![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИПМех РАН |
||
Целью данного проекта является синтез и скрининг биологической активности новых производных спирооксиндола, содержащих фармакофорные группы, необходимые для связывания с белками, выполняющими ключевую функцию в регуляции апоптоза - с MDM2/MDMX и тубулином. Таким образом, целью проекта будет являться синтез новых спирооксиндолов и производных диазобициклононана, потенциально сочетающих противораковые свойства с другими благоприятными при данной терапии эффектами - анальгетическим и противовоспалительным и проведение первичного доклинического скрининга их биологической активности.
The aim of this project is the synthesis and screening of the biological activity of new spirooxindole derivatives containing pharmacophore groups necessary for binding to proteins that perform a key function in the regulation of apoptosis - MDM2/MDMX and tubulin. Thus, the goal of the project will be the synthesis of new spirooxindoles, potentially combining anticancer properties with other effects favorable for this therapy - analgesic and anti-inflammatory, and conducting a primary preclinical screening of their biological activity.
Предполагается использовать методологию [3+2] циклоприсоединения для создания новых производных спирооксиндолов,сочетающих противоопухолевые и антиокислительные свойства. Таким образом предполагается получить новые конформационно ограниченные низкомолекулярные ингибиторы белок-белковых взаимодействий, вызывающие гибель раковых клеток посредством апоптоза: ингибиторы взаимодействия p53-MDM2\MDMX и соединения, нарушающие процесс полимеризации тубулина. Молекула спирооксиндола является удобной платформой для целевых модификаций и, благодаря введению дополнительных функций, позволяет существенно улучшить не только антиокислительные свойства и связанные с ними противовоспалительные свойства, но и растворимость полученных производных в воде, что важно при создании лекарственных форм.
Авторским коллективом было впервые показано, что простейшие алкокси-содержащие цис-2,4,5-триарилимидазолины являются аналогами нутлина, причем замена хлора на алкокси-группу не приводит к потере способности ингибировать MDM2-р53 взаимодействие и вызывать апоптоз раковых клеток, не провоцируя при этом их некроз. В дальнейшем исследовании было показано, что ведение сульфонильной группы позволило значительно повысить растворимость цис-имидазолинов с сохранением их цитотоксичности. Биологическую активность полученных сульфонил-содержащих имидазолинов изучали методом Вестерн-блоттинга на линиях раковых клеток A549, RKO и SH-SY5Y. Было показано, что производные способны ингибировать взаимодействие MDM2 / MDMX-p53, способствовать стабилизации p53 и индуцировать экспрессию p21 в концентрациях от 0,5 мкМ. Ранее коллективом были получены упрощенные структуры на основе адамантановых и 8-оксабицикло [3.2.1]октановых каркасов, содержащие фармакофорные части паклитаксела и элеутеробина. Показано,что данные соединения в микромолярных концентрациях выбранные аналоги влияли на динамику тубулина in vitro и в живом организме и были цитотоксичными в отношении линий опухолевых клеток человека.Для преодоления метаболической нестабильности противоракового соединения 2-метоксиэстрадиола были синтезированы дихлорацетилированные пролекарства на его основе и оценена их биологическая активность in vitro на штаммах раковых клеток A549 и MCF-7. Авторским коллективом также ранее велись разработки в области химии арилиденоксиндолов, являющихся исходными соединениями для синтеза целевых спирооксиндолов.
