ИСТИНА

Фундаментальной задачей, решаемой в рамках проекта, является исследование амилоидоподобных агрегатов белков в плазме крови с использованием флуоресцентного зонда тиофлавина Т. Термин амилоидоз обозначает группу заболеваний, вызванных неправильно свернутыми белками, которые накапливаются в определенных тканях и органах и приводят к нарушению их нормальных функций. Амилоидоз сопутствуют не только диабету второго рода, но и возникает в ряде других тяжелых заболеваний, таких как атеросклероз, болезнь Альцгеймера, Паркинсона и др. Неправильно свернутые белки могут терять свои нативные свойства и образовывать нерастворимые агрегаты, которые называются амилоидными фибриллами и характеризуются вторичной структурой, богатой ?-листами. Они могут достигать 10-20 нм в диаметре и нескольких микрометров в длину. В настоящее время существуют работы, в которых исследуются фибриллярные структуры в тканях и клетках in vivo. При этом наиболее часто применяемым методом является флуоресцентная микроскопия с использованием для визуализации агрегатов флуоресцентного зонда тиофлавина Т, который селективно встраивается в фибриллы. При встраивании квантовый выход флуоресценции тиофлавина Т резко возрастает, что связано с разностью геометрии молекулы в возбужденном состоянии в воде и в фибриллярных структурах. Несмотря на достаточное количество работ, посвященных исследованию структуры фибрилл в тканях, на данный момент не существует работ, в которых амилоидные фибриллы детектируются в плазме крови пациентов, что является актуальной задачей для медицинской физики. Известно, что, например, альбумин, основной белок плазмы крови, может образовывать фибриллоподобные структуры в результате гликирования, оксидативного стресса, а также в результате ряда процессов, приводящих к потери им нативной конформации. Таким образом, концентрация и характеристики фибриллярных структур могут служить неким маркером, характеризующим «поломку» белков (т.е. утрату ими нативной конформации, приводящую к образованию фибрилл). Прямое детектирование фибрилл в плазме крови флуоресцентным методом осложняется, однако, фоновым сигналом – так, зонд тиофлавин Т может встраиваться не только в фибриллы, но и в мономеры белков, и хотя константа комплексообразования в этом случае на несколько порядков ниже, в случае, если концентрация белка значительно превышает число фибрилл, полезный сигнал/фон для тиофлавина Т может быть крайне низким. Таким образом, необходима разработка метода селективного детектирования сигнала от тиофлавина Т, встроенного в фибриллы в плазме крови, учитывающего особенности их структуры и фотофизики. В проекте данная задача будет решаться с использованием методов время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии (будут анализироваться кинетика анизотропии флуоресценции, скорости переноса энергии в фибриллах и т.д.) и флуоресцентной корреляционной спектроскопии. Помимо этого, решение поставленной в проекте задачи подразумевает проведение ряда модельных экспериментов, а также применения различных вспомогательных методов для исследования изменения структуры и агрегатов белков (динамического светорассеяния, малоуглового рентгеновского рассеяния, спектроскопии кругового дихроизма и других). Таким образом, на основе результатов фундаментальных исследований в проекте будет проведена разработка методики оптического детектирования фибриллярных структур в плазме крови человека с помощью флуоресцентного зонда тиофлавина Т. Глобальной целью, которой можно достичь только при успешном решении поставленных в проекте задач, является установление взаимосвязи между патологическими процессами в организме и конформационными изменениями глобулярных белков плазмы крови, в том числе, с образованием ими фибриллярных структур.

