ИСТИНА

В результате выполнения данного проекта мы ожидаем ввести в научный обиход молекулярно-динамические модели регуляторной единицы тонкой нити сердечной мышцы для оценки молекулярных механизмов действия кардиомиопатических мутаций регуляторных белков тонкой (актиновой) нити. Регуляторная единица состоит из фрагмента актиновой нити и комплексов регуляторных белков тропонина и тропомиозина, расположенных на противоположных сторонах актиновой спирали. Будут построены уточнённые модели регуляторной единицы в нескольких функциональных состояниях, соответствующих различным уровням её активации ионами кальция. Эти модели будут верифицированы сравнением результатов МД расчётов с экспериментальными данными, полученными в опытах по измерению изгибной жёсткости тонких нитей с помощью управляемой оптической ловушки, и с рентгенодифракционными оценками угловой подвижности тропонин-тропомиозинового тяжа на поверхности актина. Предсказательная сила модели будет проверена на примере двойной мутации G126R/D137L в тропомиозине, влияние которой на структурные и регуляторные свойства тонких нитей хорошо изучено in vitro. Будет проведена апробация модели на некоторых недавно обнаруженных мутациях в структуре тропонина и тропомиозина, клиническая значимость которых не установлена.

Genetic cardiomyopathies associated with hereditary or de novo mutations of the regulatory proteins of the thin (actin) filaments of cardiac muscle: tropomyosin and troponin are very dangerous socially significant diseases. With advances in sequencing techniques and the development of genetic testing, the number of mutations found in these proteins is rapidly increasing. However, clinical and genetic data are often insufficient to assess clinical significance, i.e. pathogenicity of such mutations. Assessing the significance of cardiomyopathic mutations is important for their inclusion in the genetic testing program, timely diagnosis, and early treatment initiation. A possible approach to elucidating the molecular mechanisms of the effects of cardiomyopathic mutations is molecular dynamics (MD) modeling, which can reveal how a particular mutation affects the structural and dynamic characteristics of the altered protein and its interaction with partner proteins. Thus, MD modeling can help to understand how this mutation changes the characteristics of calcium regulation of cardiac muscle contraction, which are often associated with the pathogenicity of such mutations. Attempts to use MD modeling to study the molecular mechanisms of action of cardiomyopathic mutations have been undertaken in the past by several research groups, including the applicants of this project. However, the reliability of the results of this approach was limited by the absence of atomic structures of the entire regulatory unit of the thin filament of cardiac muscle sarcomeres formed by actin, tropomyosin, and troponin. This structure regulates the contraction-relaxation cycle when the concentration of calcium ions in the myocardial cell changes. The first such structures of a reconstructed thin filament in the absence and presence of calcium were published only in 2020, and the structures of native thin filaments at a calcium ion concentration corresponding to its systolic level were solved in 2021. In this project, we plan to use the recently published structures of the regulatory unit for the development of MD models of the regulatory unit of the fine thread of the heart muscle in various functional states. Due to the relatively low resolution of electron density maps obtained in cryo-electron-microscopic experiments, the existing atomic structures must be refined for performing MD calculations. The MD models themselves must be verified by comparing the results of MD calculations with the available experimental data. To test the performance of the developed models, we plan to conduct MD modeling of the effect of some mutations: the well-studied double amino acid substitution G126R / D137L in Tpm and four recently discovered mutations in Tpm and Tn of the heart muscle, the clinical significance of which has not been established. Based on the results of MD modeling of the effect of these mutations on the structural and dynamic characteristics of a thin filament, we plan to test the predictive power of the proposed approach by comparing it with the data of various experiments with G126R/D137L-tropomyosin, and also to determine the possible molecular mechanisms of the effect of new mutations on the regulatory properties of thin filaments of cardiac muscle to evaluate their pathogenicity.

Для верификации описания динамических характеристик системы мы предполагаем сравнить результаты МД моделирования с имеющимися у нас рентгенодифракционными данными. Эти данные представляют собой распределение интенсивности малоугловой рентгеновской дифракции вдоль актиновый слоевых линий. Ранее мы показали, что высокоугловая часть распределения интенсивности на первой и второй актиновой словых линиях А1 и А2 (~36 и 18 нм, соответственно) определяется средним положением и угловыми флуктуациями Tpm на поверхности актиновой нити, а интенсивность актиновых слоевых линий А6 и А7 (~5.9 и 5.1 нм, соответственно) в отсутствие миозиновых головок, присоединенных к актину, практически полностью определяется актином (Koubassova et al., 2017). Рентгенодифракционные данные были получены нами с коллегами на волокнах скелетной мышцы на Европейском источнике синхротронного излучения в отсутствие ионов кальция, т.е. в расслабленном состоянии мышцы и при насыщающей концентрации кальция в присутствии 10 мМ 2,3-бутанедион-моноксима (BDM), который препятствует прочному связыванию миозиновых головок с актином, что позволяет минимизировать вклад миозина в интенсивность актиновых слоевых линий. Среднее угловое положение Tpm-Tn тяжа на актиновой нити регуляторной единицы и его среднеквадратическое отклонение будут определены из анализа МД траекторий и сравнены с результатами оценки этих величин по результатам количественного анализа слоевых линий А1, А2, А6 и А7 на дифракционных рентгенограммах с помощью прямого математического моделирования. Наконец, для проверки предсказательной силы предлагаемого подхода мы планируем провести МД моделирование регуляторной единицы тонкой нити с хорошо изученной in vitro двойной мутацией G126R/D137L в Tpm и сравнить результаты этих расчётов с экспериментальными данными (Matyushenko et al., 2014, 2015; Nabiev et al., 2015; Shchepkin et al., 2017).

Коллектив заявителей имеет многолетний опыт исследований биофизики мышечного сокращения, в том числе опыт МД моделирования одного из регуляторных белков скелетной и сердечной мышц, тропомиозина (Tpm). Параллельно с экспериментальными исследованиями коллег из ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологий» РАН и Института иммунологии и физиологии УрО РАН мы изучили влияния ряда мутаций и посттрансляционных модификаций Tpm на его динамические свойства. В ходе этой работы были разработаны и реализованы алгоритмы оценки изгибной жёсткости молекулы Tpm по результатам МД моделирования, которые предполагается использовать и в рамках предлагаемого проекта. Было показано, что образование дисульфидной связи между консервативными остатками Cys190 двух цепей димера Tpm приводит к увеличению изгибной жёсткости молекулы Tpm при 27 оС, но не при 40 оС [1]. Эти данные хорошо согласуются с результатами экспериментальных исследований и позволяют понять, как образование дисульфидной связи между двумя цепями Tpm может участвовать в патогенезе сердечной недостаточности. Ранее было показано, что в нормально функционирующих скелетных и сердечных мышцах остатки Cys190 находятся в восстановленной форме, но при сердечной недостаточности между ними образуется связь.

В результате выполнения проекта мы ожидаем разработать и верифицировать МД модели регуляторной единицы тонкой нити для оценки молекулярных механизмов действия кардиомиопатических мутаций регуляторных белков миокарда – тропонина и тропомиозина и выявить структурные и динамические изменения, вызываемые некоторыми недавно обнаруженными мутациями в тропонине-I и тропомиозине. В случае успешного выполнения проекта будет разработана in silico технология оценки молекулярных механизмов действия кардиомиопатических мутаций на структурные и регуляторные свойства тонкой нити и оценки клинической значимости вновь обнаруженных мутаций.