Исследование и моделирование взаимодействия маннозных рецепторов макрофагов (CD 206) с углеводсодержащими лигандами и оценка перспектив создания новых классов антибактериальных препаратов с таргетной доставкойНИР

Investigation and modelling of macrophage mannose receptors (CD206) interaction with carbohydrate-containing ligands and assessment of perspectives to create a new class of antibacterial drugs with targeted delivery

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Исследование и моделирование взаимодействия маннозных рецепторов макрофагов (CD 206) с углеводсодержащими лигандами и оценка перспектив создания новых классов антибактериальных препаратов с таргетной доставкой
Результаты этапа: 1. Разработана методика проведения молекулярной динамики (Amber20), дающая релевантные значения энергий комплексообразования рецептор – лиганд, и проведено компьютерное моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий CD206 (и конканавалина А в качестве модельного лектина). С использованием отработанной модели впервые изучалось комплексообразование домена маннозного рецептора CD206 с лигандами, нами рассчитаны 9 констант диссоциации комплексов, ранее не представленных в статьях. Показано, что ConA демонстрирует сходство с четвёртым доменом CD206 в закономерностях связывания углеводов, однако, выявлены и отличия. Лектин ConA высокоспецифичен к ядру триманнозида и его производным, а МР наиболее прочно связывает разветвлённые олигосахариды, состоящие из Man остатков, подобные поверхностным углеводам клеточной стенки микроорганизмов. Открывается возможность моделировать комплексообразование маннозного рецептора CD206 с олиго- и полимерными молекулами, модифицированными наиболее аффинными лигандами среди рассмотренных в данной работе, например, высокоманнозилированными циклодекстринами и хитозанами – перспективными носителями лекарств с функцией адресного нацеливания на маннозные рецепторы макрофагов. Моделирование проводилось с использованием пакета молекулярной динамики Amber20. Системы (комплексы рецепторов с лигандами) в водном растворе сначала были минимизированы с использованием 5000 шагов алгоритма наискорейшего спуска, с последующими 5000 шагами сопряженного градиентного алгоритма. Систему нагревали от 0 до 300 К в течение 0,1 нс по модели Ланжевена с использованием частоты столкновений 2,0 пс−1 и при периодических граничных условиях постоянного объема. Затем была проведена симуляция 100 пс с постоянным давлением 1 атм. Далее - уравновешивание системы в течение 100 пс и непосредственно МД (production). Для каждой модели выполнено три независимых цикла с поддержанием температуры на уровне 300 К термостатом Ланжевена. В случае тетрамера ConA проводилась МД 10 нс (cut-off 8Å, шаг 2 фс). Моделирование четвёртого домена МР CD206 проводили 50-250 нс (cut-off 8Å, шаг 2 фс). Увеличение длительности моделирования для маннозного рецептора обусловлено неточностью начальных координат, в некоторых случаях снижение шага до 0,5-1 фс предпринято во избежание технических ошибок. Все связи, содержащие атомы водорода, были ограничены алгоритмом SHAKE [49]. С использованием методов молекулярной динамики анализа впервые проведено компьютерное моделирование комплексообразования моно- и олигосахаридных лигандов с основным (четвёртым) углеводсвязывающим доменом маннозного рецептора CD206 (CRD4), а также с модельным рецептором конканавалином А (ConA). Значения энергий комплексообразования и соответственно констант диссоциации комплексов рецептор–лиганд были рассчитаны для 15 лигандов с двумя рецепторами ConA и CRD4 CD206. Из них ранее в литературе не представлены 1 для конканавалина А и 9 для маннозного рецептора. Достоверность полученных данных показана относительно экспериментальных данных из литературы. Коэффициенты корреляции свободных энергий для ConA и CRD4 CD206 по методу МД (анализ mmpbsa.py) соответственно равны 0,68 и 0,52, что можно считать хорошим результатом, учитывая количество изученных лигандов и новизну исследований МР. 2. Осуществлено применение искусственной нейросети для предсказания специфичности рецептор-лигандных взаимодействий. В