, что у конкретных чешуекрылых произошел транспозиционной взрыв таких элементов. Была предложена гипотеза, согласно которой эта новая функция, приобретенная ретротранспозонами в результате горизонтального переноса генов, может способствовать их частичному выходу из-под контроля, осуществляемого системой РНК- сайленсинга. Неожиданное обнаружение вирусо-подобных хеликаз у белков ретротранспозонов насекомых, которые включены в единый полипротеин, ставит вопросы об эволюционном происхождении таких белков. Во-первых, было ли событие горизонтального переноса генов, кодирующих SF1H последовательности, связано с переносом непосредственно от вирусов растений в ретроэлементы насекомых, или от неизвестных вирусов насекомых, кодировавших SF1H домены тобамовирусного типа? Во-вторых, мог ли быть перенос SF1H в хромосом насекомых происходить в других местах нежели ORF2 TRAS ретротранспозонов? Огромный рост числа доступных последовательностей вирусов беспозвоночных в базах данных за последний год позволил нам решить эти вопросы, используя новые базы данных. Для поиска нами использовались базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), http://blast.lepbase.org/, TGI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/), (http://www.insect-genome.com, http://www.iae.fafu.edu.cn/DBM/, http://monarchbase.umassmed.edu/, http://flybase.org/). BLAST анализ аминокислотных последовательностей SF1H из девяти TRAS элементов ряда видов Чешуекрылых показал, что эти последовательности имеют весьма высокий уровень гомологии (37-44%) с доменами репликативных хеликаз в ORF1 белках Хубэй виргавирусов 1 и 2, изолированных от комаров в Китае. Некоторые другие вирусы беспозвоночных (Синьчжоу вирус 1 нематод и Лодейро вирус пауков) также проявляют значительное сходство их репликативных полипептидов с TRAS SF1H доменами, в то время как тобамовирусы и некоторые другие виргавирусы растений проявляют меньшее сходство (34-35%). В общем, построение филогенетических древ четко показало, что все TRAS SF1H домены наиболее близки кластеризуются в одну ветвь с хеликазными доменами некоторых вирусов насекомых. Была предсказана генная организация РНК этих вирусов, которая в целом оказалась сходной с тобамовирусами растений. Таким образом, наш предыдущий вывод о тесной взаимосвязи TRAS ORF2 SF1H с репликативными хеликазами растительных тобамовирусов (Лазарева и др., 2015) объясняется лишь неполнотой данных о вирусных последовательностях, имевшихся в то время. Используя домены репликативных SF1H недавно секвенированных вирусов беспозвоночных в качестве якоря, мы провели более тщательный биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей в базах данных в попытке обнаружить последовательности, кодирующие полипептиды, включающие домены SF1H у насекомых за пределами отряда Чешуекрылые. Мы использовали TBLASTN анализ, используя вирусный SF1H, обратную транскриптазу (RT) и эндонуклеазный домены в качестве якорных последовательностей. Используя этот подход, у цикады Nilaparvata lugens (Полужесткокрылые: Delphacidae), геном которой был опубликован, мы выявили десятки последовательностей, где SF1H-содержащий домен расположен в ORF1 ретротранспозона, кодирующего ORF2, где RT и эндонуклеаза типичны для ретротранспозонов, относящихся к надсемейству Jockey. Еще одним выявленным насекомым с доменом SF1H в зоне ORF1 ретротранспозона Jockey Homalodisca vitripennis (Полужесткокрылые, Cicadellidae). Эти последовательности также представляют собой элемент Jockey. Используя этот же подход, мы выявили кодирование SF1H доменов в ORF1 у ряда дополнительных видов в порядках Полужесткокрылых и Прямокрылых. В частности, геномы насекомых из рода Ceutophilius, представляющих один из наиболее древних отрядов насекомых, также содержат элемент Jockey, кодирующий в ORF1 домен SF1H. Ранее мы сообщали, что последовательности TRAS ORF2, кодирующие дополнительный домен SF1H активно экспрессируются на разных этапах онтогенеза в различных тканях чешуекрылых Plutella xylostella. Мы дополнительно изучили базы данных транскриптомов насекомых, чтобы оценить выражение TRAS ORF2 с закодированными SF1H домены в большом количестве видов насекомых. Оказалось, что SF1H последовательности выражаются в большинстве исследованных видов чешуекрылых кроме шелкопряда (Bombycidae). Эти виды включают в себя чешуекрылых насекомых из самых древних суперсемейств Aglossata и Heterobathmiina, а также Glossata (infraorders Dacnonypha и Myoglossata). У Полужесткокрылых