На 2016 год были объявлены следующие цели Проекта: 1. Отработать технологический процесс фибрилляции разных белков, а именно, основного белка плазмы крови – альбумина, путем термической денатурации белка, а также при его гликирования. Помимо получения фибрилл из альбумина, предполагается провести отработку получения фибрилл из лизоцима и инсулина – белков плазмы крови, из которых наиболее просто получить исследуемые агрегаты. 2. Исследовать амилоидоподобных агрегатов белков методом стационарной флуоресцентной спектроскопии с помощью флуоресцентного зонда тиофлавина Т на модельных системах, а именно с использованием основного белка плазмы крови – альбумина. Определить параметры связывания тиофлавина Т в системах зонд-белок и зонд-фибриллы. Для проверки правильности значений параметров связывания (констант комплексообразования), полученных методом флуоресцентной спектроскопии, провести прямой метод определения данных параметров – равновесный диализ для тех же систем. 3. Исследовать кинетику образования фибриллярных структур в модельных образцах плазмы крови методом динамического светорассеяния. Исследовать изменения процентного содержания альфа-спиралей и бета-структур во вторичной структуре белков в процессе их фибрилляции методом кругового дихроизма. 4. Получить параметры связывания для системы зонд-белок методом время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии и сравнить эти данные с данными, полученными с помощью стационарной флуоресцентной спектроскопии. 5. Методом время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии провести исследование затухания флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с фибриллярными структурами, что позволит судить о взаимодействии флуорофора с его окружением: исследовать число, место локализации сайтов связывания зонда тиофлавина Т, а также расстояние между сайтами связывания при встраивании тиофлавина Т в фибриллы, полученными из основных белков плазмы крови. 6. Исследовать геометрию фибрилл и их сайтов связывания с использованием время-разрешенной спектроскопии. Для этого будет исследоваться процесс переноса энергии с триптофановых остатков основных белков плазмы крови на флуоресцентный зонд тиофлавин Т и между зондами тиофлавина Т, встроенными в одну фибриллу. 7. Разработать модель фотофизических процессов для системы фибрилла-тиофлавин Т с учетом переноса энергии между тиофлавинами Т, встроенными в одну фибриллу. 8. Методом стационарной флуоресцентной спектроскопии исследовать новую полосу флуоресценции (эмиссия 420 нм), которая характеризует формирование агрегатов, в том числе фибриллярных структур, в исследуемой системе. 9. Методом абсорбционной спектроскопии провести исследование спектров поглощения тиофлавина Т при его связывании с основными белками плазмы крови и с фибриллами, полученными из модельных растворов основных белков плазмы крови, что даст информацию о микроокружении зонда при его встраивании в разные системы; 10. Написать две статей в журналы из перечня ведущих периодических изданий.

Основные результаты, полученные в 2016-2017 году: - Был отработан процесс получения фибрилл из разных белков. В первую очередь, фибриллярные структуры были получены из таких белков, как инсулин и лизоцим Процесс получения агрегатов из данных белков широко описан в литературе [Nielsen, Morozova-Roche]: инсулин и лизоцим с концентрацией [ins]=[Lys]=0.5 мг/мл помещались в кислую среду, pH 2, ионная сила раствора поддерживалась хлоридом натрия, [NaCl]=0.1M, также в раствор был добавлен азид натрия, [NaN3]=0.1%, после чего образцы инкубировались при температуре T=62oC в течение длительного времени (в случае инсулина в течение одного дня, в случае лизоцима – 10 дней). Большая часть экспериментов проводилась с фибриллами, полученными из этих двух белков, т.к. процесс их детектирования с помощью флуоресцентной спектроскопии проще, чем процесс детектирования фибрилл, полученных из альбумина, поскольку в последнем случае образец представляет собой гелеобразную массу. Фибриллы из альбумина были сделаны следующим образом: белок с концентрацией [альбумин]=35 мг/мл помещались в кислую среду, pH 2, ионная сила раствора поддерживалась хлоридом натрия, [NaCl]=0.1M, также в раствор был добавлен азид натрия, [NaN3]=0.1%, после чего образцы инкубировались при температуре T=90oC в течение 7 дней. - Был исследован процесс связывания тиофлавина Т с альбумином и его агрегатами, а также с фибриллярными структурами для того, чтобы разработать метод, с помощью которого можно отделить по флуоресцентным характеристикам эти два процесса. Для этого методом стационарной флуориметрии была измерена константа связывания Ka: была исследована зависимость интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в максимуме при