данной работе с помощью искусственной нейросети Pafnucy проведено моделирование комплексообразования 15 углеводных лигандов, которые могут выступать в качестве адресной метки на молекуле для таргетирования макрофагов, с модельным тетрамером ConA и четвёртым доменом (вносящим наибольший вклад в углеводсвязывающую способность) маннозного рецептора CD206. Искусственные нейросети активно разрабатываются и развиваются, однако их применение в биологических системах пока не так широко. В данной работе продемонстрировано, что обученная на основе PDBbind2020 нейросеть наряду с молекулярной динамикой, является эффективным инструментом для изучения механизмов взаимодействия лиганд-рецептор. Нейросетевой анализ комплексов. С помощью НС Pafnucy анализировались все пространственные структуры комплексов рецептор-лиганд, полученные после проведения МД. В качестве входных файлов использовались структуры, усреднённые по 30 фреймам заключительной части траектории (ConA), а также единичные структуры из траектории, минимизированные с использованием 10000 шагов алгоритма наискорейшего спуска, с последующими 10000 шагами сопряженного градиентного алгоритма (CD206). С помощью prepare.py подготовлен набор из 30 комплексов (по 15 на рецептор). Использованы 2 конфигурации нейросети Pafnucy: 1) Исходная НС, обученная на основе PDBbind2016 [https://gitlab.com/cheminfIBB/pafnucy; http://www.pdbbind.org.cn/index.php]; 2) Нейросеть на основе п.1, с обучающим набором на основе PDBbind2020, включая 14107 комплексов в general set, 5109 – validation, 226 – core set. Подготовлена авторами настоящей статьи с использованием pdbbind_data.ipynb и скриптов split_dataset.py, training.py. Обучение проводилось с параметрами, установленными по умолчанию, кроме числа циклов (эпох) равного 25 (доп. граф. S1, доп. табл. S2). Ошибка проверки (validation error) снижается примерно до пятой эпохи, далее оптимизируется точность только для обучающей выборки. НС предсказывает значение Kd или Ki на основе анализа 19 характеристик атомов: тип атома (B, C, N, O, P, S, Se, галоген или металл (9 вариантов)), гибридизация и валентность (3 варианта), связи с тяжёлыми или гетероатомами, дополнительные параметры (гидрофобность, ароматичность, акцепторные/донорные свойства, входит в состав цикла), частичный заряд и принадлежность атома рецептору (-1) или лиганду (1). В ходе компьютерного моделирования нами рассчитаны константы диссоциации комплексов лиганд-ConA, коррелирующие с литературными данными. На основании рассчитанных с помощью молекулярной динамики и нейросетевого анализа констант диссоциации комплексов лиганд-рецептор и механизмов комплексообразования можно выявить следующие закономерности. По данным МД наиболее низкие значения констант диссоциации характерны для комплексов рецепторов с биантенными лигандами 9-11 и 15: Kd (ConA – (GlcNAc)2-triMan) = 2 мкМ, Kd (ConA – Fuc-α(1→3)-GlcNAc) = 3 мкМ. Аналогично домен маннозного рецептора образует наиболее прочные комплексы с лигандами 9-11 с Kd 1080, 780 и 480 мкМ соответственно. Рассчитаны методом молекулярной динамики свободные энергии комплексообразования, они коррелируют с экспериментальными данными (опубликованными для модельного ConA): коэффициент корреляции r = 0,68. Проведено обучение нейросети Pafnucy на основе набора комплексов лиганд–рецептор PDBbind2020, что позволило увеличить точность предсказаний энергий до r = 0,8 и 0,82 для рецепторов CD206 и ConA соответственно. Предложена модель нормирования значений энергий комплексообразования для вычисления релевантных значений ΔGbind, Kd. На основе разработанной методики определены значения констант диссоциации серии комплексов CD206 с 9 углеводными лигандами различной структуры, ранее не охарактеризованными. 