Разработка био-оптических индикаторов эффективности белок-опосредованной адресной доставки антиоксидантовНИР

Development of the bio-optical indicators of the effectiveness of protein-mediated delivery of antioxidants

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Разработка био-оптических индикаторов эффективности белок-опосредованной адресной доставки антиоксидантов
Результаты этапа: По результатам исследований, проведенных на 1 этапе проекта, было опубликовано две статьи в высокорейтинговых научных журналах: 1) Semenov A.N., Gvozdev D.A., Parshina E. Yu. et al // Membranes (IF 4.562, Q1) 2022, 12(10), 905; doi: 10.3390/membranes12100905 2) Semenov A.N., Gvozdev D.A., Parshina E. Yu. et al. Probing red blood cells membrane microviscosity using fluorescence anisotropy decay curves of the lipophilic dye PKH26 // International Journal of Molecular Sciences (IF 5.542, Q1) 2022, 23(24), 15767; doi: 10.3390/ijms232415767 По результатам исследований, проведенных на 1 этапе проета, было сделано два доклада на международных конференциях: 1) Raman and fluorescence lifetime imaging of cellular carotenoids distribution in algae (Устный доклад) Авторы: Semenov A.N., Protasova E.A., Parshina E.Yu, Chekanov K.A., Fedorenko T.A., Ahaev D.N., Lobakova E.S., Maksimov E.G. Мероприятие: 20th International Conference Laser Optics (ICLO 2022), г. Санкт-Петербург, Россия, 20-24 июня 2022 2) Protein-mediated carotenoid delivery into liposomes affects local microviscosity of the membrane as revealed by fluorescence anisotropy (Устный доклад) Авторы: Semenov A.N., Gvozdev D.A., Khashimova A.R., Parshina E.Y., Zlenko D.V., Baizhumanov A.A., Lotosh N.Y., Selishcheva A.A., Sluchanko N.N., Maksimov E.G. Мероприятие: Международная конференция Advanced Laser Technologies (ALT 22), г. Москва, Россия, 11-16 сентября 2022 Тезисы докладов были опубликованы в соответствующих сборниках трудов конференций. Краткое описание полученных научных результатов. В результате проведенных исследований в течение первого года выполнения проекта были измерены значения микровязкости мембраны двух типов липосом: (1) липосомы из липоида соевого лецитина S75; (2) липосомы из яичного лецитина. Мембраны соответствующих липосом различаются по своему составу фосфолипидов и соответственно обладают различной микровязкостью. Согласно полученным данным, мембрана липосом из яичного лецитина обладает более высокой микровязкостью по сравнению с мембраной липосом из соевого лецитина S75. При этом эффективность встраивания каротиноидов зависит от вязкоупругих свойств мембраны и происходит тем менее эффективнее, чем выше микровязкость мембранного бислоя. Были отработаны методики прямой нагрузки липосом S75 каротиноидами непосредственно в процессе синтеза липосом. Так, в мембрану липосом S75 были инкорпорированы бета-каротин, астаксантин, моноэфиры астаксантина и диэфира астаксантина. С помощью метода динамического светорассеяния показано, что нагрузка липосом каротиноидами дозозависимо увеличивает средний диаметр липосом и повышает дисперсность получаемой наноэмульсии. Были апробированы методики покраски мембран липосом флуоресцентным зондом TM-BODIPY. Были измерены кинетики затухания флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране различного типа липосом в зависимости от концентрации каротиноидов в липидной фазе. Показано, что при увеличении концентрации каротиноида в мембране наблюдаются значительные изменения в кинетике затухания флуоресценции зонда: с увеличением концентрации каротиноида наблюдается уменьшение среднего времени жизни флуоресценции зонда. Это свидетельствует о доставке каротиноида в мембрану, поскольку механизмом в основе наблюдаемых изменений служит диполь-дипольное взаимодействие в рамках переноса энергии по Ферстеру (FRET) при сближении донора (зонд TM-BODIPY) и акцептора (каротиноид) в мембране на близкие расстояния. Сравнивая изменения среднего времени жизни флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране липосом в зависимости от концентрации эхиненона (ECN), который был доставлен в мембрану с помощью каротиноидного белка AnaCTDH, и в зависимости от концентрации бета-каротина, который был встроен в мембрану непосредственно в процессе синтеза липосом, показано, что оба способа доставки сопоставимы друг с другом в плане эффективности. Учитывая, что прямая инкорпорация каротиноида в мембрану является достаточно трудоемким процессом так как требует наличия органических растворителей, белок-опосредованная доставка каротиноидов в мембрану липосом является предпочтительным