ИСТИНА

Целью предлагаемого фундаментального исследования является изучение энергетических систем митохондрий опухолевых клеток в качестве мишени для стимуляции программируемой клеточной гибели, в частности апоптоза. Апоптоз и рак являются антагонистическими процессами физиологии клетки, поэтому инициация апоптоза является перспективной стратегией борьбы со злокачественными новообразованиями. Исходя из ключевой роли митохондрий в стимуляции/реализации апоптоза, в задачи проекта входит изучение механизмов воздействия на эти органеллы с целью пермеабилизации внешней митохондриальной мембраны и стимуляции выхода про-апоптотических факторов. В последние годы появились данные о том, что субстраты цикла Кребса не только являются «топливом» для митохондрий, но и играют важную роль регуляции механизмов клеточной гибели. Воздействие на различные комплексы дыхательной цепи с целью их дестабилизации и стимуляции образования АФК является перспективным направлением противоопухолевой терапии. Стимуляция окислительного стресса в результате модуляции активности дыхательных комплексов митохондрий послужит мощным фактором, вызывающим пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий и выход про-апоптотических белков, что вызовет гибель клеток. Исследование механизмов регуляции этих событий, несомненно, будет способствовать поиску новых препаратов и стратегий для противоопухолевой терапии.

The aim of the present fundamental study is to explore the energy producing system of mitochondria in tumor cells as a target for stimulation of programmed cell death, particularly apoptosis. Apoptosis and cancer cells are antagonistic processes, so the initiation of apoptosis is a promising strategy for coping with cancer. Based on the key role of mitochondria in the stimulation/execution of apoptosis, in the objectives of the project is to study the mechanisms mitochondrial targeting in order to stimulatie the permeabilization of the outer mitochondrial membrane, and the release of pro-apoptotic factors. In recent years, there is evidence that the substrates of the Krebs cycle are not only "fuel" for mitochondria, but also play an important role the regulation of cell death mechanisms. The impact on the various complexes of the respiratory chain with the aim of destabilizing the stimulation of ROS formation is promising anticancer therapy. Stimulation of oxidative stress as a result of modulating the activity of mitochondrial respiratory complexes serve as a powerful factor causing permeabilization of the outer membrane of mitochondria and release of pro-apoptotic proteins that cause cell death. The study of mechanisms of regulation of these events will undoubtedly contribute to the search for new drugs and strategies for anticancer therapy.

1. Будут получены данные о модуляции клеточной гибели, регуляции потребления кислорода и образования свободных радикалов при совместном использовании терапевтических препаратов (цисплатин, этопозид, доксорубицин) и различными метаболитами (глютамин), субстрами цикла Кребса (сукцинат), и ингибиторами окислительного фосфорилирования (малонат, атрактилозид, олигомицин) в опухолевых клетках различной этиологии. Будет дан ответ на вопрос, является ли нарушение митохондриальной активности непосредственным результатом воздействия противоопухолевых препаратов на митохондрии, либо оно вторично и отражает изменения в погибающих клетках. Параллельное исследование аккумуляции ионов кальция митохондриями и сопоставление этих данных с изменениями дыхательной активности позволит сделать вывод о механизмах, вовлеченных в ПВММ. Использование ингибитора каспаз, ZVAD.fmk, даст возможность оценить вклад каспазной активности в нарушение энергетики митохондрий. 2. Использование прибора Seahorse Analyzer позволит выявить характер повреждения дыхательной цепи – подавление ферментов, разобщение окисления и фосфорилирования, ингибирование АТФ-синтазной активности. В эксприментах с использованием клеток с пермеабилизованной плазматической мембраной будет выявлена чувствительность различных комплексов дыхательной цепи к противоопухолевым препаратам. Подобная модель позволит как стимулировать дыхание митохондрий субстратами различных комплексов, так и подавлять соответствующими ингибиторами. 3. Будут получены данные по модуляции ответа на противоопухолевые препараты субстратами дыхательной цепи, выявлены не изученые ранее функции субстратов цикла Кребса, таких как сукцинат, глютамат, альфа-кетоглютарат. Учитывая роль глутамата в качестве предшественника глутатиона, можно предположить, что подавление глутаминазы приведет к усилению токсического эффекта противоопухолевых препаратов. 4. Будет установлена роль р53 в регуляции дыхания митохондрий и продукции АФК. С этой целью будут использованы клетки карциномы HCT116 как дикого типа, так и лишенных транскрипционного фактора р53. Кроме этого подавление экспрессии этого фактора в других клетках будет осуществляться с помощью малых интерферирующих РНК.