3. С помощью обсуждаемых выше компьютерных методов определены параметры связывания домена маннозного рецептора CD206, его модели конканавалина А с маннозосодержащими лигандами: моно- и олигосахаридами, а также маннозилированными носителями (циклодекстринами и хитозанами). Обсуждена роль основных факторов, влияющих на аффинность взаимодействий лиганд–рецептор: количество и природа углеводных остатков, наличие Me-группы в O1-положении, тип гликозидной связи в диманнозе. Показано, что комплексообразование ConA и CD206 с лигандами энергетически обусловлено электростатическими взаимодействиями заряженных остатков (Asn, Asp, Arg) с атомами кислорода и водорода в углеводах; меньший вклад вносит гидрофобная и ван-дер-ваальсова составляющая. Рассмотрен возможный вариант дополнительной стабилизации комплексов за счёт CH-π стекинг-взаимодействий Tyr с плоскостью Man-остатка. Изучена роль ионов кальция и марганца в процессах связывания лигандов. На основании проделанной работы открываются перспективы применения компьютерного моделирования для разработки оптимальных носителей лекарств с функцией активного нацеливания на макрофаги, а также определяют границы применимости использования ConA в качестве релевантной модели для исследования параметров связывания CD206 с различными углеводными лигандами. Проведено сравнение закономерностей связывания углеводов CD206 и ConA. Пространственные структуры молекул рецептора ConA и 15 углеводных лигандов были построены с использованием кристаллографических данных PDB. Варьировали структуру и пространственную организацию лигандов 1-15: тип углеводных остатков, количество Man и GlcNAc остатков в углеводе (от 1 до 5), наличие Me-группы в O1 положении углеводов, тип гликозидной связи (α1→2, 1→3, 1→6). Рассмотрены 4 субъединицы белка по 237 аминокислотных остатков каждая, катионы Ca2+ и Mn2+ в сайтах связывания лигандов, кристаллографическая вода. Структура четвёртого углеводсвязывающего домена маннозного рецептора CD206 построена на основе кристаллографических данных PDB (Acc. No. 7JUF). Рецептор состоит из 135 аминокислотных остатков и катиона Ca2+. Для Ca2+ и Mn2+ использовали несвязанную модель 12-6-4 потенциала Леннарда-Джонса. Структуры лигандов к CD206 сгенерированы и подведены к сайту связывания вручную с применением средства визуализации PyMol (https://pymol.org/2/) (табл. 1). Структуры подготовлены с использованием tLeaP из AmberTools20, 21: добавлены недостающие атомы водорода, ионы Na+ для нейтрализации общего заряда комплекса. Система была сольватирована молекулами воды TIP3P [48] с минимальным расстоянием между границей ячейки и белком 10 Å. В среднем размер ячейки с тетрамером ConA составлял 90×95×90 Å3, с доменом CD206 60×65×60 Å3. Силовые поля Amber ff14SBonlysc, GLYCAM_06j-1 использовалось для описания взаимодействий атомов. Аффинность рецепторов к лигандам в зависимости от количества Man остатков. Углеводы, содержащие только одно маннопиранозильное кольцо – Man 1 и MeMan 2, не обладают высокой аффинностью к ConA – необходима кластеризация бóльшего количества концевых Man/GlcNAc остатков. Однако по данным калориметрического титрования гликопептиды Man7-9, которые моделируют олигосахариды клеточной стенки микроорганизмов, практически не превосходят в сродстве к ConA лиганд 11 (производное triMan), то есть существует оптимальное количество углеводных остатков, задействованных в связывании. Иными словами, модельный лектин ConA имеет наибольшее сродство к консервативному ядру триманнозида, следовательно, достигнут предел специфичности лиганд-рецептор. В случае CRD4 с увеличением количества доступных Man остатков по данным МД и НС сродство лигандов к МР растёт, однако, менее выражено. Что также следует из данных, полученных методом конкурентного связывания в работе: Man9 специфичнее MeMan более, чем на порядок, а триманнозид всего лишь в 3 раза, чем MeMan. Аффинность МР к маннозосодержащим лигандам возрастает, начиная от 1-2 остатков и вплоть до крупных олигосахаридов и полимеров (например, Man23, маннан). Влияние типа гликозидной связи в диманнозидах на сродство к рецептору. Рецептор ConA распознаёт диманнозиды 3-8 с аффинностью, возрастающей в ряду: α1→2 < α1→6 < Me-α1→6 < α1→3 << Me-α1→3 ≈ Me-α1→2, в котором приведены условные обозначения диманнозидов и их метилированных производных. Подтверждением сходства закономерностей связывания углеводов ConA и CD206 является близость относительных изменений констант диссоциаций комплексов (табл. 1), что обусловливает обоснованность использования