Проведено молекулярное моделирования связывания ряда спирооксиндолов с активными сайтами белков MDM2 и MDMX. Выявлены структурные различия белков MDM2 и MDMX, которые делают сайт связывания в MDMX меньшим по размеру и менее подходящим для спирооксиндольных лигандов. Продемонстрирована возможность введения дополнительного заместителя в спирооксиндол, располагающегося таким образом, чтобы быть направленным из сайта связывания наружу, и не оказывать принципиального влияния на ключевые связывания спирооксиндольного каркаса с белком. Таким образом, это положение может быть использовано для дополнительной функционализации молекулы, например, для увеличения ее водорастворимости или введения групп, обеспечивающих таргетное действие по отношению к раковым клеткам. Показана возможность замены атомов Hal в оксиндольном каркасе на метокси-группу без потери аффинности к MDM2. Таким образом, в результате молекулярного моделирования были выявлены основные направления модификаций, которые могут привести к значительному повышению растворимости целевых соединений в воде при сохранении их целевой активности. Был проведен поиск новых мультиориентированных соединений, сочетающих в себе противораковые свойства с антиоксидантными и обладающие повышенной растворимостью в воде, что важно при разработке лекарственных препаратов с повышенной биодоступностью. Был разработан протокол конструирования молекул с заданной стереохимией с пошаговым разносторонним изучением активности собранного фрагмента на каждом шаге, задающем конфигурацию фармакофорных групп. Одним из таких ключевых шагов, определяющих пространственное расположение важных для связывания с белками групп, является сборка арилиденоксиндолов определенной конфигурации. Нами был разработан критерий, позволяющий на основании спектроскопии ядерного магнитного резонанса определять конфигурацию двойной связи в арилиденоксиндолах. Показано, что эта конфигурация определяется расположением заместителей в оксиндольном кольце: при наличии групп в положении 4 преимущественно образуется Z-изомер, в то время как в случае заместителей в положениях 5 и 6 оксиндольного цикла преобладает транс-конфигурация двойной связи. Среди 6-замещенных арилиденоксиндолов выявлены соединения, обладающие цитотоксичностью, превышающей активность цисплатина в сочетании со способностью ингибировать перекисное окисление липидов. Предварительное изучение возможного механизма их противоракового действия показало, что соединения, содержащие заместитель в положении 6 оксиндольного цикла, не влияют на активность фермента хинон оксидоредуктаза II, однако способны нарушать процессы сборки микротрубочек. Активность 5-замещенных арилиденоксиндолов также была изучена нами совместно с ВолгГМУ. Нами было впервые показано, что 3-арилиденпроизводные оксиндола они могут являться ингибиторами человеческой NRH:хиноноксидоредуктазы (NQO2). Было установлено, что наличие двойной связи необходимо для целевой активности. Наиболее активные соединения также содержат ОН-группу в арилиденовой части. Добавление ациламино- или карбамоиламиногруппы может увеличить ингибирующую активность соединения, но наиболее значительный эффект вызывает добавление метильной группы к амидному азоту оксиндольного кольца. Выявлены соединения, проявляющие ингибирующую активность по отношению к NQO2 с IC50 около 0,3 μM. Таким образом, можно предположить, что цитотоксичное действие 6-замещенных арилиденоксиндолов в первую очередь связано с их влиянием на полимеризацию тубулина. Поскольку для раковых клеток характерно быстрое деление, в котором участвует тубулин, нарушение динамического равновесия полимеризации-деполимеризации тубулина приводит к тому, что деление раковой клетки оказывается заторможенным в одной из фаз митоза. Это приводит либо к остановке деления клетки, либо к запуску механизма апоптоза. Еще одной потенциальной мишенью при терапии рака является фермент киназа гликогенсинтазы 3 бета. Этот фермент задействован в большом количестве сигнальных путей и процессов, поэтому изучение разностороннего влияния ее ингибиторов на организм является важной задачей при поиске новых противораковых препаратов. Для производных