ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Использование наноконтейнеров для доставки биологически активных веществ (БАВ) является одной из ключевых стратегий современной биомедицины. Суть использования наноконтейнеров заключается в том, что БАВ с помощью химических реакций или за счёт физического диспергирования помещают в носитель, выполняющий ряд защитных и транспортных функций. В качестве наконтейнеров для хранения, доставки и контролируемого высвобождения биологически активных веществ часто используются мицеллы, полимеры, наночастицы, а также сферические бислойные везикулы- липосомы. Важными требованиями, предъявляемыми к современным наноконтейнерам, являются биосовместимость, биодеградируемость и возможность целевой доставки БАВ к клеткам-мишеням. В данной работе планируется использовать способность циклических олигосахаридов (карбоксиметилциклодекстринов) эффективно инкапсулировать во внутренней полости плохо растворимые в воде гидрофобные БАВ по принципу хозяин-гость. Также карбоксиметилциклодекстрины известны своей способностью образовывать комплексы с липидными мембранами с высокой константой связывания. Эта способность и будет использована для создания молекулярных ансамблей циклодекстринов на сферических липидных мембранах. Самосборка карбоксиметилциклодекстринов на липидных везикулах (липосомах) позволит сконцентрировать в небольшом объёме несколько сотен олигосахаридов, что повысит эффективность действия БАВ за счёт двух основных факторов: увеличение локальной концентрации и обеспечение возможности пассивной доставки за счёт регулирования размера липосом в пределах 50-150 нм. Использование карбоксиметилциклодекстринов даёт также дополнительную коллоидную стабилизацию наноконтейнера за счёт отрицательно заряженных групп. В добавок, наличие карбоксильных групп открывает возможности придания системе активного нацеливания за счёт химической модификации функциональных групп молекулами-векторами. Отдельно стоит отметить возможность использования липосом для включения в них индивидуальных гидрофильных соединений во внутреннюю полость или гидрофобных в область жирных хвостов. Это обеспечит возможность создания мультикомпонентного наноконтейнера, представляющего интерес для персонализированной медицины. При этом все компоненты такого комплексного наноконтейнера являются биосовместимыми и биодеградируемыми. Всё вышесказанное делает ансамбли карбоксициклодекстринов на малых липосомах эффективными наноконтейнерами для инкапсулирования и доставки гидрофобных БАВ.
The use of nanocontainers for the delivery of biologically active substances (BAS) is one of the key strategies of modern biomedicine. The essence of the use of nanocontainers is that biologically active substances, using chemical factors or due to physical dispersion, are placed in a carrier that performs a number of protective and transport functions. Micelles, polymers, nanoparticles, as well as spherical bilayer vesicles - liposomes are often used as containers for storage, delivery, and controlled release of biologically active substances (BAS). Biocompatibility, biodegradability, and the possibility of targeted delivery of biologically active substances to target cells are important requirements for modern nanocontainers. In this work, it is planned to use the ability of cyclic oligosaccharides (carboxymethylcyclodextrins) to effectively encapsulate poorly water-soluble hydrophobic BAS into the inner cavity according to the host-guest principle. Also carboxymethylcyclodextrins are known for their ability to form complexes with lipid membranes with a high binding constant. This ability will be used to create molecular ensembles of cyclodextrins on spherical lipid membranes. Self-assembly of carboxymethylcyclodextrins on lipid vesicles (liposomes) will allow concentrating several hundred oligosaccharides in a small volume, which will increase the effectiveness of biologically active substances due to two main factors: increasing the local concentration and ensuring the possibility of passive delivery by regulating the size of liposomes within 50-150 nm. The use of carboxymethylcyclodextrins also provides additional colloidal stabilization of the nanocontainer due to negatively charged groups. In addition, the presence of carboxyl groups opens up the possibility of imparting active targeting to the system due to the chemical modification of functional groups with vector molecules.Separately, it is worth noting the possibility of using liposomes to encapsulate individual hydrophilic compounds into the internal cavity or hydrophobic ones into the area of fat tails. This will provide an opportunity to create a multicomponent nanocontainer of interest for personalized medicine. Moreover, all components of such a complex nanocontainer are biocompatible and biodegradable. All of the above makes the ensembles of carboxycyclodextrins on small liposomes effective nanocontainers for the encapsulation and delivery of hydrophobic biologically active substances.
