ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИПМех РАН |
||
Проект направлен на решение фундаментальной задачи, связанной с исследованием молекулярных механизмов эволюционных процессов, ведущих к появлению в геноме новых генов и формированию новых генных сетей.
The project is aimed at solving a fundamental problem related to the study of the molecular mechanisms of evolutionary processes leading to the appearance of new genes in the genome and the formation of new gene networks. The most important sources of new components of the genome are mobile elements, which can occupy more than half of the nucleotide sequence of the genome of higher eukaryotes, as well as viruses, mainly retroviruses, whose life cycle includes the obligatory integration of a DNA copy into the host genome. Among the mobile component of the genome, a special place is occupied by retroelements, which are similar in their mechanisms of integration into the genome with retroviruses. By integrating into the genome, both the sequences of retroviruses and the sequences of retroelements remain there forever, either degrading or undergoing selection. The process of positive selection aimed at preserving certain sequences of mobile elements and retroviruses in the host genome is commonly called molecular domestication. In the course of domestication, the sequences can be preserved entirely or undergo changes that contribute to a change in function and the emergence of new adaptations in the organism. There are many examples of evolutionary transformations of the sequences of mobile elements and retroviruses that led to the emergence of new regulatory gene sequences, as well as a number of examples of molecular domestication of key retroelement genes (gag, pol, env). The most famous case of env gene domestication is syncytins, which are necessary for the placenta to function and determine the formation of syncytiotrophoblast. Most examples of gag domestication are described in vertebrates, in particular in mammals, in which many domesticated gag genes have been transformed into transcription factors that regulate practically all known biological processes - proliferation, differentiation and programmed cell death, embryogenesis, metabolism, inflammation reactions, etc. Drosophila is a model for studying the molecular processes associated with the evolution of sequences of retroelements and retroviruses in the host genome, since, firstly, in the genome of the most studied species, Drosopila melanogaster, two domesticated retroelement genes - Gagr (a homolog of the gag gene of retroelements, discovered in our laboratory) and Iris (homologue of env retroelements); secondly, to date, the genomes of more than 20 species of Drosophila and dozens of other insect species have been sequenced, which makes it possible to effectively identify the evolutionary transformations of domesticated genes by comparative genomic analysis. According to bioinformatics analysis, the Gagr gene was domesticated in the ancestors of Hemiptera and insects with complete transformation. Protein products of the Gagr gene of its homologues in different Drosophila species have a highly conserved structure, but, despite this, gene inactivation does not lead to visible changes in the phenotype. Nevertheless, according to the data of large-scale proteomic analysis and according to the data obtained in our and other laboratories, the Gagr gene in D. melanogaster is a component of the protein complex involved in the stress response. The specific task to be solved by this project is the study of evolutionary processes that led to the formation of a new function in the domesticated gag gene and its tissue-specific adaptation to the participation of the stress response in Drosophila. The data obtained in this work will contribute to expanding the understanding of the role of molecular domestication in the formation of new genetic networks involved in the stress response in insects. Studies on a model object can be useful for extrapolation to other types of insects (hymenoptera, beetles, lepidoptera) of agricultural importance.