модельного лектина для оптимизации экспериментов in vitro и in vivo в пользу изучения большего количества лигандов и апробации потенциальных носителей лекарств. Так, коэффициент корреляции между свободными энергиями комплексообразования для шести описанных в литературе комплексов лигандов (№2, 4, 6–7, 10, 14) с CD206 и ConA составляет 0,90. В ходе моделирования получены достаточно релевантные значения энергий с высокой взаимосвязью между комплексами обоих рецепторов: данные МД по комплексообразованию CRD4 коррелируют с таковыми для нейросетевого анализа ConA с коэффициентом R=0,91. Таким образом, ConA в закономерностях связывания моно- и олигосахаридов является хорошей моделью маннозного рецептора. Проведено моделирование комплексообразования маннозного рецептора CD206 с олиго- и полимерными молекулами, модифицированными наиболее аффинными лигандами среди рассмотренных в данной работе, например, высокоманнозилированными циклодекстринами и хитозанами – перспективными носителями лекарств с функцией адресного нацеливания на маннозные рецепторы макрофагов. В данной работе производные маннана и модифицированные полиэтилененимины (ПЭИ) рассматриваются в качестве перспективных носителей лекарственных средств для макрофагов – проведен скрининг связывания с конканавалином А и доменом маннозного рецептора CD206. Фрагменты олигоманнозида, используемые в работе, образуют прочные комплексы с рецепторами маннозы. В качестве метки средней аффинности была выбрана линейная манноза, а в качестве неспецифической углеводной модификации - линейная галактоза. Поэтому здесь мы представляем корреляции данных о сродстве модельного рецептора к системам доставки лекарств с данными молекулярной динамики и анализов нейросетью. 4. С помощью спектральных и флуоресцентных методов исследовано комплексообразование конканавалина А с маннозилированными циклодекстринами и хитозанами с варьируемыми параметрами. С применением комбинации методов ИК, ЯМР, УФ спектроскопии и флуоресценции показали, что синтетические конъюгаты (на основе хитозана, циклодекстринов и полиэтилениминов), богатые маннозой, высокоаффинны к модельному рецептору маннозы ConA: Kd ≈ 10-5 – 10-7 М по сравнению с природным лигандом триманнозидом (10-5 М). Показано, что наиболее сильно константа диссоциации комплекса ConA c хитозаном зависит от степени маннозилирования полимера, чем больше остатков Man в молекуле, тем прочнее комплекс с ConA, по-видимому, за счет высокой кластеризации Man. Включение спейсера (спермидина) между основной цепью полимера и Man остатками увеличивает аффинность связывания практически на порядок в сравнении с хитозанами без спейсера. Вероятно, использование GA и спермидина повышает доступность остатков Man для связывания с рецептором, минимизируя стерические затруднения. Исходя из эффективности связывания хитозанов относительно маннозы сравнили изученные конъюгаты. Так, наиболее эффективно задействующими Man остатки лигандами являются хитозаны 5 и 72 кДа со спермидиновыми спейсерами с высокой степенью маннозилирования (Chit5_GASpermidineMan и GlicChit72_GASpermidineMan). Для определения количественных характеристик «нацеленности на маннозные рецепторы» маннозилированных полимеров нами отработаны точные и воспроизводимые методики УФ- и флуоресцентного анализа рецептор-лигандных взаимодействий. Используемые методы позволяют снизить расход материалов на два порядка и существенно сократить время эксперимента по сравнению с общепринятыми методиками в этой области. Показано, что с увеличением молекулярной массы, степени модификации маннозой хитозанов, а также при внедрении спермидинового спейсера прочность комплексообразования с модельным маннозным рецептором макрофагов, ConA, повышается: Kd 10‒6‒10‒7 М, ‒ что почти на порядок ниже, чем для природного триманнозида (Kd = 2·10-6). Таким образом, открываются перспективы с помощью спектральных методов анализировать большой массив данных и выявлять лиганды, наиболее специфичные для ConA как модельного маннозного рецептора макрофагов, с целью дальнейшего их использования в качестве носителей для адресной доставки лекарственных средств.