Ожидаемые результаты, которые будут получены в ходе выполнения проекта, продемонстрируют новые возможности получения высокоёмких по отношению к гидрофобным БАВ молекулярных ансамблей карбоксиметилциклодекстринов на малых липосомах. Отрицательный поверхностный заряд комплексов, сформированный за счёт карбоксильных групп обеспечит их агрегативную стабильность в биологических средах. Использование биосовместимых и биодеградируемых компонентов позволит обеспечить молекулярным ансамблям ферментативную деструкцию после выполнения целевой доставки БАВ. Будет получена информация о возможности использования липосомального носителя как дополнительного контейнера, обеспечивающего инкапсулирование различных гидрофильных соединений во внутреннюю полость липосом или гидрофобных в область жирных хвостов. Это расширяет область применения исследуемых молекулярных ансамблей, обеспечивая возможность создания мультикомпонентного наноконтейнера, представляющего интерес для персонализированной медицины. Варьирование липидного состава мембраны липосом, а также размера везикул позволит установить оптимальные составы для получения молекулярных ансамблей иммобилизованных на липосомах карбоксициклодекстринов. Полученные результаты позволят предложить способ создания новых высокоэффективных наноконтейнеров для доставки гидрофобных биологически активных соединений.
Научный коллектив обладает большим опытом в области исследования полимер-коллоидных систем. Исследовано взаимодействие полимеров различной архитектуры с бислойными везикулами (липосомами), сформированными из липидов и их смесей с поверхностно-активными веществами. Показано, что такое взаимодействие сопровождается существенными структурными перестройками и морфологическими изменениями в везикулярных мембранах: латеральной сегрегацией и трансмембранной миграцией липидов, встраиванием полимера в липосомальную мембрану, повышением проницаемости мембраны по отношению к низкомолекулярным веществам, а также агрегацией, слиянием или разрушением липосом. Изучена обратимость процессов комплексообразования и индуцированных полимером структурных перестроек в анионных липидных мембранах. Исследовано формирование молекулярных ансамблей циклодекстринов на макромолекулах полипропиленоксида. Изучено формирование супрамолекулярных структур циклодекстринов, а также возможности создания наноконтейнеров на их основе для доставки биологически активных соединений. Исследована возможность создания наноконтейнеров для доставки биологически активных соединений на основе липосом и их комплексов с полимерами, в том числе и полисахаридами. Сделана оценка цитотоксичности липосом и их комплексов с полимерами. Отработана методика оценки ферментативного гидролиза наноконтейнеров методом флуоресцентной спектроскопии. Получены предварительные данные по формированию комплексов карбоксиметилциклодекстринов на поверхности смешанных катионных липосом. Отработана методика и проведены исследования взаимодействия наноконтейнеров с модельными клеточными мембранами методом флуоресцентной микроскопии.