механизмом поскольку реализуется в водной среде путем добавления комплекса «белок-каротиноид» в водный раствор уже готовых липосом. Впервые были проведены in silico расчеты локализации различных каротиноидов в билипидной мембране с применением методов молекулярной динамики. Из анализа траектории движения центра масс каротиноидной молекулы внутри билипидного слоя были получены данные о наиболее вероятно реализуемом положении (распределении) эхиненона и бета-каротина в мембране. Показано, что локализация молекул неполярного бета- каротина в мембране характеризуется бимодальным распределением, то есть бета-каротин способен занимать два различных положения в мембране. Одно положение было реализовано в ходе моделирования в прибл. 10% случаев и предполагает локализацию бета-каротина внутри мембраны под углом 40-43 градуса к нормали к поверхности мембраны. Однако значительно более вероятным является второе положение, при котором бета-каротин локализован практически параллельно мембране вблизи ее внутренней поверхности. Такая локализация была обнаружена в подавляющем количестве случаев при моделировании. При таком расположении бета-каротин взаимодействует с большим количеством фосфолипидов мембраны и тем самым ограничивает их свободную диффузию, приводя к росту локальной микровязкости. Это полностью подтверждается в эксперименте: прямая нагрузка бета-каротином липосом из соевого лецитина S75, согласно измерениям анизотропии флуоресценции TM-BODIPY в липосомальной мембране, кратно увеличивало микровязкость мембран липосом (при 18 ◦С инкорпорация мембраны бета-каротином повышает η до 85±5 сП против 20±3 сП в контроле). В то же время, распределение полярного эхиненона в мембране отличается от бета-каротина и характеризуется одномодальным распределением, которое описывает наиболее вероятное расположение эхиненона внутри липидного ядра мембраны вблизи внутренней поверхности под углом 20-30 градусов к нормали к поверхности мембраны. При таком расположении эхиненон также взаимодействует с фосфолипидами мембраны, однако со значительно меньшим их числом, тем самым в меньшей степени воздействуя на локальные вязкоупругие свойства. Это полностью подтверждается в эксперименте по измерению анизотропии флуоресценции TM-BODIPY в мембране липосом S75 при различной концентрации комплекса эхиненона (ECN) с каротиноидным белком-переносчиком AnaCTDH. Видно, что добавление AnaCTDH-ECN в раствор липосом увеличивало микровязкость липосомальной мембраны (при 20 ◦С при концентрации [AnaCTDH-ECN]=1440 нМ микровязкость η увеличилась до 31±2 сП против 20±3 сП в контроле), но на меньшую величину по сравнению с бета-каротином. С физиологической точки зрения использование эхиненона предпочтительней, поскольку он не приводит к значительным изменениям вязкоупругих свойств мембраны и в меньшей степени затрагивает текучесть мембранных фосфолипидов при сохранении своих антиоксидантных свойств. Таким образом, микровязкость является чувствительным оптическим параметром оценки и диагностики встраивания и локализации каротиноидной молекулы в мембране. Анализ характерных изменений в кинетике затухания флуоресценции зонда TM-BODIPY в мембране с увеличением концентрации каротиноидов позволил в рамках модели переноса энергии по FRET-механизму впервые описать транспорт каротиноидов в мембранном бислое в процессе доставки. Полученные экспериментальные данные флуоресцентных измерений были дополнены численным моделированием с помощью методов молекулярной динамики локализации каротиноидов (бета-каротина и эхиненона) в мембране, в результате чего были оценены средние расстояния между каротиноидами и флуоресцентного зонда при встраивании каротиноида в мембрану. Так, было рассчитано среднее расстояние между флуоресцентным зондом и бета-каротином (54 ангстрем) и между зондом и эхиненоном (68 ангстрем). Были проведены in vitro исследования на уровне живых клеток молекулярных процессов, связанных с процессами транспорта и доставки каротиноидов. С помощью анализа больших массивов спектрометрических данных микроскопии комбинационного рассеяния (КР) была впервые оценена гетерогенность распределения каротиноидов внутри клеток зеленой и красной форм микроводорослей Bracteacoccus aggregatus. Было проведено картирование каротиноид- содержащих клеток по параметрам специфических «finger-print» полос каротиноидов в КР-спектре, а именно по показателю полной ширины на полувысоте полосы 1160 см-1 (FWHM1160) и полосы 1520 см-1 (FWHM1520). С помощью этих параметров характеризуется гетерогенность распределения каротиноидов