Будет получена линия D.melanogaster с нокдауном гена Gagr, и будут проведены исследования морфо-физиологических характеристик мутантных самцов и самок на стандартной среде и в условиях стресса, индуцированного несколькими стрессорами (менадионом, парактватом, персульфатом аммония) – измерение продолжительности жизни, измерение физиологических характеристик (плодовитость, двигательная активность). Будут секвенированы и проанализированы транскриптомы самцов и самок D.melanogaster с нокдауном гена Gagr. Будут выявлены гены с дифференциальной экспрессией, регулируемой в ответ на стресс, вызванный персульфатом аммония. Планируется выявить половой диморфизм ответа на стресс. По результатам анализа транскриптомов будет составлена панель стресс-индуцируемых генов, которую можно будет использовать в дальнейшем анализе мух с нокдауном гена Gagr в отдельных тканях. Будет осуществлена верификация панели методом ОТ-ПЦР. Будут подобраны сублетальные концентрации персульфата аммония, менадиона и параквата для разных видов (D.mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura, D. virilis, D. funebris) отдельно для самцов и самок и изучено влияние персульфата аммония на продолжительность жизни у разных видов дрозофил. Будет проведено сравнение стресс-индуцированных изменений в экспрессии гена Gagr в ответ на персультфат аммония в сравнение с D.melanogaster. Будет проведен анализ транскрипции гомологов гена Gagr у видов дрозофил в ответ на персультфат аммония в сравнении с D.melanogaster и сделаны выводы об значимости обнаруженных изменений в 5’-регуляторной области гена Gagr у разных видов дрозофил с выраженностью ответа на стрессовое воздействие. Будет проведен биоинформатический анализ гомологичных комплексов Gagr и его партнеров (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687) у видов с жесткокрылых, полужесткокрылых, перепончатокрылых, чешуекрылых с секвенированными геномами, будут сделаны выводы об особенностях организации комплекса у насекомых и возможности экстраполяции полученных на дрозофиле данных на другие виды насекомых (перепончатокрылые, жуки, чешуекрылые), имеющих сельскохозяйственное значение.
Обнаружен и охарактеризован ген Gagr— геномный гомолог гена gag ДКП-ретротранспозонов, появившийся в геноме дрозофилы в результате молекулярной доместикации (Nefedova et al., 2014). Для него изучена тканевая и онтогенетическая специфичность экспрессии, показано наличия белкового продукта, было исследовано изменение его экспрессии в ответ на различные внешние воздействия, при этом обнаружена индукция его экспрессии в ответ на введение некоторых патогенов, а также при наличии активно перемещающейся копии эндогенного ретровируса gypsy (Makhnovskii et.al. 2016; Nefedova, Kim, 2018). Выявлено, что ген Gagr есть у всех видов Drosophila, его структура высококонсервативна, что свидетельствует о действии на ген стабилизирующего отбора и о важной функции гена. Показано, что белок Gagr имеет трансмембранную локализацию, которая также появилась у Sophophora в процессе эволюции (Nefedova et al., 2014). В ходе биоинформатического анализа обнаружено, что промоторная область гена Gagr содержит мотив связывания с транскрипционным фактором kayak консервативен у видов рода Drosophila, а мотив связывания со Stat92E появляется у только подгруппы melanogaster (Makhnovskii et al., 2020). Показано, что стресс, вызванный персульфатом аммония, приводит к значительной активации транскрипции гена Gagr у имаго D. melanogaster в тканях каркаса, уровень этой активации зависит от предъявления стрессового фактора и снижается в короткий период восстановления. Изоформа транскрипта Gagr-A наиболее представлена в базальных условиях и играет основную роль в изменении экспрессии Gagr в ответ на стрессовый фактор (Makhnovskii et al., 2020).