экспрессия доменов вирусной SF1H была выявлена среди представителей семейств Delphacidae, Cicadellidae, Rhaphidophoridae и Acrididae. Возможные гипотезы о функциональной значимости приобретения вирусных SF1H последовательностей геномами насекомых включают: (I) обеспечение селективного преимущества ретротранспозонов как эгоистических генетических элементов; (II) использование последовательностей кодирующих SF1H в качестве инструмента для анти-вирусной защиты насекомых; (III) активное выражение SF1H как возможная предпосылка для появления растительноядности. Мы предпочитаем более сложный взгляд на приобретение и сохранение функциональных последовательностей, кодирующмх SF1H в ретротранспозонах многих современных насекомых. Как предлагается, древние группы насекомых вместе с другими беспозвоночными представляли собой крупный резервуар вирусного генетического разнообразия в течение миллиарда лет и, таким образом, занимали центральное место в эволюции вирусных РНК. Соответственно, анти-вирусная защита, вероятно, была очень важна для выживания и успешного естественного отбора в процессе эволюции насекомых, что может объяснить сохранение SF1H-кодирующих последовательностей в геномах насекомых. В качестве независимого сценария начальной эволюционной фиксации SF1H в геномах насекомых мы считаем, что приобретенные последовательности вирусных SF1H могли обеспечить селективные преимущества ретротранспозонов как эгоистических генетических элементов. В дальнейшем в эволюции насекомых, независимо от исходного сценария фиксации SF1H в геномах насекомых, приобретенная система для подавления сайленсинга на основе SF1H могла бы служить для поддержания растительноядного образа жизни. 2) Фрагменты ретротранспозонов TRAS, содержащие более 90% последовательности их полных копий были клонированы в составе бактериальных векторов при использовании геномной ДНК клеток насекомых Sf9 из Spodoptera frugiperda. На данном этапе попытки клонировать полные копии транспозонов были неудачны, что возможно связано с особеностями первичной структуры промоторных районов транспозонов. В ходе последующего мутагенеза были клонированы в составе векторов насекомых три вида делеционных мутантов: (i) мутант, содержащий полноразмерную ORF2, включая кодирующую последовательность хеликазы и 3'-нетранслируемый район; (ii) делеционный вариант, содержащий полный ген хеликазы и 3'-нетранслируемый район; (iii) вариант, включающий 3'-нетранслируемый район. Эти делеционные варианты будут использованы в заключительный год проекта для исследования влияния хеликазных последовательностей на эффективность транспозиции TRAS элементов. 3) Изучена субклеточная локализация хеликаз ретротранспозонов, слитых с GFP, в гетерологичной растительной системе. Для этих экспериментов было получено два типа конструкций. Во-первых, были получены слитные гены, кодирующие белки, в которых последовательность GFP была слита с N-концом хеликазы. Во-вторых, клонированные гены хеликаз были модифицированы таким образом, чтобы удалить терминирующий кодон и внести на его место сайт рестрикции, позволяющий сшить эти гены с геном GFP через 3’-конец. В результате были получены гены, кодирующие белки, в которых последовательность GFP была слита с С-концом хеликазы. На их основе были получены аналогичные конструкции GFP-HEL и HEL-GFP. Для получения плазмидных векторных конструкций, кодирующих хеликазы, была поставлена ПЦР на матрице ДНК Plutella xylostella (см. предыдущий отчет по проекту). Для амплификации были использованы праймеры Xyl-P_plant и Xyl-M_plant. ПЦР-продукт был клонирован в вектор pBSC II SK (+). Все полученные конструкции pBSC-XYL были секвенированы в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН в Центре коллективного пользования «Геном». Гены слитных белков были затем перенесены в модифицированный бинарный вектор pLH9000, и полученными векторными конструкциями трансформировали клетки A. tumefaciens. Полученные таким образом культуры агробактерий использовали для инфильтрации листьев N. benthamiana. Субклеточную локализацию белков изучали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на 3-ий день после инфильтрации. Было обнаружено, что оба слитные белка, являющиеся производными хеликазы транспозона Plutella xylostella (GFP-HEL и HEL-GFP), локализуются в клетке сходным образом. Для обоих слитных белков наблюдалась сходная диффузная локализация в цитоплазме и ядре, напоминающая локализацию GFP и других флуоресцирующих белков в клетках растений (см. файл Fig. 1 в приложении). Однако, в этом случае флуоресценция не обнаруживается в ядрышке, тогда как слитные белки, включающие хеликазы SF1 вирусов растений, часто локализовались и в нуклеоплазме, и в ядрышке. 