ИСТИНА

Цель исследования заключается в решении проблемы, связанной с выяснением механизмов модификации белков под действием окиси азота (S- нитрозилирования и окисления цистеиновых и нитрозилирование тирозиновых остатков), а также влияния этих модификаций на развитии различных патологий, прежде всего, нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы.

Nitric oxide plays an important role in the regulation of many processes occurring in living organisms, and a huge number of works are devoted to the study of its effect both on individual proteins and on the vital activity of cells and the functioning of tissues and organs. In addition, a number of drugs have been created that allow regulation of NO content to have the desired effect on the body. However, many aspects of the effect of NO on proteins remain insufficiently studied, primarily due to the instability of the main product of S-nitrosylation of cysteine residues. Elucidation of the molecular mechanisms of nitrosylation is an urgent task, the solution of which will allow to establish the previously unknown consequences of the effect of nitric oxide on the functioning of living organisms and to find new targets suitable for creating drugs against neurodegenerative diseases. The novelty of the project lies in the identification of new types of protein modifications under the influence of nitric oxide, in the elucidation of previously unknown features of nitrosylation, as well as the consequences of nitrosylation and the associated protein oxidation for the function of cells and pathological transformation of amyloid proteins. It is known that nitric oxide can lead to three main protein modifications: S-nitrosylation or oxidation of sulfhydryl groups of cysteine residues, and nitrosylation of tyrosine residues of proteins. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is a protein that is involved both in the regulation of energy metabolism and in the induction of apoptosis. It will be used as a model object for studying the products of NO action and the ratio between the products of S-nitrosylation / oxidation of sulfhydryl groups of cysteine residues, as well as the effect of two types of modification on the properties of proteins. It will be necessary to prove which of the two types of modification of the enzyme under the action of nitric oxide leads to its binding to the Siah1 protein, to the movement of GAPDH into the nucleus and to the subsequent induction of apoptosis. To clarify this issue, it will be necessary to compare the changes in the catalytic properties of the enzyme and its structure upon S-nitrosylation or oxidation of sulfhydryl groups of cysteine residues, the interaction of two types of the modified enzyme with partner proteins, as well as the ability of not only nitrosylated, but also oxidized GAPDH to induce apoptosis. Information on the features of modification of GAPDH with nitric oxide and the role of this process in the induction of apoptosis will make it possible to establish the unknown mechanism of action of one of the drugs against Parkinson's disease, which is a deprenyl derivative, the target of which is GAPDH. It is also planned to establish the reasons for the rather specific effect of nitric oxide on proteins containing sulfhydryl groups, since only some of them undergo S-nitrosylation. We believe that only highly reactive sulfhydryl groups in a particular microenvironment can undergo such a modification. To test this assumption, we will compare the S-nitrosylation of wild-type and enzyme GAPDH with the replacement of the second (non-catalytic) cysteine residue of the active site with serine. In addition, the effect of NO on the catalytic functions of other enzymes will be studied, and the relationship between the efficiency of modification and the characteristics of sulfhydryl groups will be established, including the need for the presence of an additional SH-group in the immediate environment of the modified group. A separate part of the project will be devoted to studying the effect of nitrosylation on the pathological transformation and infectivity of amyloid proteins. The modification of alpha-synuclein will be studied. Alpha-synuclein lacks cysteine residues, and nitrosylation can occur only at tyrosine residues. Prion protein contains two cysteine residues, and there is no information on S-nitrosylation or oxidation of these residues. The possibility of their nitrosylation/oxidation will be studied. Previously, it was shown that nitrosylation of tyrosine residues of alpha-synuclein can lead to the subsequent "crosslinking" of protein monomers with the formation of dimers; however, in experiments carried out using the recombinant protein, the possibility of such "crosslinking" due to disulfide bonds between Tyr136Cys mutant forms of the protein was not excluded. As we have shown earlier, during the production of alpha-synuclein in the bacterial system, such mutant forms with substitutions