Будет получена линия D.melanogaster с нокдауном гена Gagr, и будут проведены исследования морфо-физиологических характеристик мутантных самцов и самок на стандартной среде и в условиях стресса, индуцированного несколькими стрессорами (менадионом, парактватом, персульфатом аммония) – измерение продолжительности жизни, измерение физиологических характеристик (плодовитость, двигательная активность). Будут секвенированы и проанализированы транскриптомы самцов и самок D.melanogaster с нокдауном гена Gagr. Будут выявлены гены с дифференциальной экспрессией, регулируемой в ответ на стресс, вызванный персульфатом аммония. Планируется выявить половой диморфизм ответа на стресс. По результатам анализа транскриптомов будет составлена панель стресс-индуцируемых генов, которую можно будет использовать в дальнейшем анализе мух с нокдауном гена Gagr в отдельных тканях. Будет осуществлена верификация панели методом ОТ-ПЦР. Будут подобраны сублетальные концентрации персульфата аммония, менадиона и параквата для разных видов (D.mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura, D. virilis, D. funebris) отдельно для самцов и самок и изучено влияние персульфата аммония на продолжительность жизни у разных видов дрозофил. Будет проведено сравнение стресс-индуцированных изменений в экспрессии гена Gagr в ответ на персульфат аммония в сравнение с D.melanogaster. Будет проведен анализ транскрипции гомологов гена Gagr у видов дрозофил в ответ на персульфат аммония в сравнении с D.melanogaster и сделаны выводы об значимости обнаруженных изменений в 5’-регуляторной области гена Gagr у разных видов дрозофил с выраженностью ответа на стрессовое воздействие. Будет проведен биоинформатический анализ гомологичных комплексов Gagr и его партнеров (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687) у видов с жесткокрылых, полужесткокрылых, перепончатокрылых, чешуекрылых с секвенированными геномами, будут сделаны выводы об особенностях организации комплекса у насекомых и возможности экстраполяции полученных на дрозофиле данных на другие виды насекомых (перепончатокрылые, жуки, чешуекрылые), имеющих сельскохозяйственное значение. Будут получены пять трансгенных линий с выключением гена Gagr в отдельных тканях (нервной системе, генеративных тканях, жировом теле, задней кишке, эмбриональных клетках). Будут изучены морфофизиологические характеристики мутантов (продолжительности жизни, плодовитость, двигательная активность). Будет проведен анализ транскрипции панели стресс-чувствительных генов и генов-партнеров Gag в целых мухах и отдельных тканях с целью выявления значимости экспрессии гена Gagr в исследуемых тканях. Будут подведены итоги работы и подготовлено 3 публикации в журнале WoS/Scopus.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Молекулярная доместикация ретровирусного гена gag и его роль в функционировании генной сети стрессового ответа у Drosophila |
Результаты этапа: Получена линия D.melanogaster с нокдауном гена Gagr, и проведены исследования морфо-физиологических характеристик мутантных самцов и самок на стандартной среде и в условиях стресса, индуцированного персульфатом аммония – измерение продолжительности жизни, измерение физиологических характеристик (плодовитость, двигательная активность). Показано, что инактивация гена Gagr не влияет на жизнеспособность мух в стандартных условиях культивирования. В условия стресса, вызванного персульфатом аммония, жизнеспособность мух с инактивированным геном Gagr снижается. Таким образом, ген Gagr задействован в стрессовом ответе. Инактивация гена Gagr приводит к устойчивости мух к тепловому шоку, а в стандартных условиях – к более высокой скорости развития и к увеличению скорости передвижения личинок, что связано с повышением экспрессии гена теплового шока hsp22. Таким образом, ген Gagr участвует в поддержании клеточного гомеостаза, и его роль более значима на стадии имаго. Секвенированы транскриптомы D.melanogaster с нокдауном гена Gagr у мух, подвергшихся окислительному стрессу, вызванному персульфатом аммония. Получено 10 библиотек из как из целых мух, так и отдельно из тканей кишечника, в котором, по предварительным данным, наблюдается наиболее высокий уровень активности гена Gagr. Проведен первый этап секвенирования, ведется анализ данных. Подобраны сублетальные концентрации персульфата аммония для разных видов (D.mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura). Изучено влияние окислительного