| 1 |
17 февраля 2021 г.-31 декабря 2021 г. |
Сравнительное изучение роли сериновых пептидаз в метаболизме насекомых-вредителей и оценка возможностей их практического применения |
| Результаты этапа: 1. Охарактеризованы спектры предсказанных сериновых пептидаз (SP) и их неактивных гомологов (SPH) в новособранном объединенном транскриптоме Tenebrio molitor в сравнении со спектрами в новом выпуске (Tcas5.2) секвенированного генома Tribolium castaneum.
2. Проведен анализ уровней экспрессии генов SP и SPH в транскриптомах кишечников личинок тенебрионид.
3. Проанализирован уровень экспрессии генов SP и SPH в транскриптомах из разных стадий развития T. molitor (яйцо, личинка, куколка, имаго) и выявление SP и SPH, специфичных для отдельных стадий, а также имеющих стабильный уровень экспрессии на всех стадиях.
4. Проведена биохимическая идентификация наиболее активных SP на протеомном уровне с использованием селективных субстратов SP, хроматографических и масс-спектрометрических (MS) методов.
5. Проведено сравнение наборов SP, участвующих на начальном этапе гидролиза пищевых белков (в передней части средней кишки, АМ) и на заключительном этапе гидролиза (в задней части средней кишки, РМ).
6. На основании полученных результатов осуществлен выбор наиболее важных SP, обладающих необычной специфичностью, ключевых пищеварительных SP и/или играющих важную роль в процессах метаморфоза, а также SPH с наиболее высоким уровнем экспрессии генов для дальнейших исследований. Подготовлены 5 публикаций и 4 выступления на 4 международных конференциях.
|
| 2 |
10 марта 2022 г.-31 декабря 2022 г. |
Сравнительное изучение роли сериновых пептидаз в метаболизме насекомых-вредителей и оценка возможностей их практического применения |
| Результаты этапа: В течении второго года выполнения проекта мы воспользовались опубликованными в GenBank NCBI двумя новосеквенированными геномами Tenebrio molitor для проверки выявленных нами в транскриптомах последовательностей сериновых пептидаз семейства химотрипсина S1 (SP) и их гомологов с заменами аминокислотных остатков в активном центре (SPH). В итоге было найдено 264 последовательности SP/SPH, и отправлено в NCBI 45 последовательностей, не аннотированных в опубликованных геномах. Изучение локализации генов SP/SPH в геномах T. molitor показало, что лишь 19 генов были одиночными, а остальные лежали в 49 кластерах, содержащих от 2 до 65 генов. Кластеры с максимальным количеством генов, 65, 12 и 10, были представлены преимущественно генами SPH, а также включали эластазоподобные SP, все без регуляторных доменов и преимущественно низкоэкспрессируемые. Также преимущественно низкоэкспрессируемые гены SP и SPH с регуляторными доменами присутствовали в составе кластеров несколько меньших размеров. В то же время, гены высокоэкспрессируемых пищеварительных пептидаз без регуляторных доменов, выявленные нами биохимически на первом году выполнения проекта, локализованы на разных скаффолдах преимущественно в малых кластерах из 2 – 4 генов. Распределение генов по кластерам в значительной степени коррелировало с распределением белковых последовательностей SP и SPH T. molitor на филогенетическом дереве, согласуясь с предположением, что в основе образования кластеров лежит удвоение генов, и большие кластеры сходных генов нужны для их функционального резервирования.
Рекомбинантные препараты профермента высокоэкспрессируемой пищеварительной сериновой пептидазы, rproSerP38, получали в экспрессионной системе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii с His6-tag на С-конце. В результате очистки с использованием металл-хелатной хроматографии из 100 мл культуральной среды было получено 0,4 мг рекомбинантного белка. В поисках более эффективной экспрессионной системы, при клонировании профермента другой высокоэкспрессируемой пищеварительной пептидазы, катепсина rpTcCathL1 Tribolium castaneum, мы использовали эукариотическую систему экспрессии на основе дрожжей Pichia pastoris. Выход целевого белка после очистки составил 1,8 мг на 100 мл культуральной среды.
Для получения активных зрелых форм, очищенные рекомбинантные проферменты подвергали процессингу: rproSerP38 процессировали трипсином, а rpTcCathL1 активировали автокаталитически при кислых рН. Изучены зависимости активности зрелых ферментов от рН, их стабильность и субстратная специфичность. rSerP38 обладал активностью по отношению к субстратам химотрипсинов, а rTcCathL1 – постглутамин-гидролизующей активностью и эффективно гидролизовал иммуногенные пептиды глиадинов. Это качество rTcCathL1 может быть использовано для энзимотерапии непереносимости глютена, включая наследственное заболевание целиакию.
Получение рекомбинантных препаратов пробелка гомолога rproSerPН122 проводили в экспрессионной системе K. kurtzmanii. Анализ полученных образцов целевого белка методами SDS-ПААГ и масс-спектрометрии показал, что они обладают большей молекулярной массой, чем расчетная. В связи с тем, что последовательность белка rproSerPH122 содержит два потенциальных сайта N-гликозилирования, было предположено, что белок гликозилируется в клетках дрожжей. Обработка белка эндогликозидазой Endo H и последующий анализ продуктов реакции с помощью SDS-ПААГ и масс-спектрометрии подтвердили это предположение. На следующем этапе выполнения проекта мы планируем провести характеристику очищенных препаратов как гликозилированного, так и дегликозилированного rproSerPН122.
|
| 3 |
10 марта 2023 г.-31 декабря 2023 г. |
Сравнительное изучение роли сериновых пептидаз в метаболизме насекомых-вредителей и оценка возможностей их практического применения |
| Результаты этапа: В 2023 году получены и охарактеризованы рекомбинантные препараты пищеварительной сериновой пептидазы Tenebrio molitor rSerP38 в активной форме без пропептида и пробелка гомолога сериновой пептидазы rproSerPH122 и разработаны условия процессинга пробелка. Выявлена протеолитическая активность и проведена физико-химическая характеристика очищенных рекомбинантных препаратов гликозилированного и дегликозилированного гомолога rproSerPH122 с консервативной заменой остатка активного центра Ser/Thr. Найдены специфические ингибиторы рекомбинантных препаратов пептидаз. Полученные препараты пищеварительных пептидаз тенебрионид rSerP38 и rTcCathL1 изучены в гидролизе трудногидролизуемых природных пищевых субстратов тенебрионид – глиадинов, а также коллагенов. Разработаны рекомендации по практическому использованию полученных в ходе выполнения проекта результатов по использованию протеолитического потенциала пептидазы rTcCathL1 в медицине для лечения целиакии и щелочной пептидазы rSerP38 в ряде отраслей промышленности. |