Будут соответствовать ожидаемым
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | нсамбли циклодекстринов на малых липосомах - высокоэффективные наноконтейнеры для доставки гидрофобных соединений |
Результаты этапа: Методом экструзии, а также методом ультразвуковой гомогенизации были получены серии катионных липосом из электронейтрального липида -диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ), и катионного липида - диолеоилтриметиламмоний хлорида (ДОТАП). Мольная доля катионного липида (v) варьировалась от 0 до 0.3. Размеры липосом варьировались о 60 до 180 нм. За взаимодействием анионных карбоксиметилциклодекстринов (КМЦД) и катионных липосом следили методом лазерного микроэлектрофореза. Параллельно методом динамического светорассеяния проводили измерение размеров частиц. Для электронейтральных липосом (v =0) добавление раствора КМЦД не приводило к изменению значений ЭФП, при этом изменения размера частиц также не фиксировалось. Добавление раствора КМЦД к 1 мг/мл суспензии положительно заряженных липосом с v =0.3 приводило к уменьшению значения ЭФП с +5.5 (мкм/с)/(В/см) до +2.4 (мкм/с)/(В/см) при концентрации КМЦД 1.25 мг/мл. Таким образом, можно сделать вывод об электростатической природе адсорбции КМЦД на поверхность катионных липосом. Следует отметить, что параллельное измерение размера частиц показало, что изменения размеров липосом не наблюдается вплоть до концентрации КМЦД 1 мг/мл- размер частиц в системе соответствовал диаметру исходных липосом 150 нм. Незначительное увеличение размера до 200 нм было зарегистрировано при концентрации КМЦД 1.25 мг/мл. При этом дальнейшее увеличение концентрации КМЦД приводило к резкой агрегации системы. В свою очередь, значения ЭФП практически не менялись. Дополнительная информация о характере взаимодействия КМЦД и катионных липосом в составе комплексов была получена методом кондуктометрии. Добавление раствора КМЦД к суспензии катионных липосом с v =0.3 привело к резкому увеличению (по отношению к контролю в системе без липосом) электропроводности системы в интервале концентраций КМЦД вплоть до 1.25 мг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации КМЦД приводило к росту электропроводности, соответствовавшему увеличению концентрации свободных молекул КМЦД. Из полученных данных был произведён расчёт состава насыщенного молекулами КМЦД комплекса КМЦД/липосома. Состав (N) определяли как число молекул КМЦД, приходящихся на одну молекулу ДОТАП. Для липосом с v= 0.3 N cоставляло 2.5. В то время как для липосом с v= 0.15 N равнялось 2. Такое незначительное отличие может быть объяснено, что фактором, лимитирующим адсорбцию КМЦД является геометрический параметр, а не электростатический. Анализ строения межфазного комплекса, а также его визуализация были осуществлены методом атомно-силовой микроскопии на планарных липидные бислоях на подложке. Было установлено, что высота структур, формируемых на бислое молекулами КМЦД составляет в среднем до 2.5 нм. Очевидно, что олигосахариды формируют ассоциаты на поверхности бислоя. Принимая во внимания, что высота молекулы бета-циклодекстрина составляет 0.78 нм, можно рассчитать, что количество слоёв КМЦД в ассоциате может составлять до четырёх. Для исследования возможности взаимодействия комплексов ДОТАП/ДОФХ липосомы/ КМЦД с клетками были использованы отрицательно заряженные модельные клеточные мембраны- двухмикронный латекс, покрытый липидным бислоем (ЛПБ). На первом этапе методом лазерного микроэлектрофореза была изучена адсорбция катионных ДОТАП/ДОФХ липосом на поверхность ЛПБ. С увеличением концентрации липосом в системе ЭФП частиц ЛПМ уменьшалось по модулю от изначального значения – 0.5 (мкм/с)/(В/см) до нулевого значения с последующей перезарядкой до значений ЭФП +3 (мкм/с)/В/см). Это свидетельствует о электростатической адсорбции катионных липосом на поверхность ЛПБ. Далее рассматривали комплекс КМЦД/липосомы, в котором количество КМЦД составляло 25% от