2 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Исследование и моделирование взаимодействия маннозных рецепторов макрофагов (CD 206) с углеводсодержащими лигандами и оценка перспектив создания новых классов антибактериальных препаратов с таргетной доставкой
Результаты этапа: В ходе работ по Проекту был разработан спектральный подход для высокопроизводительного скрининга лектин-лигандных взаимодействий с использованием конканавалина А в качестве модельного рецептора маннозы в применении к молекулярным контейнерам на основе циклодекстринов, олигоаминов и маннозы для адресной доставки моксифлоксацина, левофлоксацина и других препаратов к альвеолярным макрофагам с целью повышения эффективности терапии различных заболеваний, с трудом поддающихся лечению , включая атипичную пневмонию ( с внутриклеточной локализацией патогена) и туберкулез. Варьируя структуру конъюгата от сетчатой, полимерной до звездообразной и разветвленной, мы адаптировали систему доставки к конкретным задачам: времени полувыделения препарата и эффективному действию. Введение маннозной метки позволили нам создать полимерные системы с функцией активного нацеливания только на активированные макрофаги, экспрессирующие рецептор маннозы CD206, что свело к минимуму побочные реакции и иммунный ответ. Синтезированы комплексы включения лекарств фторхинолонов в циклодекстрины и полимерные частицы, а также перспективные двойные и тройные комплексы с включением адъювантов, компонентов эфирных масел: эвгенол, апиол, терпеноиды и др. Конъюгаты продемонстрировали высокие показатели нагрузочной способности по лекарству и эффективности захвата. Таким образом, разработанные системы адресной доставки комбинированных лекарственных средств из-за их высокой специфичности к рецепторам маннозы макрофагов (показано на модели ConA), низкой иммуногенности, высокой лекарственной нагрузочной способности и пролонгированного высвобождения в тканях- мишенях окализись перспективными в медицинской биотехнологии и фармацевтике для создания новых лекарственных форм и стратегий лечения заболеваний дыхательных путей. При реализации Проекта основным направлением исследований являлась разработка лекарственных формуляций для лечения в перспективе сложных инфекционных заболеваний дыхательных путей (включая резистентный туберкулез и атипичнуюпневмонию) является разработка сложных комбинированных форм лекарственных средств на основе фторхинолонов. В данном Проекте рассматривались два направления решения проблемы бактериальной резистентности: адресная доставка фторхинолонов к макрофагам путем нацеливания на маннозные рецепторы CD206 и избирательное действие на бактерии (а в будущем и на раковые клетки) за счет увеличения проникновения лекарств за счет адъювантов и ингибирования оттока и, как следствие, накопления лекарств в зоне локализации патогенов. Во-первых, было показано, что олиго- и полимерные конъюгаты, т.е. маннан, привитый циклодекстринами, и маннозилированный полиэтиленимин, представляют собой молекулярные контейнеры высокой емкости, способные загружать 8-20% по весу терапевтического средства и доставлять его к маннозным рецепторам макрофагов, что показано на модельном белке ConA и клетках. Проточная цитометрия показала, что полимеры активно поглощаются макрофагами. Во-вторых, конфокальная микроскопия использовалась для изучения механизма действия адъюванта как средства, повышающего проницаемость мембраны, и ингибитора оттока вместе и по отдельности, а также молекулярного контейнера. Ингибирование эффлюкса рассмотрено нами как решающий шаг для преодоления множественной лекарственной устойчивости. Таким образом, проведенные исследования открывают новые возможности для воздействия на сложные инфекции, ассоциированные с макрофагами. Разработан подход, позволяющий значительно повысить эффективность терапии ряда инфекционных и других заболеваний, снизить дозировку антибиотиков, сократить продолжительность лечения и снизить риск развития бактериальной резистентности. Использование полимерного носителя с ковалентно связанными органическими молекулами различной структуры позволило избежать проблем, связанных с различной (неоптимальной) растворимостью и биораспределением вводимых молекул, что было бы почти неизбежно при использовании одних и тех же соединений по отдельности. Таким образом, в рамках Проекта выполнены экспериментальные, научно обоснованные методики адресной доставки лекарств к макрофагам для создания улучшенных лекарственных форм.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".