арилиденоксиндолов, проявляющих ингибирующую активность по отношению к киназе гликогенсинтазы 3 бета, была изучена их способность уменьшать тромбообразование. Совместно с коллегами из ВолгГМУ нами были найдены соединения, обладающие выраженным антикоагуляционным эффектом, превышающим эффект аспирина как in vitro, так и in vivo. Наибольший эффект показало соединение, являющееся наномолярным ингибитором киназы гликозенсинтазы 3 бета (IC50 4 нМ), которое превосходит активность аспирина на крысиной модели индуцированного тромбоза в 18,7 раз. С использованием синтезированных нами арилиденоксиндолов разработан препаративный метод синтеза новых энантиомерно чистых производных спирооксиндолов с использованием хирального вспомогательного агента в реакции диполярного присоединения. Показано, что наличие алкокси-групп в ароматических кольцах арилиденоксиндолов негативно сказывается на их реакционной способности в реакциях диполярного присоединения. Как основной спирооксиндольный каркас для дальнейшей модификации были выбраны оптически активные производные, обладающие способностью ингибировать МДМ2-р53 взаимодействие в наномолярном диапазоне и вызывать апоптоз в раковых клетках, но при этом плохо растворимое в воде, что затрудняет его применение в клинической практике. Было опробовано два подхода к модификации подобных молекул и предложена оптимальная схема, позволяющая получать целевые структуры в энантиомерно чистом виде. Было проведено две модификации данного каркаса, позволяющие вводить как фрагмент, значительно увеличивающий растворимость в воде, так и фрагмент, обладающий свойствами лиганда простат-специфичного мембранного антигена (PSMA), который не только значительно увеличивает растворимость спирооксиндола в воде, но и должен увеличивать селективность соединения по отношению к клеткам рака простаты в сравнении со здоровыми клетками. Предварительное тестирование показало, что данные соединения обладают повышенной растворимостью как в органических растворителях, так и в воде в сравнении с исходным немодифицированным спирооксиндолом.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 22 марта 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Новые производные спирооксиндолов как привилегированные структуры для мишень- ориентированного дизайна лекарств |
Результаты этапа: Проведено молекулярное моделирования связывания ряда спирооксиндолов с активными сайтами белков MDM2 и MDMX. Выявлены структурные различия белков MDM2 и MDMX, которые делают сайт связывания в MDMX меньшим по размеру и менее подходящим для спирооксиндольных лигандов. Продемонстрирована возможность введения дополнительного заместителя в спирооксиндол, располагающегося таким образом, чтобы быть направленным из сайта связывания наружу, и не оказывать принципиального влияния на ключевые связывания спирооксиндольного каркаса с белком. Таким образом, это положение может быть использовано для дополнительной функционализации молекулы, например, для увеличения ее водорастворимости или введения групп, обеспечивающих таргетное действие по отношению к раковым клеткам. Показана возможность замены атомов Hal в оксиндольном каркасе на метокси-группу без потери аффинности к MDM2. Таким образом, в результате молекулярного моделирования были выявлены основные направления модификаций, которые могут привести к значительному повышению растворимости целевых соединений в воде при сохранении их целевой активности. Проведен синтез серии арилиденоксиндолов, которые могут служить прекурсорами для дальнейшего синтеза целевых спирооксиндолов. Особое внимание уделялось соединениям, содержащим галогеновые и алкокси-заместители. Конденсация оксиндолов с различными ароматическими альдегидами проводилась путем кипячения в этаноле в присутствии пиперидина. В данной реакции 3-арилиден-2-оксиндолы часто были выделены в виде смесей изомеров в различных соотношениях. Нами определены ЯМР-критерии для соотнесения Е/Z изомеров в различных производных. Так, для 4'-замещенных бензилиден-2-оксиндолов в спектрах ПМР химический сдвиг 2'(6') протонов бензилиденового фрагмента в спектрах ЯМР 1H резко различается для E- и Z-изомеров, находясь в диапазоне 7,45-7,84 и 7,85-8,53 м.