необходимого для формирования насыщенного комплекса. При этом комплекс имел исходный высокий поверхностный заряд (ЭФП = +4 (мкм/с)/(В/см)). Добавление комплекса к суспензии ЛПБ также приводило к нейтрализации исходного анионного заряда ЛПБ с последующей перезарядкой поверхности. Однако, точка нейтрализации наблюдалась при больших концентрация комплекса по отношению к исходным липосомам в расчёте на концентрацию липидов. Также, максимальное значение ЭФП перезаряженного комплекса составляло + 1.8 (мкм/с)/(В/см). Полученные результаты позволяют утверждать, что десорбции КМЦД при адсорбции комплекса на ЛПБ не наблюдается и комплекс реагирует с биомиметической мембраной как единое целое. Визуализация адсорбции комплексов КМЦД/липосомы на биомиметические мембраны была осуществлена методом флуоресцентной микроскопии. С этой целью использовали биомиметические мембраны на основе пятимикронных микросфер, покрытых липидным бислоем, (МПБ). Для визуализации использовали ДОТАП/ДОФХ липосомы, меченные пиреном. Для суспензии МПБ в оптический канал были видны микросферы со средним диаметром 5 микрон, в то время как во флуоресцентном канале не наблюдалось сигналов. Затем к суспензии МПБ добавляли суспензию комплекса КМЦД/липосом и анализировали на микроскопе. На микрофотографии, полученном в оптическом канале видны отдельные частицы, соответствующие МПБ. На снимке этой же области в флуоресцентном режиме микроскопа видно наличие синего цвета на всей поверхности БСЛМ, отражающее присутствие меченных пиреном объектов, т.е. комплексов КМЦД/липосомы, адсорбированных на МПБ. Для молекул КМЦД были оценены возможности включения гидрофобных биологически активных молекул: фенолфталеина, куркумина, фолиевой кислоты и паклитаксела. Установлено, что благодаря наличию ароматических фрагментов у органических молекул формируются комплексы с КМЦД по принципу хозяин-гость эквимольного состава для всех исследованных молекул, кроме куркумина, для растворения которого в воде требуется 2 молекулы КМЦД. Было обнаружено, что на катионные липосомы адсорбция молекул КМЦД с включенными биологическими соединениями происходит с такой же закономерностью, как и для «пустых» КМЦД. Было установлено, что характер адсорбции КМЦД на поверхность катионных липосом не зависит от диаметра везикул. Устойчивость комплексов к КМЦД/липосомы к диссоциации в водно-солевых средах исследовали методами динамического светорассеяния, а также методом лазерного микроэлектрофореза. Было установлено, что и для липосом с v = 0.15, и для липосом с v = 0.3 при физиологическом значении ионной силы диссоциации комплексов не наблюдалось. Таким образом, исследуемые системы сохраняют стабильность в физиологических средах и представляют интерес для создания на их основе средств доставки биологически активных соединений. С помощью классического МТТ-теста была исследована цитотоксичность КМЦД, катионных липосом их комплексов на клетках карциномы молочной железы. Было установлено, что исследуемые объекты, как и комплекс КМЦД/липосомы не обладают цитотоксичностью вплоть до максимальных исследованных концентраций – 2мг/мл. При этом, включение в наноконтейнер КМЦД/липосомы антибиотика паклитаксела приводило к проявлению цитотоксичности при концетрации антибиотика в 5 раз меньшей, чем для аптечной формы, и в 4 раза меньше, чем для мицеллярной формы, полученной путём включения паклитаксела в катионные смешанные полилактидные мицеллы на основе полилактида, терминированного аминогруппой, и блок-сополимеров лактида и этиленоксида. Полученные результаты демонстрируют, что формирование ансамблей КМЦД на катионных липосомах позволяет добиться значительной концентрации гидрофобных биологически активных молекул за счёт их включения в полость КМЦД. При этом формирование таких наноконтейнеров обеспечивает высокий терапевтический (противораковый) эффект по сравнению с действующими антибиотиками. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | нсамбли циклодекстринов на малых липосомах - высокоэффективные наноконтейнеры для доставки гидрофобных соединений |