4) Изучена субклеточная локализация хеликаз ретротранспозонов, слитых с GFP, в системе клеток насекомых. Для этих экспериментов было получено два типа конструкций (см. выше). На их основе были получены аналогичные конструкции GFP-HEL и HEL-GFP. Для получения плазмидных векторных конструкций для насекомых, кодирующие был использован исходный вектор pBSC II SK (+) (см. выше). Гены слитных белков-хеликаз были затем перенесены в модифицированный вектор для насекомых pOET, и полученными векторными конструкциями (pOET_HEL-GFP-N и pOET_HEL-GFP-N трансформировали клетки Sf9. Для этого ДНК модифицированого бакуловируса (flashBAC) ко-трансфицировали с pOET_HEL-GFP-N и pOET_HEL-GFP-N в соотношении 1:5 (по весовому соотношению) в 12-луночном культуральном планшете в суспензию Sf9 клеток в TNM-FH буфере (2,5 x 105 cells /mL), используя Lipofectin (Invitrogen). На 4ый день после трансфекции по 400мкл культур переносили в культуральные флаконы (T25), содержащие по 5 ml свежей суспензии Sf9 клеток (~ 1.5x106 cells/флакон). Дали клеткам прикрепиться в течение ~4 часов и инкубировали при 27°C еще 4 дня. После этого проводили флуоресцентную микроскопию. Для обоих слитных белков наблюдалась сходная диффузная локализация в цитоплазме и ядре, напоминающая локализацию GFP и других флуоресцирующих белков в клетках (см. файл Fig. 1 в приложении). 5) Для исследования физико-химических свойств хеликазных доменов ретротанспозонов насекомых Plutella xylostella и Spodoptera frugiperda обе клонированные хеликазы выделяли из клеток E.coli. Для этого соответствующие гены были клонированы в экспрессионный вектор pQE30, в результате чего происходило слияние N-конца гена-интереса с 6 гистидинами, которые в дальнейшем позволили с помощью аффинной хроматографии выделить интересующий нас белок. Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli штамма BL21 (F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS)). 50 мл ночной культуры разбавляли питательным бульоном 2YT (бакто-триптон 16 г/л («Panreac», Испания), дрожжевой экстракт 10 г/л, NaCl 5 г/л («Helicon», Россия)), содержащим ампициллин («MP Biomedicals», Франция) в концентрации 100 мкг/мл, до объема 500 мл и выращивали при 37°С в течение одного часа. К бактериальной суспензии добавляли индуктор экспрессии белков – ИПТГ («Thermo scientific», США) до конечной концентрации 1мМ. Индукцию проводили в течение трех часов. Далее клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 3470g в течение десяти минут. Осадок использовали для дальнейшей хроматографической очистки белков. Хроматографию (гис)6-белков проводили согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы «QIAGEN» с некоторыми изменениями. Осадок клеток ресуспендировали в трех объемах буфера А (6М гуанидингидрохлорид («Helicon», Россия), 0,1 М NaH2PO4, 0,01 М трис-HCl рН 8,0) с добавлением ингибитора протеаз PMSF («Helicon», Россия) в концентрации 5мМ. Клетки лизировали при комнатной температуре в течение одного часа при качании 100 оборотов/мин. Клеточные лизаты центрифугировали 10 минут при 16100g. Супернатант добавляли в колонку, содержащую Ni-НТА агарозу («QIAGEN», Германия). Связывание (гис)6-белков с Ni-НТА агарозой осуществляли при комнатной температуре и умеренном перемешивании. Через час инкубации давали стечь клеточному лизату и промывали осадок Ni-НТА последовательно по 10 мл буфером А, затем буфером B (8 М мочевина, 0,1 М NaH2PO4 , 0,01 М трис-HCl рН 8,0 («Helicon», Россия)), буфером С (аналогичного состава, рН 6,3). Затем связанные с Ni-НТА (Гис)6- белки элюировали буфером Е (аналогичного состава, рН 4,5), собирая четыре фракции по 1 мл. Состав полученных фракций анализировали методом электрофореза в ПААГ с ДСН. Препараты белков непосредственно перед использованием диализовали в диализном мешке, вначале против тридистиллированной воды (в объеме ~ 1 литр), проводя смены воды каждые 15-20 минут в течение 2 часов. При последней смене добавляли вместо воды буфер (1мМ HEPES pH 6,0). После диализа для осаждения неспецифических агрегатов белка препарат центрифугировали в течение 10 минут при 6000 g. Концентрацию белков определяли по поглощению при 280 нм, для чего измеряли спектры в области 230–360 нм в кварцевых кюветах c длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 