Согласно нашим предварительным данным, воздействие на гликолиз с целью повысить чувствительность опухолевых клеток к терапии, не всегда способны справиться с поставленной задачей (Максимчик и др, Биохимия, в печати). В ряде случаев, в частности, при исследовании клеток карциномы кишечника HCT116, подавление гликолиза сопровождалось устойчивостью к цисплатину (Максимчик и др, статья подготовлена к публикации). Исходя из этого в дальнейшем тактика элиминирования опухолевых клеток будет направлена на энергетику митохондрий, как органелл напрямую задействованных в стимуляции (реализации) клеточной гибели. Наши данные, полученные с использованием клеток нейробластомы, одной из наиболее часто встречающейся опухоли у детей, показывают что стимуляция зависимой от Са2+ индукции неспецифической проницаемости ВММ существенно стимулирует гибель клеток. Так, клетки нейробластомы, в которых экспрессия онкогена MycN была ингибирована, были существенно устойчивы к действию цисплатины, препарата широко применяемого в терапии. Напротив, клетки, несущие MycN, демонстрировали чувствительность к этому препарату. В том случае, когда клетки нейробластомы обрабатывались альфа-токоферил сукцинатом, воздействующим на митохондрии, гибель клеток происходила вне зависимости от наличия или отсутствия MycN. Наши исследования позволили продемонстрировать новые мишени для действия альфа-токоферил сукцината, не известные ранее. Нами было показано, что использование альфа -токоферил сукцината позволяет преодолеть устойчивость опухолевых клеток к терапии в условиях гипоксии. В основе устойчивости лежит стимуляция экспрессии фактора, индуцированного гипоксией. Подавление экспрессии этого фактора с использованием siRNA восстанавливало чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам доксорубицину и цисплатине. В отличие от них, альфа -токоферил сукцинат был способен вызывать гибель клеток как в гипоксических, так и в нормоксических условиях.

1. Показано, что воздейстие на субъединцу D комплекса II способно значительно стимулировать клеточную гибель, вызываемую противоопухолевыми препаратами, такими как цисплатин, этопозид, доксорубицин. Это было связано, со стимуляцией производства активных форм кислорода АФК. Непосредственная оценка количества АФК и спрособность антиоксиданта N-ацетилцистеина подавлять стимуляцию клеточной гибели подтвердили наше предположение. 2. Проведено сопоставление степени подавления работы дыхательной цепи терапевтическими средствами в опухолевых клетках различной этиологии. Следует отметить, что скорости дыхания существенно различаются в различных линиях опухолевых клеток, что является одним из фактров, определяющих чувствительность клеток к противоопухолевым препаратоам. Было отмечено непосредственное воздействие этопозида на дыхательную цепь, в то время как подавление дыхания цисплатином носили вторичный характер и проявлялись спустя часы после воздействия препарата. Оценка отдельных комплексов дыхательной цепи в клетках с пермеабилизованной мягким детергентом дигитонином плазматической мембраной позволила выявить, что мишенью этопозида является комплекс I дыхательной цепи митохондрий. 3. Показана способность экзогенного сукцината подавлять апоптоз вызываемый противоопухолевыми препаратами. Депривация глютамина как стиммулировла гибель клеток в случае использования цисплатина, так и подавляла ее в ответ на этопозид. Нами было показано, что это связано со стимуляцией различных метаболических путей апоптоза в условиях депривации глютамина. В частности, удаление глютамина стимулирует апоптоз в резульате снижения содержания ингибитора каспазы-8 белка FLIP-s, что в свою очередь обусловлено активности протеинкиназы В (Akt). В случае же с этопозидом подавление апоптоза коррелирует с содержанием транскрипционного фактора р53. 4. Обнаружено, что в условиях, моделирующих гипоксию устойчивость клеток к терапии в определенной мере объясняется подавлением экспрессии р53, вызванной противоопухолевым препратом. Это ведет к снижению уровня про-апоптотических белков семейства Bcl-2, и в конечном итоге к подавлению апоптоза.