ИСТИНА

Разработка линейки радиофармацевтических препаратов (РФП) на основе ингибиторов простатического специфического мембранного антигена (ПСМА) для диагностики рака предстательной железы с использованием технологий ядерной медицины.

The project is aimed at creating highly specific conjugates of PSMA ligands with chelating agents and obtaining diagnostic RFPs with 68Ga isotopes for prostate cancer diagnosis. The diagnostic radiopharmaceutical conjugates obtained as a result of the work should compete with radiopharmaceuticals that are at various stages of research. Subsequently, the developed molecules could provide both the Russian and the world market with new promising radiopharmaceuticals for diagnostics.

В результате выполнения проекта будут предложены 1-2 координационных соединения для диагностики рака предстательной железы, перспективные для дальнейших доклинических исследований. Кроме того, будут даны рекомендации для последующего синтеза и оптимизации второго поколения конъюгатов хелатирующих агентов с лигандами ПСМА. Также будут оценены возможности применения полученных лигандов ПСМА с хелатирующими агентами для терапевтического применения с изотопами 177Lu.

Научным коллективом в течение последних 5 лет разрабатываются синтетические подходы к различным ПСМА-селективным лигандам и терапевтическим/диагностическим конъюгатам на их основе. Была получена серия таких лигандов, и проведено исследование их аффинности к ПСМА in vitro на основе ингибирования реакции расщепления N-ацетил-аспартил глутамата. По полученным результатам, выделены наиболее перспективные структурные мотивы лигандов ПСМА, обеспечивающие высокую аффинность к данному рецептору. На их основе получены терапевтические конъюгаты с доцетакселом и монометилауристатином Е. Также были получены диагностические конъюгат с флуоресцентными метками FAM-5, Sulfo-Cy5 и Sulfo-Cy7. Накопление меченого конъюгата в клетках показано на трех клеточных линиях: PC-3 (ПСМА «-»), 22Rv1 (ПСМА «+»), LnCap (ПСМА «+») с использованием проточной цитофлуорометрии. Для ряда терапевтических и диагностических конъюгатов был проведен полный цикл доклинических испытаний. По результатам данной работы был получено 5 патентов. В настоящий момент уже получена пробная серия конъюгатов с хелатирующим агентом DOTA. Для данных конъюгатов проведены первичные in vitro испытания с целью оценки их эффективности.