Результаты этапа: Методом экструзии, а также методом ультразвуковой гомогенизации были получены серии катионных липосом из электронейтрального липида -диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ), и катионного липида - диолеоилтриметиламмоний хлорида (ДОТАП). Мольная доля катионного липида (v) варьировалась от 0 до 0.3. Размер липосом контролировали при синтезе, используя мембраны экструдера с различным диаметром. Малые липосомы размером менее 80 нм получали при помощи ультразвукового гомогенизатора. За взаимодействием анионных карбоксиметилциклодекстринов (КМЦД) и катионных липосом следили методом лазерного микроэлектрофореза. Для этого к суспензии липосом порционно добавляли раствор циклодекстринов и регистрировали изменение электрофоретической подвижности (ЭФП) системы. Параллельно методом динамического светорассеяния проводили измерение размеров частиц. Добавление раствора КМЦД к 1 мг/мл суспензии положительно заряженных липосом с v =0.05 не приводило изменению ЭФП в системе в независимости от размера исходных липосом. Концентрация добавленных КМЦД варьировалась вплоть до 2 мг/мл – т.е. концентрации, превышающей необходимую для формирования насыщенных комплексов КМЦД/липосомы с v = 0.3. Измерение размеров частиц в системе методом динамического светорассеяния также показало отсутствие изменения размеров липосом при добавлении КМЦД. Увеличение доли катионного липида в мембране липосом до v = 0.1 также не привело к изменению значений ЭФП в системе при титровании суспензии липосом раствором КМЦД. Измерение размеров частиц в системе методом динамического светорассеяния также показало отсутствие изменения размеров липосом при добавлении КМЦД. Таким образом формирование комплексов КМЦД/ катионные липосомы при физиологических условиях (рН 7/ 0.15 М NaCl) возможно при доле катионного липида в мембране более 0.1. С помощью МТТ-теста была исследована цитотоксичность КМЦД, заполненных биологически активными соединениями (БАС)- куркумином и фолиевой кислотой, катионных липосом их комплексов на клетках карциномы молочной железы. Варьирование доли ДОТАП в мембране липосом показало, что ни сами липосомы, ни комплекс КМЦД/липосомы не обладают цитотоксичностью вплоть до максимальных исследованных концентраций – 2мг/мл, внезависимости от доли ДОТАП. Включение во внутреннюю полость КМЦД БАС не влияет ни на цитотоксичность КМЦД, ни на цитотоксичность формируемых комплексов. Методом атомно-силовой микроскопии было установлено, что строение межфазного комплекса КМЦД/ липидная мембрана на основе ДОТАП/ДОФХ не зависит от доли катионного липида в мембране. Нарушение целостности мембран катионных липосом при взаимодействии с КМЦД было исследовано методом кондуктометрии. Было установлено, что адсорбция КМЦД на катионную мембрану ДОТАП/ДОФХ липосом приводит к формированию дефектов липидном бислое, а следовательно, помимо электростатического взаимодействия в системе наблюдаются взаимодействия некулоновской природы. Также формирование дефектов следует учитывать при разработке систем доставки, где внутренний объём липосомы рассматривается как резервуар для инкапсулирования гидрофильных соединений Методом атомно-силовой микроскопии было установлено, что строение межфазного комплекса КМЦД/ липидная мембрана на основе ДОТАП/ДОФХ не зависит от доли катионного липида в мембране. Визуализация адсорбции комплексов КМЦД/липосомы на биомиметические мембраны была осуществлена комбинацией методов оптической и флуоресцентной микроскопии. С этой целью биомиметические мембраны готовили на основе планарных бислоёв на, в роли которой был использован латекс размером 2 мкм. К суспензии двухмикронного латекса концентрации 2 мг/мл добавляли суспензию анионных ДОФГ/ДОФХ липосом концентрации 2.5 мг/мл и интенсивно перемешивали на вортексе в течение 30 мин. Липосомы, адсорбируясь на поверхность латекса разрушаются, формируя покрытие из липидного бислоя (ЛПБ). Для визуализации использовали ДОТАП/ДОФХ липосомы с v = 0.15, содержавшие 0.1 вес.