по возможным изомерным вариациям, которые может принимать каротиноидная молекула. Показано, что карты клеток микроводорослей Bracteacoccus aggregatus в вегетативной («культивационной») зеленой форме, характеризуемых набором первичных каротиноидов среди которых преобладают каротины, имеют сильно гетерогенный профиль по параметрам полос FWHM1160 и FWHM1520 и имеют выраженную структурированность, указывая на то, что содержащиеся в них первичные каротиноиды распределены во всем внутриклеточном пространстве в различных изомерных состояниях. При этом статистическое распределение значений FWHM1160 и FWHM1520 имеет широкий профиль, что естественным образом связано с большим количеством возможных изомерных форм каротиноидов. Данное обстоятельство обусловлено наличием у клеток в зеленой форме сильно развитого фотосинтетического аппарата, с которым связаны первичные каротиноиды. В т.н. «индуктивную» красную форму клетки Bracteacoccus aggregatus переходят при ухудшении внешних условий обитания, в частности, при повышенной освещенности. У клеток в красной форме редуцируется фотосинтетический аппарат, а большую часть внутриклеточного пространства заполняет липидное тело с синтезируемыми вторичными каротиноидами, среди которых доминируют астаксантины, выступающие в роли основных антиоксидантных агентов. Эти особенности клеточной физиологии находят свое отображение в картировании красных форм Bracteacoccus aggregatus по параметрам FWHM1160 и FWHM1520. Красные клетки являются более гомогенными, а весь клеточный профиль имеет две характерные области: центральная область внутри клетки и область на периферии вблизи клеточной стенки. Соответствующие карты красных клеток указывают на то, что вторичные каротиноиды в центральной части клетки находятся в одной изомерной форме, в то время как вторичные каротиноиды вблизи клеточной стенки и в ней самой находятся в другой изомерной форме. Соответственно статистическое распределение значений FWHM1160 и FWHM1520 по всей красной клетке имеет узкий профиль, а среднее значение FWHM1160 и FWHM1520 смещено в область более широких полос. Методика время-разрешенного измерения анизотропии флуоресценции зонда, находящегося в мембране, была апробирована для оценки микровязкости мембран живых клеток. Так с помощью время-разрешенной анизотропии флуоресценции витального зонда PKH26 была впервые измерена температурная зависимость микровязкости мембран эритроцитов. Кинетика анизотропии PKH26 в мембране эритроцитов имела сложный бифазный профиль, который отражал ротационные вращения двух различных фракций молекул зонда. К первой фракции относятся молекулы PKH26, которые не связаны с мембраной и свободно вращаются в буферном растворе, и корреляционное время вращения θ1 таких молекул мало. Вторая фракция состоит из молекул PKH26, заякоренных в мембране клеток. Характерное корреляционное время θ2 ротационной диффузии таких молекул много больше, поскольку они находятся в связанном с мембраной клетки состоянии. Подобные кинетики анизотропии с мультикорреляционными временами были аппроксимированы с помощью функции ассоциативного (связанного) затухания, что позволило определить корреляционное время θ2 связанной с мембраной фракции молекул зонда и определить таким образом микровязкость мембран эритроцитов, которая составила 97.7±29.3 сП при температуре 36 ◦С. В дальнейшем, микровязкость мембран эритроцитов может быть использована в качестве параметра состояния мембраны и тем самым рассмотрена в качестве оптического индикатора эффективности доставки каротиноида в мембрану клеток крови.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Разработка био-оптических индикаторов эффективности белок-опосредованной адресной доставки антиоксидантов
Результаты этапа: Исследования, проводимые в ходе 2 этапа Проекта, были направлены на апробацию на уровне биологических объектов (мембраны живых клеток) ряда фотофизических параметров, таких как корреляционное время анизотропии мембранного флуоресцентного красителя θ и определяемая с его помощью микровязкость мембраны η, среднее время жизни флуоресценции красителя в мембране τср, а также спектральные сигнатуры каротиноидов в спектре комбинационного рассеяния (КР) каротиноид-содержащих объектов, в качестве био-оптических индикаторов оценки эффективности доставки антиоксидантов. Экспериментальные серии с применением оптических методик последовательно проводились на объектах с постепенным усложнением устройства мембраны в целях верификации описанных выше параметров. Получено, что в системе липосом с выраженной