Была наработана библиотека из более 25 новых, ранее неописанных лигандов ПСМА, которые были исследованы на предмет их аффинности путем ингибирования реакции N-ацетиласпартил глутамата на клеточной линии LNCaP. Наилучшие лиганды ПСМА продемонстрировали аффинность 1,5-7 нМ. Далее была получена полная библиотека конъюгатов с хелатирующим агентом DOTA из 20 конъюгатов (с ранее выбранной серией заместителей дипептидные цепочки: 1) L-Phe-L-Tyr(3-NO2); 2) L-Tyr-L-Tyr; 3) L-Phe-L-Phe; 4) L-Phe-L-Tyr; 5) L-Phe-L-Phe(4-Br); вектор-молекулы мочевины, содержащие в ароматическом фрагменте при атоме азота лизина следующие заместители: 1) м-Cl, 2) п-Br, 3) п-COOH 4) о-NO2.). Также получено 4 конъюгата аналога конъюгата-лидера (PKA-49) со структурной заменой хелатирующего агента DOTA на DTPA, NODA-GA и DOTA-GA. А также 3 различных конъюгата с хелатирующим агентом p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA, в том числе аналог PKA-49. Также были опробованы подходы к синтузу молекулы-стандарта PSMA-617 и его аналогов с заменой хелатора DOTA на DOTAGA и H4BATA, которые так же были получены в рамках работ. На примере одного из азидо-лигандов осуществлен синтез конъюгата, с производным биспидина, содержащего алкиновый фрагмент, за счёт реакции азид-алкинового циклоприсоединения. Конъюгаты с производными биспидинов могут выступать в качестве хелатирующих фрагментов для радиоизотопов Cu2+ (например, 64Cu или 67Cu) На примере амино-лиганда ПСМА, содержащего м-Cl бензильный фрагмент и дипептидный фрагментй L-Phe-L-Phe был опробован подход введения радиоизотопов иода с помощью применения фрагмента SnBu3 в п- или м- положении бензойной кислоты. В дальнейшем группа SnBu3 замещалась на 123I с помощью иодида натрия [123I]NaI. В результате было получено 27 новых конъюгатов c различными хелатирующими агентами, а также 2 конъюгата- производных Bu3Sn-п/м-бензойных кислот, для возможного радиомечения и последующего исследования как потенциальных средств для терапии или диагностики опухолей предстательной железы. In vitro исследование аффинности радиоконъюгатов Ga-68 с новыми лигандами и PSMA-617 к рецепторам проводили на клетках линии LNCaP. Наибольшие накопления активности показали Ga-меченные конъюгаты BNS-26, PKA-32 и PKA-49 – максимум 3,72±0,23%, 2,77±0,72% и 2,70±0,69% через 90, 30 и 60 минут инкубирования, соответственно. Оценка биологического распределения на in vivo моделях была оценена на модели опухолей LNCaP (ПСМА+). Среди исследованных конъюгатов можно выделить тройку конъюгатов-лидеров: PKA-49, BNS-26 и PKA-30. PKA-49 и PKA-30 имеют сопоставимое накопление в почках и в опухоли, однако PKA-30 имеет побочное неспецифическое накопление в желудке и крови, при этом у него один из самых высоких показателей накопления в опухоли. PKA-41 имеет самые высокие значения накопления в опухолевой ткани, но также имеет высокие показатели накопления по всему организму (в почках, слюнных железах, желудке и мочевом пузыре), что свидетельствует о меньшей специфичности данной структуры в условиях in vivo. Таким образом, среди соединений, которые были исследованы in vitro и in vivo наибольшего внимания заслуживают конъюгаты PKA-49, BNS-26 и PKA-30 хелатирующего агента DOTA. Данные молекулы также обладают удовлетворительными физико-химическими параметрами, а также отсутствием выраженной цитотоксичности. Наиболее приоритетной молекулой для дальнейших исследований является конъюгат PKA-49 Образцы PKA-70, 71 и PKA-66 являются аналогами PKA-49, с хелатирующими агентами NODA-GA, DTPA и Bn-CHX-A"-DTPA, они были использованы для синтеза радиоконъюгатов с Ga-68 для проведения исследований по рецептор-специфичному связыванию in vitro и изучению фармакокинетики и функциональной пригодности на иммунодефицитных мышах в перевитыми опухолями предстательной железы. РХЧ исследуемых образцов составило >95%. Анализ биораспределения и фармакокинетики комплексов 68Ga показал, что из всех исследованных препаратов наиболее медленно из крови выводились конъюгаты PKA-70 и PKA-71 – их эффективный период полувыведения оказался в 2-3 раза больше, чем для остальных конъюгатов. При этом наименьший период полувыведения из почек фиксировали у PKA-49, при самом высоком количестве радиоактивных распадов в опухолевой ткани, что, несомненно, сыграет позитивную роль в визуализации рака предстательной железы. Однако число радиоактивных распадов в почках для PKA-49 оставалось одним из самых высоких среди других препаратов. Наиболее низкие значения объема распределения в опухоли одновременно с наиболее высокими в почках отмечали у PKA-66, что делает его перспективным наряду с PKA-49 для визуализации рака предстательной железы. Таким образом, наиболее перспективными РФЛП с точки зрения исследования фармакокинетических параметров являются конъюгаты 68Ga-PKA-49 и PKA-66. Все полученные лиганды/конъюгаты для биологических испытаний были охарактеризованы основными методами физико-химического анализа (ЯМР 1H, 13C, HRMS, для подтверждения чистоты ВЭЖХ-МС). В результате были установлены соотношения структура-активность между строением линкера и вектор-молекулы и биологической активностью получаемых лигандов/конъюгатов ПСМА. Было проведено мечение изотопом тербия 161Tb 4 конъюгатов с хелатирующим агентом DOTA. Синтезированы 5 комплексов 161Tb с конъюгатами, включая конъюгат сравнения PSMA-617. Комплексы показали высокую стабильность в изотоническом растворе и растворах биогенных катионов, однако демонстрируют разную степень стабильности в фетальной телячьей сыворотке. Выделен комплекс-лидер (161Tb-m-Cl-DCL-L-Phe-L-Tyr-DOTA), показавший наибольшую (более 90%) стабильность, который может стать основой для дальнейших исследований и разработки РФП на его основе с радиоизотопом 161Tb. Были получены радиоконъюгаты Lu-177 с новыми лигандами — [177Lu]Lu-PKA-32, [177Lu]Lu-PKA-49 в сравнении с [177Lu]Lu-PSMA-617. Для всех образцов РХЧ составляла более 95%. Для оценки возможности применения новых лигандов для терапии онкологических заболеваний был выполнен сравнительных эксперимент на иммунодефицитных мышах с перевитыми опухолями предстательной железы линии CT-26-PSMA. В группе PSMA-617 на 29-й день ТРО составил 61,57%, что указывает на эффективное торможение роста опухоли, в группе PKA-49 ТРО составил 50,12%, а в группе PKA-32 – 24,81%. Результаты исследований торможения роста ксенографта опухоли in vivo радиоконъюгатов с Lu-177 показали значительное влияние на динамику роста опухолей. Наибольшая эффективность достигается при применении препаратов на основе PSMA-617 (молекула сравнения) и PKA-49). Таким образом, в результате синтеза и исследования новых радифоармацевтических конъюгатов было показано, что наиболее перспективными для дальнейшей разработки и оптимизации структуры наиболее перспективны диагностичекие конъюгаты 68Ga-PKA-49 и 68Ga-PKA-66. В качестве потенциальных терапевтических конъюгатов 177Lu-PKA-49 и 161Tb-m-Cl-DCL-L-Phe-L-Tyr-DOTA