д. соответственно. В спектрах 3-(пиридин-2-илметилиден)замещенных производных оксиндола нами впервые была обнаружена аналогичная тенденция. В случае E-изомера сигнал ЯМР 1H, который принадлежит протону H4 оксиндольного ядра, имеет значительный сдвиг в слабое поле из-за деэкранирования соседним пиридиновым азотом. Таким образом, характеристичными сигналами для производных (Е)-3-(пиридин-2-илметилиден)-2-оксиндола оказалась пара дублетов (сигналы Н4 и пиридинового Н3’), расположенная в слабом поле. В отличие от 6-членных гетероциклов, для которых было выявлено преобладание Е-изомера, в случае производных пиразола преобладающим является Z-изомер, что было подтверждено NOE экспериментом. Таким образом, в ходе проделанной работы нами были выявлены удобные критерии соотнесения E/Z изомеров в спектрах разнообразных 2-арилиденоксиндолов. Это является важным достижением, т.к. конфигурация целевых спирооксиндолов определяется именно конфигурацией изначального арилиденоксиндола. Известно, что 3-арилиден-2-оксиндолы могут служить ингибиторами различных киназ, таких как тирозинкиназа, CDK2, GSK3β и благодаря этому также активировать апоптоз и выступать в роли противораковых препаратов. Кроме того, известно, что экспрессия фермента NRH:хинон оксидоредуктазы 2 (NQO2) повышена в некоторых линиях раковых клеток. Поскольку 3-арилиден-2-оксиндолы обладают широким спектром активности по отношению к различным ферментам, задействованным в патогенезе рака, было интересно изучить, обладают ли такие структуры дополнительной активностью и в отношении NQO2. Важно отметить, что роль NQO2 в патогенезе рака до сих пор до конца не известна. Сообщалось, например, что активность NQO2 способствовала пролиферации раковых клеток A549 и H1299 и образованию метастаз рака предстательной железы LNCaP-C4-2B, а также косвенно влияла на активацию NF-kB, что приводило к подавление клеточного апоптоза и защиту раковых клеток от химиотерапии, поэтому ингибиторы NQO2 считались потенциальными противораковыми препаратами. В то же время из-за высокой экспрессии в раковых клетках NQO2 может использоваться как активатор противоопухолевых пролекарств, высвобождая из них биологически активное вещество и может действовать как эндогенный супрессор рака. Поэтому выявление новых ингибиторов NQO2 могло бы помочь прояснить роль этого фермента в патогенезе рака. Одним из эндогенных лигандов фермента хинонредуктазы 2 является гормон мелатонин и его синтетический аналог MCA-NAT, который интенсивно исследовался в качестве потенциального противоракового препарата. Ранее нами было показано, что производные 2-оксиндола могут действовать как ингибиторы NQO2 и связываться с активным сайтом NQO2 аналогично мелатонину В случае производных оксиндола, содержащих дополнительную арилиденовую группу, имеется возможность усиления стэкинговых взаимодействий π-π с кофактором FAD в активном центре фермента, поэтому нами было выдвинуто предположение, что полученные структуры могут быть еще более эффективными лигандами NQO2 Активность полученных производных была изучена in vitro совместно с ВолгГМУ. Нами было впервые показано, что 3-арилиденпроизводные оксиндола они могут являться ингибиторами человеческой NRH:хиноноксидоредуктазы (NQO2). Было установлено, что наличие двойной связи необходимо для целевой активности. Наиболее активные соединения также содержат ОН-группу в арилиденовой части. Добавление ациламино- или карбамоиламиногруппы может увеличить ингибирующую активность соединения, но наиболее значительный эффект вызывает добавление метильной группы к амидному азоту оксиндольного кольца. Выявлены соединения, проявляющие ингибирующую активность по отношению к NQO2 с IC50 около 0,3 μM. Цитотоксичность полученных 3-арилиден-2-оксиндолов была изучена по отношению к клеточной линии А549, поскольку известно, что в ней повышен уровень экспрессии NQO2. Выявлен ряд оксиндолов, обладающих умеренным цитотоксическим действием в микромолярном диапазоне концентраций, при этом корреляции между ингибирующей активностью по отношению к NQO2 и влиянием на жизнеспособность клеток не установлено. Предложены два подхода к синтезу труднодоступных 6-замещенных оксиндолов, содержащих галоген- и метокси-группы. Выявлены ограничения для обоих методов. Проведена модельная реакция синтеза спирооксиндола, содержащего алкокси и галогеновые заместители, на основе полученных 3-арилиденпроизводных. | ||