Tyr136Cys are produced. Thus, the effect of nitrosylation at tyrosine residues of alpha-synuclein protein preparations free of mutant Tyr136Cys forms on the formation of its amyloid forms (oligomers and fibrils) will be studied and, therefore, the role of nitric oxide in the development of Parkinson's disease and other synucleinopathies will be established. During the nitrosylation of prion protein, both S-nitrosylation of cysteine residues and nitrosylation of tyrosine residues will be studied. There is no information on the role of such modifications of the prion protein in its amyloid transformation. The elucidation of their mechanisms will make it possible to establish the significance of additional protein cross-links due to the formation of dityrosines or disulfide bonds in the stabilization of amyloid structures. It is also possible that the modification of monomeric forms of prion protein under the action of NO can prevent its amylod transformation, preventing the formation of ordered structures. The role of various chaperonins in the regulation of pathological transformation of amyloid proteins will also be elucidated. It should be noted that special attention in the project will be paid to the relationship between nitrosylation and Parkinson's disease, since the two main objects of research, alpha-synuclein and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, are directly involved in the pathological processes that cause this disease. The study of the mechanisms of nitrosylation of proteins involved in the emergence and development of neurodegenerative diseases will not only provide new fundamental knowledge about these diseases, but also help finding new targets suitable for the development of means of their prevention and treatment.

Планируемые результаты. 2021 год 1. Будут получены экспериментальные доказательства гипотезы, согласно которой при воздействии доноров NO на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД) образующаяся ГАФД-S-NO является лишь промежуточным продуктом S-нитрозилирования каталитического остатка цистеина активного центра. При этом после гидролиза ГАФД-S-NO может образовываться цистеин-сульфеновая кислота. 2. Будет продемонстрирована роль второго (некаталитического) 156 остатка цистеина активного центра ГАФД в S-нитрозилировании фермента. 3. Будут идентифицированы белки, взаимодействующие с S-нитрозилированной или окисленной по остаткам цистеина ГАФД в эукариотических клетках. 4. Будет оценена возможность S-нитрозилирования рекомбинантного овечьего прионного белка. 5. Будет проведено нитрозилирование альфа-синуклеина и показано влияния такой модификации на его амилоидную трансформацию. 6. Будут подготовлены и направлены в редакции журналов, по крайней мере две статьи, а также опубликованы 2 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях. 2022 год. 1. Будут получены данные о влиянии окиси азота, опосредованном модификацией глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, на индукцию апоптоза и энергетический обмен эукариотических клеток. Будет установлено участие двух типов модификаций ГАФД под действием окиси азота – S-нитрозилирования и окисления цистеиновых остатков в регуляции жизнедеятельности клеток. 2. Будут идентифицированы белки с окисленными под действием окиси азота до сульфеновой кислоты цистеиновыми остатками в эукариотических клетках 3. Будут выделены различные шаперонины и установлены особенности их взаимодействия с S-нитрозилированным и окисленным по остаткам цистеина прионным белком. 4. Будет продемонстрировано влияние S-нитрозилирования и окисления цистеиновых остатков на амилоидную трансформацию прионного белка, а также воздействие модифицированных форм прионного белка на функционирование системы шаперонов. 5. Будет установлена роль нитрозилирования остатков тирозина в образовании димерных форм альфа-синуклеина за счет «дитирозиновых сшивок». Будут получены данные о влиянии нитрозилирования мономеров, олигомеров и фибрилл альфа-синуклеина на формирование амилоидных структур. 6. Будут опубликованы четыре статьи в изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus, а также 2 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях. 2023 год 1. Будет обоснована общая концепция о молекулярных механизмах модификации белков окисью азота, включая S-нитрозилирование, окисление сульфгидрильных групп и нитрозилирование остатков тирозина, а также о роли таких модификаций в развитии патологических процессов, прежде всего, апоптоза и амилоидной трансформации белков. 2. Будут идентифицированы новые мишени, пригодные для создания лекарственных средств против амилоидных нейродегенеративных заболеваний, а также разработаны способы профилактики и лечения синуклеинопатий и прионных болезней на основе информации о роли нитрозилирования в возникновении данных патологий. 3. Будут опубликованы четыре статьи в изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus, а также 3 тезиса докладов на всероссийских и международных конференциях.

