ИСТИНА

Рибосома является молекулярной машиной, она осуществляет направленное передвижение тРНК-мРНК комплексов и присоединение трансляционных факторов. Эти свойства рибосомы обеспечиваются подвижностью её частей и наличием нескольких тРНК-связывающих участков (А, Р и Е-сайты). Факторы eEF2 (EF-G) и EF-4 действуют на стадии транслокации рибосомы. Оба белка взаимодействуют с рибосомой таким образом, что тРНК-мРНК комплексы внутри неё становятся способными переходить из одного тРНК-связывающего участка в другой, однако факторы придают этому переходу противоположное направление. Биологическая роль прямой транслокации, в сторону 3’-конца мРНК, ясна – она устанавливает рибосому на новом кодоне, определяющем следующую аминокислоту в полипептиде. Роль обратной транслокации не понятна, но, видимо, является важной, так как EF-4, осуществляющий её, высококонсервативен у бактерий и в митохондриях и хлоропластах эукариот. Несмотря на это, в цитоплазме эукариот не найдено аналогичного белка. Однако, согласно нашим предварительным экспериментам, эту функцию у эукариот может выполнять eEF2. Выяснение условий, при которых прямая транслоказа, eEF2, ведет себя как обратная, возможно, приведет к выяснению роли обратной транслокации, а также более глубокому пониманию функционирования рибосомы, как молекулярной машины. На решение этих задач и направлен данный проект.

The ribosome is the molecular machine that performs a directional movement of tRNA-mRNA complexes and joining translational factors. These properties of the ribosome are provided by the mobility of its parts, and the presence of several tRNA-binding sites (A, P and E sites). Factors eEF2 (EF-G) and EF-4 operate in the step of ribosome translocation. Both proteins interact with the ribosome such that tRNA-mRNA complexes within it get able to move from one tRNA binding site to another, but factors guide the transition in the opposite directions. The biological role of direct translocation (towards the 3'-end of the mRNA) is clear - it sets on a new codon that determines the next amino acid in the polypeptide. The role of reverse translocation is not clear, but, apparently, is important, because EF-4 is highly conserved protein in bacteria and eukaryotic mitochondria and chloroplasts. Despite this, in the cytoplasm of eukaryotes analogical protein is not found. However, according to our preliminary experiments, this function in eukaryotes can perform eEF2. Clarification of the conditions under which direct translocase, eEF2, behaves like a reverse, may lead to the clarification of the role of reverse translocation, as well as a better understanding of the functioning of the ribosome as a molecular machine.

В ходе выполнения проекта будут собраны элонгационные комплексы на разных мРНК в реконструированной системе трансляции эукариот и с помощью метода toe-print анализа будет определено, каким образом на eEF2-зависимую обратную транслокацию влияют антибиотики (циклогексимид, гигромицин), свойства деацилированной тРНК в Е-сайте рибосомы (кодон-антикодновые взаимодействия и свойства акцепторной части), последовательность мРНК или аминокислотный состав пептида, доменный состав eEF2, концентрация компонентов трансляционной смеси, другие трансляционные факторы (факторы терминации, инициации трансляции). Ожидаемые результаты будут получены впервые, так как касаются роли eEF2 не только в прямой, но и в обратной транслокации.

Полученные данные помогают разъяснить механизмы действия рибосомы, как молекулярной машины, в частности, зависимость направления её действия от различных факторов и их концентраций. Результаты указывают на принцип работы eEF2 как в прямой, так и обратной транслокации и роль остатка дифтамида в IV-домене белка. Выявленные параметры реакции, такие, как большое количество деацилированной тРНК и eEF2, позволяют предположить, что обратная транслокация может играть роль в живой клетке в условиях стресса, в частности, в условиях заражения вирусами или при голодании. Все эти факты помогут в исследованиях биосинтеза белка как в моделях, так и на живых организмах.

Нам удалось показать, что eEF2 способен действовать как обратная транслоказа в эукариотической системе трансляции. Белок действует на рибосомы, содержащие пептидил-тРНК с различными пептидами (как по последовательности, так и по длине). Для реакции необходима деацилированная тРНК, распознающаяся в Е-сайте, а также остаток дифтамида IV-домена eEF2 - уникальной модификации для эукариот и архей, отсутствующей в прокариотах. Эффективность обратной транлокации увеличивается при увеличении количества eEF2 или усилении его связывания с рибосомой.