добавлении альбумина, которая потом аппроксимировалась квадратным уравнением, вытекающим из определения константы комплексообразования и связи полной концентрации молекул, лиганда, а также их свободных форм и концентрации комплекса. Из данного метода было получено, что Ka для системы альбумин-тиофлавин Т равна Ka=(5,1±0,3)∙103 1/M. Для верификации данного результата был использован метод диализа, который является основным методом по оценке процесса связывания низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений и позволяет количественно охарактеризовать долю связанных и свободных веществ. Константа связывания для системы альбумин-тиофлавин Т, полученная методом стационарной флуориметрии, совпала в пределах погрешности с Ka, полученной методом диализа. - Был исследован вопрос о локализации сайта связывания тиофлавина Т при его связывании с альбумином. Известно, что глобулярные белки содержат сильно скрученные бета-листы, состящие из менее чем четырех бета-цепей, поэтому такие сайты слишком малы для того, чтобы тиофлавин Т в них встроился [Goldschmidt]. Поэтому была выдвинута гипотеза, заключающаяся в том, что тиофлавин Т или неспецифицески связывается с самой белковой молекулой или встраивается в агрегаты белка. Для проверки данной гипотезы был проведен эксперимент по гель-фильтрационной хромографии, который показал, что флуоресцентный зонд встраивается в мономерные и димерные белковые фракции, причем константа связывания комплексообразования зонда с димерами (K1=2,8∙103 1/M) на порядок выше, чем Ka для системы мономеры+тиофлавин Т (K1=0,3∙103 1/M). -Методом время-разрешенной флуориметрии исследованы характеристики связывания для системы альбумин-тиофлавин Т. Время жизни тиофлавина Т при его связывании с альбумином описывалось трехэскпоненциальным законом затухания, при этом первое время жизни флуоресценции зонда описывало время жизни его свободной формы, а другие два времени соответствовали наличию двух сайтов связывания зонда с разными микроокружениями, что находится в согласовании с экспериментом, проведенным с помощью метода гель-фильтрационной хромотографии. При этом значение Ka, полученное данным методом, находилось в согласовании с значением данной константы, полученной методом стационарной флуориметрии. -Проведена численная оценка чувствительности флуоресцентного зонда тиофлавина Т в системе белок-фибриллы таким образом, чтобы для рассматриваемой системы было возможно различать флуоресцентый вклад тиофлавина Т, встроенного в фибриллы, от тиофлавина, образующего комплекс с альбумином. Данная оценка была сделана на основании информации, полученной из экспериментов по определению характеристик связывания тиофлавин Т+альбумин, а также используя литературные данные для константы связывания в системе тиофлавин Т+фибриллы. Для выполнения поставленной подзадачи, записывались уравнения для двух конкурирующих процессов, одновременно происходящих в системе: образование комплекса белок+тиофлавин Т и фибриллы+тиофлавин Т, при этом рассматривалась модель 1:1, т.е. что на одну молекулу фибриллы приходится один сайт связывания с тиофлавином Т, и на одну молекулу белка приходится один сайт связывания с тиофлавином Т. Вводился параметр α, который был равен отношению полной концентрации фибриллярных структур к полной концентрации альбумина в растворе. Варьируя данный параметр, строилась зависимость интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в рассматриваемой системе от полной концентрации альбумина, из которой было получено, что различать флуоресцентный вклад тиофлавина Т, встроенного в фибриллы от тиофлавина Т, образующего комплекс с альбумином, можно только при соотношениях полной концентрации фибрилл к полной концентрации альбумина в растворе α>4·〖10〗^(-4).. -Исследованы спектры поглощения тиофлавина Т при его связывании с основными белками плазмы крови и с фибриллами, полученными из модельных растворов основных белков плазмы крови методом абсорбционной спектроскопии. При исследовании связывания тиофлавина Т с альбумином, изучалось изменение спектров поглощения флуоресцентного зонда по мере увеличения концентрации белка в растворе. Было обнаружено, что при увеличении концентрации белка, максимумы спектров поглощения смещались в длинноволновую область примерно на 3 нм, что можно объяснить увеличением вязкости микроокружения красителя и его встраивании в агрегаты белка. При исследовании спектров поглощения для системы фибриллы+тиофлавин Т, было обнаружено, что по мере нагрева нативного белка и перехода его в фибриллярную форму, наблюдался сдвиг спектра в длинноволновую область на 38 нм, что свидетельствовало о сильном увеличении вязкости микроокружения и, как следствие, его встраивании в фибриллы. Такой сдвиг (с длины волны 412 нм на