% ДОФЕ-Пирен. Аликвоту суспензии объёмом 10 мкл наносили на предметное стекло и анализировали. Изображения микросфер получали в оптическом и флуоресцентном канале микроскопа (при УФ-фильтре возбуждения флуоресценции). Для суспензии ЛПБ в оптический канал были видны микрочастицы латекса со средним диаметром 2 микрон, в то время как во флуоресцентном канале не наблюдалось сигналов (чёрный фон). Затем к суспензии ЛПБ добавляли суспензию комплекса КМЦД/липосом с v = 0.15, в котором количество КМЦД составляло 25% от необходимого для формирования насыщенного комплекса. После перемешивания аликвоту 10 мкл наносили на предметное стекло и анализировали под микроскопом. Из-за своего размера и малой оптической плотности липосомы не могли быть обнаружены в оптическом канале микроскопа – изображение представляло собою фигуры идентичные исходной суспензии ЛПБ. На снимке этой же области в флуоресцентном режиме микроскопа было обнаружено свечение синего цвета на всей поверхности сферических частиц, отражающее присутствие меченных ДОФЕ-пирен объектов, т.е. комплексов КМЦД/липосомы, адсорбированных на ЛПБ. Ферментативный гидролиз катионных липосом v = 0.3, их комплексов с КМЦД, а также с КМЦД с включёнными БАС исследовали методом кондуктометрии. Для этого по описанной выше методике были получены липосомы, заполненные 1 М раствором NaCl. В качестве фермента была использована Липаза II из поджелудочной железы свиньи. Добавление к суспензии 0.5 мг/мл липосом фермента до итоговой концентрации 0.15 мг/мл в начале не приводило к значительному изменению электропроводности системы. Электропроводность не практически не менялась в течение 110 мин, далее наблюдался прогрессивный рост электропроводности, соответствовавший началу разрушения мембран липосом, полное высвобождение соли было зарегистрировано через 250 мин. При этом в контрольном образце, не содержавшем фермента, электропроводность не менялась в ходе данного временного интервала. Наличие индукционного периода на кондуктометрической кривой не является отражением отсутствия ферментативного гидролиза, поскольку на начальном этапе гидролиз липидов может не приводить к нарушению целостности мембран. Но для удобства сравнения были зафиксированы времена начала вытекания соли, как характеристические величины. Добавление фермента к насыщенному комплексу КМЦД/липосомы привело к увеличению времени индукционного периода, предшествовавшего нарушению целостности липидного бислоя. Этот результат может быть вызван как фактором стерического затруднения взаимодействия фермента с липидной мембраной комплекса, так и взаимодействием фермента с КМЦД. Для того, чтобы прояснить, что является определяющим фактором был сформирован комплекс КМЦД, насыщенный куркумином / липосомы. Профили кондуктометрических кривых ферментативного гидролиза комплексов, сформированных как незаполненными КМЦД, так и их комплексами с куркумином, практически совпадали. Таким образом, стерический фактор является определяющим при ферментативном гидролизе комплексов КМЦД/катионные липосомы. Было изучено взаимодействие КМЦД с липосомами при рН 5. Добавление к ДОТАП/ДОФХ липосомам с v =0.3 раствора КМЦД в ацетатном буфере с рН 5 и 0.15 М NaCl не привело к изменению значения ЭФП для суспензии. По-видимому, этот факт обусловлен тем, что в данных условиях количество диссоциированных карбоксильных групп в КМЦД пренебрежительно мало и не обеспечивает электростатической адсорбции на поверхность катионных липосом. Таким образом, формирование наноконтейнеров на основе ансамблей карбоксиметил циклодекстринов, адсорбированных на поверхности катионных липосом следует осуществлять в электронейтральной среде. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | project_report_gost.pdf | project_report_gost.pdf | 57,9 КБ | 18 декабря 2022 [sybachin] |