Ранее при выполнении работ по проектам Российского Научного Фонда, РФФИ и Роснауки, а также по госбюджетным темам, нашим коллективом были получены важные результаты, имеющие прямое отношение к представленному проекту и являющиеся базой для его выполнения. Так, нами было начато исследование взаимодействия некоторых амилоидогенных белков (пептида бета-амилоида) с ненативными формами определенных глобулярных белков и доказана высокая прочность и специфичность такого рода взаимодействий. Нами было также продемонстрировано накопление денатурированных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) в мозгу животных при различных способах моделирования болезни Альцгеймера. Нами были подробно исследованы особенности агрегации различных белков методами лазерного светорассеяния, а также другими физико-химическими методами (флуоресцентной и КД-спектроскопии, калориметрии и аналитического ультрацентрифугирования), в том числе прионных белков, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, молочных казеинов и различных шаперонов. Накоплен большой опыт по выделению шаперонов, рекомбинантных белков и ферментов и их исследованию с помощью современных физико-химических и биоинформатических методов. Таким образом, у коллектива есть большой научный задел по изучению тех белков, которые являются объектами исследования в данном проекта. Накопленный при проведении этих работ опыт позволит адекватно проводить запланированные в предлагаемом проекте исследования и получить важные фундаментальные результаты, касающиеся ненаследственных изменений белков. Все участники проекта имеют длительный опыт совместной работы в области, которой посвящен предлагаемый проект, а также совместные публикации. Индекс Хирша руководителя проекта - равен 26, совокупный индекс цитирования 161 работы равен 2118, число ссылок на самую цитируемую работу - 85 (анализ проведен по данным «WEB of Knoweledge» на фамилии автора «Muronetz V» или «Muronets V.».

Проект был посвящен роли нитрозилирования белков в регуляции жизнедеятельности клеток, а также выяснению участия этой пост-трансляционной модификации в развитии патологических процессов. Основными объектами исследования были гликолитический фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), амилоидные белки - альфа-синуклеин и прионный белок (PrP), а на последних этапах работы по проекту - рецептор-связывающий домен (RBD) спайк-белка коронавируса SARS-CoV-2 (RBD-фрагмент). Модификации ГАФД окисью азота за последние четверть века было посвящено много работ. После того, как данные об NO-индуцированном АДФ-рибозилировании ГАФД не подтвердились, было принято считать, что окись азота нитрозилирует каталитический остаток цистеина с образованием ГАФД-SNO. Такая модификация приводит к инактивации фермента, а также индуцирует его взаимодействие с E3-убиквитин-лигазой Siah1. Комплекс ГАФД с Siah1 транслоцируется в клеточное ядро и вызывает апоптоз (Рис.1). Рис. 1. Гипотеза Соломона Снайдера – NO-индуцированое взаимодействие ГАФД с E3-убиквитинлигазой Siah1. Предполагалось, что описанный механизм является важным элементом каскада процессов, вызывающих апоптоз, и играет определющую роль в развитии некоторых нейродегенеративных заболеваний. Однако, несмотря на длительную историю интенсивного изучения S-нитрозилирования ГАФД, прямых доказательств присутствия в этом белке S-NO групп не было. Более того, некоторые косвенные данные указывали на возможность появления в результате воздействия окиси азота других модификаций цистеиновых остатков активного центра. При этом известно, что пероксид водорода также модифицирует каталитические остатки цистеина до сульфеновой кислоты и вызывает индукцию апоптоза. В связи с этой неопределенностью оставался открытым вопрос о необходимости именно S-нитрозилирования, а не любой другой модификации каталитического остатка ГАФД для транслокации фермента в ядро, индукции апоптоза и других последствий пост-трансляционных изменений белка. Для проверки гипотезы, согласно которой при воздействии доноров NO на ГАФД