длину волны 450 нм) в спектре поглощения зонда может использоваться как один из индикаторов образовании фибриллярных структур в исследуемом растворе. - Методами стационарной и время-разрешенной флуориметрии исследованы разные стадии формирования фибрилл, что было изучено как с помощью собственной флуоресценции фибрилл, так и с помощью флуоресцентных зондов. В качестве одного из индикатора использовался тиофлавин Т, флуоресцентные свойства которого исследовались по мере его встраивания в фибриллы, полученные как из лизоцима, так и из инсулина, по собственной и время-разрешенной флуориметрии. Для обоих белков было получено, что среднее время жизни флуоресценции тиофлавина Т выходит на плато быстрее, чем максимум интенсивности флуоресценции зонда при инкубировании белков при высокой температуре. Было выдвинуто предположение о том, что среднее время жизни флуоресценции тиофлавина Т является более чувствительным индикатором для оценки процесса фибриллизации и характеризует процесс образования префибрилл, по сравнению с характеристиками зонда, полученными методом стационарной флуориметрии, которые свидетельствуют о формировании зрелых фибрилл. В качестве другого индикатора формирования фибрилл рассматривалось изменение собственной флуоресценции лизоцима и инсулина, а именно, изменение интенсивности флуоресценции триптофана и тирозина, соответственно (основных флуорофоров в исследуемых белках), а также процесс переноса энергии с триптофановых остатков основных белков плазмы крови на флуоресцентный зонд тиофлавин Т. Для раствора инсулина как в случае чистого белкового раствора, так и в системе инсулин-тиофлавин Т, интенсивность флуоресценции тирозина падала в процессе инкубации белка при высокой температуре, что можно объяснить разупорядочиванием нативного состояния белка, что приводило к увеличению тушения интенсивности флуоресценции остатков тирозина молекулами воды. Более выраженный процесс уменьшение интенсивности флуоресценции тирозина наблюдался в системе инсулин-тиофлавин Т, что можно объяснить процессом переноса энергии с тирозина на тиофлавин Т, который встраивается в непосредственной близости остатков тирозина в процессе формирования фибрилл из инсулина. Резкое уменьшение собственной интенсивности флуоресценции инсулина происходило в системе инсулин-тиофлавин Т одновременно с процессом выхода на плато среднего времени жизни флуоресценции тиофлавина Т, что может говорит о том, что собственная флуоресценция белка может быть рассмотрена в качестве индикатора ранней стадии формирования агрегатов, а именно, префибрилл. Аналогичные результаты были получены для белка лизоцим. - Методом стационарной флуоресцентной спектроскопии была исследована природа новой полосы флуоресценции (длина волны возбуждения λ = 350 нм, длина волны флуоресценции λ = 420 нм), которая, согласно литературным данным, характеризует формирование агрегатов, в том числе фибриллярных структур. Если в начальном растворе белка инсулина данная полоса отсутствует, то при инкубации белка при низком pH и высокой температуре, она начинает расти практически сразу, при этом ее интенсивность возрастает на порядок после того, как формируются фибриллы. Выдвинуто предположение о том, что данная полоса отвечает, во-первых, процессу пи-стэкинга (т.е. взаимодействию ароматических колец), который является ключевым для формирования фибрилл [Gazit 2002]. Подтверждением данной гипотезы служит тот факт, что интенсивность данной полосы начинает расти практически сразу, т.е. когда начинают происходить конформационные изменения белка, а не в момент образования префибрилл в растроре, т.е. когда образуются начальные агрегаты в растворе. Кроме того, для проверки данной гипотезы были проведены эксперименты с образованием фибрилл из отдельных аминокислот (фенилаланина) и пептидов (дипептиды фенилаланина), в которых процесс агрегации происходит благодаря исключительно взаимодействию ароматических колец [Adler-Abramovich 2012]. Было показано, что для этих систем процесс роста данной полосы является аналогичным процессу роста новой полосы для раствора инсулина. Кроме того, было сделано предположение о том, что рост новой флуоресцентной полосы в растворе инсулина отвечает процессу окисления белка при формировании агрегатов. Для подтверждения данного предположения из образца с инсулином убирался кислород путем пропускания через исследуемый раствор азота. После чего этот образец инкубировался при высокой температуре. Было обнаружено, что рост новой полосы происходит гораздо менее интенсивно в образце, лишенным кислорода, что говорит о том, что окисление самого белка при его агрегации сильно влияет на изменение интенсивности данной полосы. - Написано 2 статьи в зарубежных журналах из перечня ВАК с импакт фактором выше 4.