фирмы Shimadzu scientific Instruments, Inc. (Япония). Для экспериментального изучения вторичной структуры белков были измерены спектры кругового дихроизма (КД). Измерения проводились в коротковолновой области ультрафиолетового диапазона в интервале длин волн от 185 до 260 нм. Спектры двух исследованных полноразмерных хеликаз имели форму и положение максимумов, характерные для белков со значительным содержанием α-спиралей при малом содержании β-структур: такие спектры имеют отрицательный максимум в районе 208 нм, плечо в районе 222 нм и большой положительный пик в районе 190 нм. Однако несмотря на одинаковую форму спектров, количество α-спиральных элементов в составе двух белков заметно отличались. Cогласно эмпирической формуле Гринфилда-Фасмана, мы оценили содержание α-спиралей для двух хеликаз ретротранспозонов насекомых. Получилось, что этот белок у Plutella xylostella содержит примерно 43% α-спиральных элементов, тогда как хеликазный домен Spodoptera frugiperda имеет в своем составе несколько большее процентное содержание α-спиралей – 49%. Известно, что SF1 РНК-хеликазы вирусов состоят из минимум трех структурных доменов. Для экспериментального подтверждения этого предположения хеликазные белки насекомых были проанализированы с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Известно, что плавление однодоменных белков с выраженной третичной структурой происходит по принципу «все или ничего», то есть при нагревании не происходит денатурации отдельных частей белковой молекулы, а вся глобула одновременно утрачивает свою структуру, причем процесс этот сопровождается выделением тепла. Прибор для исследования ДСК фиксирует избыточную теплоемкость при постоянном давлении, и на основании анализа этой характеристики можно судить как о термодинамических характеристиках белка, так и о его третичной структуре. Спектр ДСК хеликаз действительно имеет вид, характерный для мультидоменных белков. Деконволюция термограммы полноразмерной хеликазы Plutella xylostella позволяет выделить в её составе три пика: наиболее легкоплавкий компонент имеет температуру плавления равную 38°C и обладает слабокооперативным характером, свойственным белкам со значительным содержанием природно неупорядоченных элементов, а два более тугоплавких компонента обладают температурой плавления 44°C и 53°C, соответственно. Чтобы идентифицировать калориметрические домены полноразмерного белка и соотнести их со структурными, были проведены измерения кривых плавления двух обеих хеликаз насекомых. Термограммы обоих белков имели три четко выраженных пика избыточной теплоемкости: таким образом, белок у обоих насекомых имеет в своем составе три гипотетических домена: наиболее термостабильный N-концевой домен, центральный домен, способный образовывать четко выраженную третичную структуру, и С-концевой домен со значительной внутренней неупорядоченностью. Помимо изучения доменной организации и вторичной структуры белка-хеликазы нами была исследована методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) способность его к гомологичным белок-белковым взаимодействиям. Этот метод используется для оценки размеров, как индивидуальных молекул белка, так и белковых комплексов в растворах (Nemykh et al 2008). Полученные методом ДЛС результаты обычно представляют как число частиц определенного размера, где размер частицы является ее гидродинамическим диаметром, апроксимированным к параметрам глобулярной частицы. Средние размеры комплексов, формируемых хеликазой Plutella xylostella при 25°C, составляют около 21 нм. Немного более мелкие олигомеры (17 нм) формирует хеликаза Spodoptera frugiperda. При измерении гидродинамического диаметра денатурованного белка, находящегося в растворе 4М мочевины, значение диаметра снижается, что говорит о разрушении комплекса в денатурирующих условиях. Причем уменьшение размеров происходит только у обоих хеликаз. Таким образом, полноразмерный хеликазный домен ретротранспозонов насекомых в нативных условиях обладает способностью к гомологичным белок-белковым взаимодействиям в результате чего образуются олигомеры размером 17-21 нм. Все результаты получены впервые в мире, т.к. феномен наличия в ретротранспозонах хеликазных доменов не был ранее известен. | ||
3 | 8 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Хеликазы плюс-РНК-содержащих вирусов, слитые с белками ретротранспозонов вследствие горизонтального переноса генов |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".