стресса, вызванного персульфатом аммония, на жизнеспособность различных видов рода Drosophila (D. melanogaster, D. mauritiana, D. simulans, D. yakuba, D. teissieri, D. pseudoobscura), проведен анализ корреляции структуры промоторных областей и стресс-индуцированных изменений в экспрессии гена Gagr и его гомологов у разных видов дрозофил, а также сравнение стресс-индуцированных изменений в экспрессии генов-маркеров окислительного стресса: активатора сигнального пути Jak-STAT upd3, эффектора пути Jak-STAT vir-1 и мишени сигнального пути IMD Rel. Обнаружено, что у D. simulans и D. mauritiana чувствительность к персульфату аммония существенно повышена, что коррелирует со сниженным уровнем транскрипции ортологов гена vir-1. Последнее обусловлено уменьшением в промоторной области ортологов vir-1 у D. simulans и D. mauritiana числа сайтов связывания транскрипционного фактора STAT92Е, компонента сигнального пути Jak-STAT. Согласованные изменения экспрессии гена Gagr, upd3, vir-1, наблюдаются у всех видов подгруппы melanogaster, кроме D. pseudoobscura, что свидетельствует о возрастании роли Gagr в регуляции путей стрессового ответа в ходе филогенеза рода Drosophila. Для белка Gagr обнаружены следующие белковые партнеры — продукты генов 14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687, четыре из которых (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013) имеют высококонсервативные функции у эукариот. Мы предприняли попытку провести функциональный анализ белкового продукта гена Gagr в составе комплекса с его партнерами, проследить пути эволюции комплекса у насекомых и обсудить возможную роль в этом комплексе доместицированного гена ретроэлементов. Проведен биоинформатический анализ гомологичных комплексов Gagr и его партнеров (14-3-3epsilon, Pdi, eIF3j, CG6013, CG3687) в геномах эукариот. В исследуемом комплексе взаимодействующих белков D.melanogaster можно выделить две консервативные пары: Pdi–14-3-3e и CG6013–eIF3j. Все эти белки объединяет их совместная локализация в ЭПР. Физическое взаимодействие между CG6013 (гомолог CCDC124) и EIF3j было показано только для дрозофилы. По-видимому, наиболее консервативным компонентом исследуемой системы взаимодействующих белков является комплекс белков CCDC124 и eIF3j. Вместе с ТФ они образуют сигнальный путь, способный влиять на функционирование рибосом на всех этапах – от созревания до терминации трансляции. На пути эволюции от дрожжей до млекопитающих к консервативной паре CCDC124–eIF3j добавляются новые партнеры из других сигнальных путей, а также адаптеры, позволяющие локализовать компоненты получившегося мультибелкового комплекса на мембранах или внутри органелл. У разных таксонов животных этот процесс происходил независимо, так что состав и характер взаимодействия компонентов в рамках комплекса у них различны. В ходе филогенеза рода Drosophila гены Gagr и CG3687 подверглись значительным изменениям: усложнилась регуляция Gagr, а его белковый продукт приобрел трансмембранный домен; продукт гена CG3687 приобрел новую C-концевую регуляторную последовательность. Результатами этих преобразований стало включение этих генов в сигнальный пути, управляемого стрессовыми каскадами, активирующими клеточную пролиферацию. Gagr, очевидно, направляет или координирует стресс-индуцируемую неканоническую активацию трансляции, возможно образуя стресс-индуцируемый комплекс ЭПР-направленного трансляционного перепрограммирования. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Молекулярная доместикация ретровирусного гена gag и его роль в функционировании генной сети стрессового ответа у Drosophila |
Результаты этапа: Центральной задачей проекта стало проведение секвенирования и анализ транскриптомов особей Drosophila melanogaster c нокдауном гена Gagr. Ген Gagr в геноме Drosophila melanogaster возник в результате молекулярной доместикации гена gag ретротранспозонов/ретровирусов. У всех видов дрозофилы гомологи белка Gagr обладают высококонсервативной структурой, что указывает на значимую роль этого гена. Самцов и самок с нокдауном гена Gagr во всех тканях сравнивали с контрольными мухами в физиологических тестах и экспериментах по секвенированию РНК. Продолжительность жизни мух с нокдауном гена Gagr была снижена по сравнению с контрольными мухами. Кроме того, согласно анализу транскриптома, у нокдаун-мух Gagr наблюдался повышенный уровень транскрипции генов иммунного ответа. Для создания стресса мы использовали персульфат