образующаяся ГАФД-S-NO является не единственным продуктом S-нитрозилирования 150 остатка цистеина активного центра, были идентифицированы продукты ее модификации. Сульфгидрильная группа остатка Cys150 (положение в ГАФД из мышц кролика) катализирует дегидрогеназную реакцию. При окислении Cys150 с образованием цистеин-сульфеновой кислоты (Cys-S-OH) у ГАФД появляется ацилфосфатазная активность, что позволяет следить за накоплением этого производного. Было доказано, что в присутствии доноров NO одновременно с исчезновением дегидрогеназной активности наблюдается рост ацилфосфатазной активности, что говорит об образовании Cys-S-OH в активном центре ГАФД. Добавление димедона, являющегося специфическим реагентом на цистеин-сульфеновую кислоту, приводит к полному исчезновению ацилфосфатазной активности. Методами масс-спектрометического анализа (ESI-MS и MALDI-TOF MS) было доказано, что инкубация ГАФД в присутствии донора окиси азота DEANO приводит к образованию двух основных продуктов: S-нитрозилированной ГАФД и S-сульфенированной ГАФД. Цистеин-сульфеновая кислота была идентифицирована по образованию ее аддукта с димедоном. Для идентификации цистеинового остатка, подвергающегося S-сульфенированию и включению димедона, был проведен трипсиновый гидролиз препарата ГАФД с последующим анализом полученного спектра пептидов. Фрагментация пептида с включением димедона указывает, что модификации подвергается каталитический остаток Cys150. Количественная оценка продуктов S-нитрозилирования ГАФД разными методами показала, что в среднем при модификации 3 из 4 каталитических цистеиновых остатков в тетрамерной молекуле ГАФД 2 остатка нитрозилируются (Cys-S-NO), а один окисляется до сульфеновой кислоты (Рис. 2). Рис. 2. Соотношение содержания модифицированных форм ГАФД после обработки окисью азота. Предположительно, цистеин-сульфеновая кислота образуется вследствие гидролиза нитрозилированной ГАФД. Таким образом, впервые прямыми методами было доказано S-нитрозилирование и S-сульфенирование каталитических цистеиновых остатков ГАФД при воздействии на фермент окиси азота. Была исследована роль некаталитического остатка цистеина при S-нитрозилировании глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Присутствие второго цистеинового остатка в активном центре ГАФД характерно для ферментов млекопитающих. У млекопитающих последовательность CTTNC в активном центре ГАФД строго консервативна, при этом только один цистеиновый остаток (Cys150 в ферменте из мышц кролика или Cys152 в ГАФД человека) принимает участие в катализе. Функция второго остатка цистеина (Cys156 в ГАФД человека) до сих пор остается неясной, поскольку мутация Cys156Ser не влияет на катализ дегидрогеназной реакции. Нами было проверено предположение об участии Cys156 в регуляции S-нитрозилирования ГАФД, а также в последующих трансформациях модифицированного белка. Были выделены две формы рекомбинантной ГАФД человека: фермент дикого типа (hGAPD) и мутантная форма ГАФД с заменой некаталитического остатка цистеина на серин (hGAPDHC156S). Было доказано, что hGAPDH и его мутантная форма (hGAPDHC156S) подвергаются инактивации в присутствии донора NO сходным образом из-за модификации каталитического остатка Cys152. В белках hGAPDH и hGAPDH C156S при практически полной модификации каталитических цистеинов определяется приблизительно 3 остатка S-NO на моль тетрамера ГАФД. Однако ацилфосфатазная активность нитрозилированной hGAPDH дикого типа в 5 раз выше по сравнению нитрозилированной hGAPDH C156S. Эти результаты позволили предположить, что присутствие Cys156 в активном центре hGAPDH способствует образованию или стабилизации цистеин-сульфеновой кислоты. Возможно, без дополнительного цистеинового остатка образовавшийся GAPDH-S-NO более стабилен и GAPDH-S-OH не образуется. На основании полученных данных можно предположить, что гидролиз S-нитрозилированной ГАФД (GAPDH-S-NO) с образованием цистеин-сульфеновой кислоты является важным элементом механизма, обеспечивающего ответ клетки на воздействие NO. Именно в этом процессе