гетерогенностью липидной среды, реализованной путем модификации фосфолипидов полиэтиленгликолем, мембранная вязкость η увеличивается при встраивании β-каротина. Результат был получен в двух типах наноразмерных липосом. В липосомах из фосфолипида DPPE-ПЭГ5000 добавление каротиноида увеличивало мембранную микровязкость на 5-15% в зависимости от температуры (например, при 24 oC встраивание β- каротина обеспечило θ = 1.4±0.4 нс (η~425 сПа) против θ = 1.14±0.28 нс (375 сПа) в интактных липосомах без каротиноида). Аналогичные результаты, пусть и с меньшим (4-7 %) эффектом, были получены в системе липосом DSPE- ПЭГ2000. Таким образом, параметр мембранной микровязкости η, определяемый в ходе время-разрешенного измерения анизотропии флуоресценции мембранного красителя, является параметром, чувствительным к встраиванию каротиноида в мембранный бислой даже в условиях выраженной гетерогенности. В этой связи, имеется потенциал использования этого параметра для оценки эффективности доставки каротиноидов в мембрану еще более сложных и гетерогенных объектов, к которым относятся живые клетки. В качестве начального модельного клеточного объекта были использованы эритроциты капиллярной крови человека. Перед проведением время-разрешенных флуоресцентных измерений микровязкости мембран эритроцитов были разработаны методики витальной покраски клеток неспецифическими липофильными красителями NileRed и двух красителей на основе BODIPY (TM-BDP и BDP630/650 X NHS-эфир (BDP630)). Разработанные методики учитывают стандартные рекомендации при проведении витального окрашивания клеток, а также ряд особенностей эритроцитов, в частности, необходимость отмывки эритроцитов в фосфатном буфере от белковых компонентов плазмы крови и необходимость соблюдения температуры 37 oC при инкубации в присутствии красителя. Для каждого красителя были получены флуоресцентные изображения окрашенных эритроцитов, а также были измерены концентрационные зависимости среднего времени жизни τср флуоресценции красителя в эритроцитарной мембране для определения оптимального значения концентрации. В случае эритроцитов, оптимальные значения концентрации указанных красителей располагаются в диапазоне 500 нМ – 1 μМ, что позволяет обеспечить приемлемое соотношение сигнал\шум и избежать артефактов при использовании больших значений концентрации красителя, таких как цитотоксичность и возможные homoFRET проявления. Разработанные методики были использованы для время-разрешенного измерения микровязкости мембраны эритроцитов при осуществлении встраивания каротиноида зеаксантина с помощью каротиноидного белка AstaP (комплекс ΔNC-AstaP-ZEA). Показано, что при добавлении ΔNC-AstaP-ZEA в концентрации 0.2 мг\мл (по белку) наблюдается замедление кинетики анизотропии флуоресценции красителя в мембране, что свидетельствует об увеличении мембранной микровязкости вследствие встраивания зеаксантина в мембранный бислой эритроцитов. Для более детального исследования эффективности этого процесса были проведены эксперименты по время-разрешенной визуализации (FLIM) эритроцитов, покрашенных мембранным красителем BDP630 (концентрация 1 μМ), до и после добавления каротиноидного белкового комплекса ΔNC-AstaP-ZEA (концентрация 0.2 мг\мл). Обнаружено, что добавление каротиноидного белка приводит к уменьшению среднего времени жизни красителя с 1.87 нс (контроль) до 1.35 нс, при этом в диаграмме статистических распределений τср возникают компоненты с коротким временем жизни флуоресценции. Дополнительный анализ FLIM-изображений покрашенных эритроцитов до и после добавления каротиноидного белка указывает, что наблюдаемые результаты есть следствие миграции энергии от молекулы красителя BDP630, находящейся в мембране и выступающей в качестве донора, на доставленный в мембрану каротиноид зеаксантин, который выступает в качестве акцептора. Дополнительные численные расчеты показывают, что при данных концентрациях красителя и каротиноидного белка эффективность переноса энергии составляет 30%, а среднее расстояние между BDP630 и зеаксантином в составе пары донор-акцептор в эритроцитарной мембране составило ~90 Å. Таким образом, были получены данные, подтверждающие факт доставки каротиноида зеаксантина в мембрану с помощью белок-опосредованных механизмов и адекватность полученных изменений мембранной микровязкости η, зафиксированных в ходе время-разрешенных измерений анизотропии флуоресценции. Дальнейшие шаги были направлены на проведение экспериментов по оценке следующих аспектов белок- опосредованной доставки каротиноидов, а именно обеспечение антиоксидантой