2 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Новые производные спирооксиндолов как привилегированные структуры для мишень- ориентированного дизайна лекарств |
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в 2023 году были синтезированы новые производные оксиндолов, содержащие группы, увеличивающие их растворимость в воде, и проведено изучение их противораковой активности на каждом ключевом этапе синтеза. Одним из ключевых этапов синтеза спирооксиндолов является синтез 3-арилиден-2-оксиндолов, т.к. именно на этом этапе впервые задается стереохимическая конфигурация и вводятся ключевые фармакофорные группы. Поэтому нами были синтезированы и подробно изучены 3-арилиденоксиндолы с различным типом замещения, в частности, изучен их изомерный состав и биологическая активность. Показано, что для арилиденоксиндолов, содержащих заместители в положениях 5 или 6 индольного цикла, основным изомером является Е-изомер, в то время как для 4-замещенных производных преобладает Z-конфигурация двойной связи. Среди 6-замещенных арилиденоксиндолов выявлены соединения, обладающие цитотоксичностью, превышающей активность цисплатина (0.36 мкМ против 4,4 мкМ у цисплатина) и небольшим антиоксидантным эффектом. Предварительное изучение возможного механизма их противоракового действия показало, что данные соединения не влияют на активность фермента хинон оксидоредуктаза II, однако способны нарушать процессы сборки микротрубочек. Таким образом, можно предположить, что цитотоксичное действие данных соединений отчасти связано с их влиянием на полимеризацию тубулина. Еще одной потенциальной мишенью при терапии рака является фермент киназа гликогенсинтазы 3 бета. Этот фермент задействован в большом количестве сигнальных путей и процессов, поэтому изучение разностороннего влияния ее ингибиторов на организм является важной задачей при поиске новых противораковых препаратов Для производных арилиденоксиндолов, синтезированных нами ранее и проявляющих ингибирующую активность по отношению к этому ферменту, была изучена их способность уменьшать тромбообразование. Были найдены соединения, обладающие выраженным антикоагуляционным эффектом, превышающим эффект аспирина как in vitro, так и in vivo. Наибольший эффект показало соединение, являющееся наномолярным ингибитором киназы гликозенсинтазы 3 бета (IC50 4 нМ), которое превосходит активность аспирина на крысиной модели индуцированного тромбоза в 18,7 раз. Разработан препаративный метод синтеза новых энантиомерно чистых производных спирооксиндолов с использованием хирального вспомогательного агента в реакции диполярного присоединения. Показано, что наличие алкокси-групп в ароматических кольцах арилиденоксиндолов негативно сказывается на их реакционной способности в реакциях диполярного присоединения. Как основы спирооксиндольного каркаса для дальнейшей модификации были выбраны оптически активные производные, обладающие способностью ингибировать МДМ2-р53 взаимодействие в наномолярном диапазоне и вызывать апоптоз в раковых клетках, но при этом плохо растворимое в воде, что затрудняет его применение в клинической практике. Было опробовано два подхода к модификации подобных молекул и предложена оптимальная схема, позволяющая получать целевые структуры в энантиомерно чистом виде. Было проведено две модификации данного каркаса, позволяющие вводить как фрагмент, значительно увеличивающий растворимость в воде, так и фрагмент, обладающий свойствами лиганда простат-специфичного мембранного антигена (PSMA), который не только значительно увеличивает растворимость спирооксиндола в воде, но и должен увеличивать селективность соединения по отношению к клеткам рака простаты в сравнении со здоровыми клетками. Предварительное тестирование показало, что данные соединения обладают повышенной растворимостью как в органических растворителях, так и в воде в сравнении с исходным немодифицированным спирооксиндолом. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".