играет важную роль второй остаток цистеина активного центра ГАФД. Кроме того, окисление ГАФД пероксидом водорода с образованием цистеин-сульфеновой кислоты в активном центре ГАФД стимулирует процесс S-глутатионилирования фермента в присутствии восстановленного глутатиона (GSH). Принимая во внимание высокое содержание GSH в клетках, гидролиз GAPDH-S-NO с образованием GAPDH-S-OH может способствовать S-глутатионилированию каталитического цистеина ГАФД, которое может принимать участие в регуляции апоптоза в условиях окислительного стресса. S-нитрозилирование и S-глутатионилирование ГАФД не только инактивируют фермент, но и снижают его термостабильность, а также повышают его чувствительность к действию протеиназ. При этом глутатионилирование вызывает более выраженную дестабилизацию, чем нитрозилирование. Вероятно, дестабилизация обусловлена уменьшением прочности связывания с ферментом ее кофактора NAD (никотинамидадениндинуклеотида) из-за невозможности образования «комплекса с переносом заряда» между никотинамидным кольцом NAD и SH-группой каталитического Цис152 из-за модификации последнего. Более выраженная дестабилизация ГАФД при S-глутатионилировании может быть обусловлена введением в активный центр более крупного радикала. Реактивация нитрозилированной ГАФД дитиотреитолом, восстановленным глутатионом и глутаредоксином (Grx1) происходит в течение нескольких минут, тогда как глутатионилированная ГАФД реактивируется только дитиотреитолом. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что S- нитрозилирование ГАФД является относительно мягкой модификацией, которая сопровождается умеренными изменениями третичной структуры и достаточно легко обратима в физиологических условиях в присутствии восстановленного глутатиона или глутаредоксина 1. S-глутатионилирование ГАФД приводит к более выраженным изменениям в молекуле ГАФД по сравнению с нитрозилированием, причем реактивация глутатионилированной ГАФД происходит гораздо медленнее по сравнению с реактивацией нитрозилированной ГАФД. По этой причине наиболее вероятно, что именно S-глутатионилированная ГАФД накапливается в клетках при окислительном стрессе и может участвовать в регуляции клеточного ответа на окислительный стресс. Было обнаружено, что модификация ГАФД метилглиоксалем приводит к практически необратимому окислению Цис152 активного центра до цистеин-сульфиновой кислоты (SO2H) и модификации аргининовых остатков R80 и R234 с образованием гидроимидазолонов. При этом предварительное нитрозилирование ГАФД с целью предотвращения необратимой инактивации фермента метилглиоксалем не оказывает существенного влияния ни на снижение ферментативной активности, ни на эффективность реактивации. Взаимосвязь между различными пост-трансляционными модификациями каталитического цистеинового остатка ГАФД представлены на рис. 3. Рис. 3. Схема взаимосвязи модификаций каталитического цистеинового остатка Цис152 глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (ГАФД). Было доказано, что под действием окиси азота образование цистеин-сульфеновой кислоты наблюдается не только при обработке изолированного фермента, но и в культуре клеток НЕК 293Т. При этом окись азота и пероксид водорода оказывают сходный эффект на клетки, вызывая доза-зависимое появление сульфенированных белков, среди которых наряду с ГАФД был идентифицирован сократительный белок бета-актин. Сделанные наблюдения подтверждают наше предположение о том, что эффекты, возникающие при воздействии на ГАФД окиси азота, например, индукция апоптоза, могут быть связаны не только и не столько с ее нитрозилированием, а скорее с сульфенированием белка, которое может быть достигнуто окислением пероксидом водорода. С помощью метода иммунопреципитации было показано, что в клетках HEK293Т присутствуют комплексы ГАФД с белком Siah1, но только в том случае, если клетки предварительно инкубируют с окисью азота или пероксидом водорода. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что взаимодействие ГАФД с Siah1 стимулируется не только нитрозилированием фермента, но и его окислением. При этом проведение экспериментов по связыванию ГАФД, модифицированной по цистеиновым остаткам активного центра, с иммобилизованным на сефарозе белком Siah1 не выявило прочного взаимодействия между двумя белками и какого-либо влияния модификаций ГАФД на этот процесс. Возможно, отсутствие такого взаимодействия обусловлено получением Siah1 в бактериальной системе, в которой не происходят характерные для эукариот пост-трансляционные модификации. Возможные последствия воздействия окиси азота представлены на рис. 4. Рис 4. Схема возможных последствий воздействия окиси азота (NO) на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Окисление пероксидом водорода и S-нитрозилирование оказывают сходное влияние на жизнедеятельность клеток. В частности, оба воздействия приводят к снижению активности ГАФД, причем как изолированного фермента, так и ГАФД в клетках, обработанных окисью азота или пероксидом водорода. Кроме того, сульфенирование бета-актина в результате воздействия окиси азота может влиять на его способность к формированию фибрилл. При воздействии на клетки окиси азота или пероксида водорода происходит также S-глутатионилирование бета-актина и ГАФД. Так как ГАФД-SNO легко подвергается денитрозилированию и восстановлению дегидрогеназной активности, а ГАФД-SSG деглутатионилируется гораздо медленнее, то при воздействии Н2О2 или NO на клетки в них происходит накопление глутатионилированной ГАФД и, возможно, других глутатионилированных белков. Были также выявлены наиболее вероятные белки-партнеры ГАФД - шаперон HspP90A и бета-актин, взаимодействие с которыми достаточно прочно и может быть выявлено методом иммунопреципитации. При этом обработка клеток пероксидом водорода или донором NO не влияет на образование комплекса между ГАФД и белками-партнерами. На изолированных белках было обнаружено связывание ГАФД с мономерной формой актина (G-актин), но не с его фибриллами (F- актин). Удельная активность ГАФД снижалась при добавлении избытка мономеров бета-актина на 20-30%, вероятно, из-за дестабилизации ГАФД при его связывании с белком-партнером. Следует отметить, что указанными методами выявляются прочные полибелковые комплексы. Однако нельзя исключить, что ГАФД может обратимо адсорбироваться на фибриллах актина с невысокими константами связывания, участвуя в энергообеспечении сократительных функций. Возможно, что такой тип связывания может регулироваться посттрансляционными модификациями фермента. Были получены первые доказательства участия S-нитрозилированной ГАФД в реакции транс-нитрозилирования других белков, в частности мономерных форм актина. Важная роль ГАФД в транс-нитрозилировании белков обусловлено высокой концентрацией этого белка в клетке и уникальной реакционной способностью сульфгидрильной группы активного центра фермента. Была выявлена взаимосвязь патологической трансформации амилоидогенных белков с их S-нитрозилированием, а также с модификацией некоторых белков-партнеров. Прежде всего, была проверена гипотеза, согласно которой альфа-синуклеин, не подвергающийся S-нитрозилированию из-за отсутствия в нем цистеиновых остатков, может участвовать в регуляции содержания окиси азота в клетке. Было показано, что суперэкспрессия альфа-синуклеина в клетках нейробластомы, а также добавление альфа-синуклеина извне, не увеличивают концентрацию окиси азота в клетках и не усиливают S-нитрозилирование белков. При этом при высокой концентрации окиси азота модификация белков происходит независимо от присутствия альфа-синуклеина в клетках. Сделанные наблюдения косвенно подтверждает заключение, что альфа-синуклеин не стимулирует образование окиси азота, которое, как предполагалось ранее, может происходить из-за активации NO-синтаз. Было доказано, что амилоидогенный прионный белок может подвергаться модификации в присутствии доноров окиси азота с образованием S-NO групп. Гидролиз S-NO групп PrP приводит к образованию цистеин-сульфеновой кислоты, что было доказано иммунохимическим и масс-спектроскопическим методами. Модификации подвергается