защиты. Для этого была исследована линия клеток пигментного эпителия сетчатки взрослого человека ARPE-19, нагруженная липофусциновыми гранулами в качестве источника оксидативного стресса. Известно, что липофусциновые гранулы способны генерировать активные формы кислорода и другие радикалы под действием света, тем самым вызывая сильный цитотоксический эффект. Отсутствие должного контроля состояния липофусциновых гранул в клетках пигментного эпителия может значительно ухудшить протекание болезни и в некоторых случаях, в частности, при возрастной макулярной дегенерации, привести к полной потери зрения. Возможным видом терапии глазных патологий, связанных с накоплением липофусциновых гранул, является направленная доставка в клетки сетчатки и пигментного глазного эпителия антиоксидантов на основе каротиноидов. В ходе Проекта были проведены время-разрешенные FLIM-исследования клеток ARPE-19 с липофусцином, фотоокисление которых было проведено путем освещения клеточной культуры белым светом диодных ламп, в присутствии и в отсутствие холо-формы каротиноидного белка BmCBP в комплексе с зеаксантином (комплекс BmCBP-ZEA) в концентрации 200 нМ. Детальный анализ полученных усредненных кинетик затухания флуоресценции липофусцина и диаграмм распределений средних времен жизни показал, что, во-первых, само присутствие BmCBP- ZEA без фотоокисления уже приводит к уменьшению времени жизни флуоресценции липофусцина (контроль без облучения, 272±12 пс в пробах с белком (BmCBP+) против 333±35 пс в пробах без белка (BmCBP-)). Во-вторых, обнаружен заметный эффект сдерживания роста времени жизни флуоресценции липофусцина под действием фотоокисления (облучение, 338±23 пс в пробах с белком (BmCBP+) против 440±50 пс в пробах без белка (BmCBP-)). На заключительном этапе работ на 2 году Проекта был апробирован оптический параметр оценки гетерогенности распределений каротиноидов в различных формах каротиноид-продуцирующих объектов (клеток водорослей Bracteacoccus aggregatus), основывающийся на соотношении интенсивностей полос-сигнатур (1520 см-1 и 1156 см-1) каротиноидов в КР спектре (параметр I1520/I1156). Значения I1520/I1156, посчитанные для КР-спектра в каждом пикселе изображения, позволяют восстановить карты клеточных объектов в масштабе величины I1520/I1156. Гетерогенность структур на полученных картах клеток позволяет анализировать особенности перераспределения каротиноидов первичного и вторичного наборов в процессе перехода клеток водорослей из вегетативной формы в индуктивную. Так, карты вегетативной (зеленой) формы водорослей Bracteacoccus aggregatus характеризуются широким распределением значений параметра I1520/I1156 со средним значением 1.32±0.01. По мере трансформации в индуктивные оранжевые и красные формы под действием внешних стрессовых условий, соответствующие карты клеток изменяются, и структура этих карт принимает значительно более гомогенный характер. Среднее значение параметра I1520/I1156 при этом смещается в область больших значений: 1.41±0.02 для оранжевой формы и 1.44±0.01 для красной формы. Наблюдаемые изменения связаны с двумя параллельными процессами, происходящими в клетках под действием внешнего стресса: редуцирование фотосинтетического аппарата и синтез вторичных каротиноидных продуктов. Поскольку зеленая, оранжевая и красная формы характеризуются различным набором каротиноидов, параметр I1520/I1156 играет важную роль с точки зрения биотехнологии производства каротиноидов, так как различные потребительские запросы от косметологии и медицины до пищевой промышленности требуют наработки каротиноидов самого разного типа. По результатам за 2 год подготовлено и опубликовано 2 статьи: 1) Semenov Alexey N., Maksimov Eugene G., Shirshin Evgeny A., Sluchanko Nikolai N., Feldman Tatiana B., Rubin Andrew B., Kirpichnikov Mikhail P., Ostrovsky Mikhail A. et al. Protein-Mediated Carotenoid Delivery Suppresses the Photoinducible Oxidation of Lipofuscin in Retinal Pigment Epithelial Cells // ANTIOXIDANTS (IF 7.0), vol. 12(2), 413, pp. 1-19 DOI: 10.3390/antiox12020413. 2) Gvozdev Daniil A., Semenov Alexey N., Tsoraev Georgy V., Maksimov Eugene G. The Role of the Photon Counting Loss Effect in Time-Resolved Measurements of Fluorescence Anisotropy // Photonics (IF 2.536), vol. 10 (6), 681, pp.1-11. DOI: 10.3390/photonics10060681. Результаты, полученные на 2 году Проекта, были доложены на Международной конференции Advanced Laser Technologies (ALT) – 2013, г. Самара, Россия, сентябрь 2023 г. (приглашенный доклад).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".