аммония, мощный индуктор стресса. Показано, что у контрольных мух персульфат аммония вызывал активацию сигнальных путей Toll, JAK/STAT и JNK/MAPK. Напротив, у мух с нокдауном гена Gagr наблюдалась низкая экспрессия генов реакции на стресс. Анализ обогащения Gene Ontology молекулярной функции для генов, активируемых при стрессе персульфата аммония у контрольных мух, но не у мух, нокдаун Gagr, выявил категорию генов, участвующих в контроле развития, морфогенеза и функционирования центральной нервной системы. Ранее было показано, что наиболее высокий уровень транскрипции гена Gagr наблюдается в кишечнике, причем транскрипция наиболее эффективно индуцируется у самок в ответ на добавление в корм персульфата аммония. Поэтому был изучен транскриптом кишечника самок с нокдауном гена Gagr во всех тканях в стандартных условиях и в условиях стресса, вызванного персульфатом аммония. Выявлено, что у самок с нокдауном гена Gagr в кишечнике активированы гены анимикробных пептидов, контролируемых сигнальными путями Toll и Imd. Индукция стрессового ответа персульфатом аммония выявила нарушение работы сигнальных путей JAK/STAT и Jnk/MAPK и практически полное отсутствие активации работы путей ответа на стресс эндоплазматического ретикулума и несвернутых белков у особей с нокдауном гена Gagr. Полученные данные демонстрируют важность Gagr в поддержании как иммунного ответа, так и гомеостаза в организме, и подтверждает важную роль гена Gagr в поддержании гомеостаза и в иммунном ответе в тканях кишечника. В результате анализа транскриптомов выбрана таргетная панель генов для дальнейшего использования при исследовании транскриптомного ответа мух с тканеспецифичным нокдауном Gagr. Индукцию окислительного стресса в наших экспериментах проводили с использованием АПС. АПС ранее не использовался до этого для индукции окислительного стресса. Поэтому мы валидировали его как индуктор окислительного стресса. В ходе молекулярно-генетических исследований мы выявили, что персульфат аммония индуцирует сильный окислительный стресс, что выражается в индукции экспрессии генов, отвечающих на окислительный стресс. По сравнению с другими окислительными агентами (менадион, паракват и борная кислота) АПС оказался самым эффективным индуктором экспрессии гена Gagr. Детекцию активных форм кислорода (АФК) осуществляли методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием циклических гидроксиламинов в качестве «ловушек». Для оценки окислительного статуса среды использовали 1-Hydroxy-4-isobutyramido-2,2,6,6-tetramethylpiperidinium chloride (TMT-H), относящийся к группе циклических гидроксиламинов и обладающий низкой способностью проникать через липидный бислой. Показано, что АПС действительно вызывает достоверное накопление АФК в мухах, т.е. действует как индуктор окислительного стресса. Поскольку ген Gagr является гомологом гена gag LTR-ретротранспозонов, мы проанализировали, как изменяется транскрипционная активность родственных Gagr ретротранспозонов в ответ на АПС. Известно, что транскрипция мобильных элементов может активироваться в ответ на стресс, однако литературные данные достаточно противоречивы. Мы использовали RT-PCR для изучения транскрипционного профиля LTR-ретротранспозонов и кластеров piRNA в ответ на окислительный стресс. Для исследования геномного окружения новых инсерций ретротранспозонов использовали нанопоровое секвенирование. Чтобы найти сайты связывания стресс-индуцированных транскрипционных факторов в LTR-ретротранспозонах, использовали методы биоинформатики. Изучена транспозиционная активность и уровень транскрипции LTR-ретротранспозонов в ответ на окислительный стресс, оценен вклад различных факторов, которые могут влиять на увеличение их экспрессии в условиях стресса: состояние система piРНК- интерференции, влияние геномного окружения на отдельные копии и наличие сайтов связывания стресс-индуцированных транскрипционных факторов в последовательностях ретротранспозонов. Показано, что основной причиной активации LTR-ретротранспозонов в условиях стресса является наличие в их регуляторных последовательностях сайтов связывания транскрипционных факторов, которые запускаются в ответ на стресс и необходимы для процессов регенерации тканей. Таким образом, активация мобильных элементов, вызванная стрессом, может действовать как триггерный механизм, запуская множество сигнальных путей и приводя к поливариантному клеточному ответу. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|