сульфгидрильная группа 182 остатка цистеина прионного белка, расположенного вo второй альфа-спирали рядом с бета-тяжем. С помощью стимулирования амилоидной трансформации прионного белка вирусным шаперонином OBP в присутствии АТФ удалось провести эксперименты в мягких условиях, которые не вызывают распада продуктов модификации. Было показано, что обработка прионного белка окисью азота замедляет его амилоидную агрегацию в присутствии функционально активного шаперонина. Вероятно, модификация Cys182 может затруднять образование фибрилл, препятствуя укладке бета-структурных элементов. Отдельный аспект работы был связан с исследованием роли цистеиновых остатков рецептор-связывающего домена (RBD) спайк-белка коронавируса SARS-CoV-2 в регуляции его функционирования. Было показано, что из 9 цистеиновых остатков RBD-фрагментa без дополнительных воздействий может подвергаться модификации только один, поскольку остальные 8 образуют дисульфидные мостики. Единственный неспаренный остаток Cys538 после предварительного восстановления дитиотретитолом может подвергаться S-нитрозилированию с последующим образованием сульфеновой кислоты на части цистеиновых остатков. При этом исходный препарат RBD-фрагментa также содержит цистеин-сульфеновую кислоту, что указывает на высокую чувствительность Cys538 к окислению. Таким образом, в зависимости от условий, RBD-фрагмент может содержать SH, SNO или SOH группы или их сочетания, которые оказывают разное влияние на его взаимодействие с другими белками. Так, взаимодействие RBD-фрагментa с клеточным рецептором ACE2 регулируется состоянием С-концевого цистеинового остатка Cys538. S-нитрозилирование или окисление до сульфеновой кислоты цистеинового остатка RBD-фрагментa стимулирует его связывание с ACE2, тогда как восстановление до SH-группы вызывает 2-кратное снижение эффективности взаимодействия двух белков. Таким образом, можно предположить, что взаимодействие RBD-фрагментa спайк белка с ACE2 может регулироваться окислительно-восстановительным статусом среды. При этом восстановление сульфгидрильных групп RBD-фрагментa может приводить к ухудшению связывания с клеточным рецептором ACE2, препятствуя проникновения частиц вируса в клетку. Высокая чувствительность Cys538 RBD-фрагментa к модификации делает этот остаток потенциальной мишенью для соединений, которые могут быть использованы для предотвращения развития данной вирусной инфекции. Было также обнаружено, что в присутствии RBD-фрагмента спайк-белка, содержащего разные модификации единственного свободного цистеинового остатка, изменяется патологическая трансформация альфа-синуклеина. В условиях близких к физиологическим, а именно при нейтральных значениях рН и температуре 37 градусов С, нитрозилированный или восстановленный дитиотреитолом RBD-фрагмент существенно уменьшают амилоидную агрегацию альфа-синуклеина, тогда как RBD-фрагмент, содержащий только сульфеновую кислоту, напротив, стимулирует этот процесс. Вероятно, противоречивые сведения о влиянии RBD-фрагментa и полноразмерного спайк-белка на патологическую трансформацию альфа-синуклеина можно объяснить тем, что разные пост-трансляционные модификации цистеиновых остатков RBD-фрагментa оказывают различное, а иногда и противоположное действие на агрегацию этого амилоидогенного белка. Возможно, что разнонаправленным характером воздействия RBD-фрагмента с разными модификациями Сys538 можно объяснить противоречивые данные о влиянии вакцинации и самой инфекции на развитие нейродегенеративных заболеваний, в частности, болезни Паркинсона. Дальнейшие исследования помогут создавать более безопасные вакцины, с помощью модификации или замены Cys538. По результатам работы опубликовано 8 журнальных статьи, причем 6 из них в изданиях первого квартиля (Archives of biochemistry and biophysics, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, Front. Mol. Biosci., Biomedicines, International Journal of Molecular Science). Результаты работы были представлены на 2 международных конференциях в форме 3 устных и одного стендового доклада.